氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒在制備腫瘤血管阻斷劑中的應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒在制備腫瘤血管阻斷劑中的應(yīng)用，屬于納米生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前癌癥已經(jīng)成為繼心血管疾病之后，威脅人類生存健康的第二大殺手。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都依賴血管網(wǎng)的存在，腫瘤血管是癌細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)通道和轉(zhuǎn)移途徑。通過(guò)選擇性破壞已形成的腫瘤血管網(wǎng)快速切斷腫瘤血供，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生缺血壞死，是一種切實(shí)有效的抑制腫瘤生長(zhǎng)，阻止轉(zhuǎn)移的方法，這個(gè)概念由Juliana Denekamp于1982年提出，相應(yīng)的藥物稱為血管阻斷劑(Vascular disrupting agents，VDAs)。其它任何直接攻擊腫瘤細(xì)胞的方法，在很大程度上只能暫時(shí)緩解病情，復(fù)發(fā)很難避免，這也是目前手術(shù)、放化療的局限所在。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，正常血管需要一年時(shí)間才能夠長(zhǎng)成，是由內(nèi)膜、中膜和外膜構(gòu)成的三層密實(shí)結(jié)構(gòu)，而腫瘤血管只用4天即可形成，結(jié)構(gòu)上為由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的單層薄膜。而由于構(gòu)成腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大、結(jié)構(gòu)不完整，導(dǎo)致腫瘤血管通常包含有大量納米尺度的小孔，使小分子和一些納米顆粒能夠透孔而出。腫瘤血管阻斷劑正是利用了腫瘤血管和正常血管的差異，目前有抗體和小分子兩類。例如，3G4抗體Tarvacin通過(guò)結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的磷脂酰絲氨酸殺傷胰腺癌細(xì)胞。小分子血管阻斷劑又分為微管解聚物和黃酮兩類藥物，微管解聚物通過(guò)結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞微管蛋白β亞基的秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致微管解聚、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白分離，進(jìn)而破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架。秋水仙堿和鬼臼毒素就是經(jīng)典的微管解聚藥物。

由于腫瘤血管較正常組織血管有很大不同，腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大、結(jié)構(gòu)不完整，導(dǎo)致腫瘤血管通常包含有大量納米尺度的小孔，由于腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))，納米顆粒能嵌入這些小孔破壞腫瘤血管，從而導(dǎo)入腫瘤內(nèi)部大量出血，切斷了腫瘤組織的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)而抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。血管阻斷劑已經(jīng)成為目前腫瘤血管靶向治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，隨著科學(xué)研究的不斷發(fā)展，其必將進(jìn)入臨床應(yīng)用，成為腫瘤治療的突破性技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒在制備腫瘤血管阻斷劑中的應(yīng)用，本發(fā)明氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒應(yīng)用于制備腫瘤血管阻斷劑中，其制備的腫瘤血管阻斷劑生物安全性更高，對(duì)正常生物組織無(wú)毒副作用，用于治療的效果好。

本發(fā)明提供的氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒在制備腫瘤血管阻斷劑中的應(yīng)用；

所述氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒的結(jié)構(gòu)通式為metallofullerene-(OH)_x(Amino Acid)_y；

其中，metallofullerene為金屬富勒烯；

0≤x<50；0≤y<20；

Amino Acid為水溶性氨基酸。

上述的應(yīng)用中，所述金屬富勒烯包括；M@C_2n、M₂@C_2n、MA@C_2n、M₃N@C_2n、M₂C₂@C_2n、M₂S@C_2n、M₂O@C_2n和M_mA_3-mN@C_2n中的至少一種；其中，M、A均為金屬元素，所述M、A均選自Sc、Y和鑭系金屬元素中的至少一種，30≤n≤60，0≤m≤3，且n、m均為整數(shù)；

所述水溶性氨基酸為丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、精氨酸、賴氨酸和天門氨酸中的至少一種。

本發(fā)明中，鑭系金屬元素為鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、钷(Pm)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、镥(Lu)；

所述稀土金屬具體可為Gd，所述金屬富勒烯具體可為Gd@C₈₂、Gd₃N@C₈₀。

上述的應(yīng)用中，所述納米顆粒的水合直徑可為1～1000nm，具體可為100-150nm。

上述的應(yīng)用中，制備所述氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒包括如下步驟：將所述水溶性氨基酸的堿溶液與金屬富勒烯混合，進(jìn)行親核加成反應(yīng)，即得到所述氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒；

所述水溶性氨基酸的堿溶液中堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可為10～50％，具體可為14％、10～14％、14～50％或11～25％；所述堿具體可為氫氧化鈉；

所述水溶性氨基酸與所述金屬富勒烯的摩爾比可為1～100：1。

上述的應(yīng)用中，所述親核加成反應(yīng)的溫度可為50～100℃，具體可為50℃；所述親核加成反應(yīng)的時(shí)間可為1～30h，具體可為1.5h、1～1.5h、1.5～7h或1～5h；

所述制備方法中，在所述親核加成反應(yīng)之后還包括過(guò)濾除去雜質(zhì)的步驟。

本發(fā)明還提供了一種腫瘤血管阻斷劑，該腫瘤血管阻斷劑的活性成分為所述氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒。

上述的腫瘤血管阻斷劑中，所述腫瘤血管阻斷劑的劑型為藥學(xué)可接受的劑型。

上述的腫瘤血管阻斷劑中，當(dāng)所述腫瘤血管阻斷劑的劑型為注射劑時(shí)，其溶劑為水、生理鹽水、PBS緩沖液和Tris-HCl溶液中的至少一種；所述生理鹽水的濃度具體可為0.85～0.90％；PBS緩沖液的濃度具體可為0.01～0.1mol/L，PBS緩沖液組成的組分具體可為Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和KCl；Tris-HCl溶液的濃度具體可為0.05mol/L；

所述水溶性氨基酸修飾的金屬富勒烯納米材料的濃度可為0.5～10mmol/L，具體可為1mmol/L、0.5～1mmol/L、1～10mmol/L或0.5～5mmol/L。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種高效阻斷腫瘤血管的腫瘤治療方法，包括如下步驟：1)向患腫瘤生物體給予有效劑量的所述腫瘤血管阻斷劑；

2)用與所述水溶性氨基酸富勒烯納米材料相匹配的輻射能量源對(duì)所述患腫瘤生物體的腫瘤部位進(jìn)行射頻輻照。

上述的腫瘤治療方法中，所述腫瘤為肝癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、膽管癌、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、腦膜瘤、皮膚癌、黑色素瘤和肉瘤中的至少一種；

所述腫瘤血管阻斷劑的給藥量可為1mg/kg～100mg/kg，具體可為2mg/kg；具體的所述患腫瘤生物體總給藥量按照所述荷瘤生物體的體重進(jìn)行換算；

所述藥物的給藥方式采用靜脈注射、腹腔注射、口服和局部給藥中的至少一種；

所述射頻輻照的頻率可為1～1000MHz，具體可為200MHz、1～200MHz、200～1000MHz或50～500MHz，發(fā)射功率為1mW～10kW，具體可為5mW、1mW～5mW、5mW～10kW或1mW～100mW，所述輻照的時(shí)間可為10min～2h，具體可為30min、10min～30min、30min～2h或20min～1h；

所述患腫瘤生物體為哺乳動(dòng)物；具體可為人、鼠、兔、豬、猴和狗中的至少一種。

本發(fā)明中，所述有效劑量是指當(dāng)通過(guò)本發(fā)明的方法給予所述藥物時(shí)，足以有效傳遞用于治療腫瘤的活性成分的量。

本發(fā)明中，注射所述藥物在0～1h后進(jìn)行所述輻照；具體可為10min～2h。

本發(fā)明在抗腫瘤治療中，通過(guò)將藥物注射入生物體后，通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)腫瘤部位，隨后施加射頻輻照，使腫瘤部位的納米顆粒在血管中發(fā)揮作用，達(dá)到快速治療腫瘤的目的；由于腫瘤血管較正常組織血管有很大不同，腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大、結(jié)構(gòu)不完整，導(dǎo)致腫瘤血管通常包含有大量納米尺度的小孔，由于腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))，金屬富勒烯納米顆粒能嵌入這些小孔破壞腫瘤血管，阻斷血流，切斷了腫瘤組織的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)而抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。

本發(fā)明還提供了一種高效阻斷腫瘤血管的腫瘤的套裝，該套裝包括所述腫瘤血管阻斷劑和產(chǎn)生輻射能量源的設(shè)備。

上述的套裝中，所述產(chǎn)生輻射能量源的設(shè)備發(fā)射的頻率為所使用的射頻源輻照的頻率可為1～1000MHz，發(fā)射功率可為1mW-10kW，生物體吸收的輻照的功率可為1～1000mW，射頻輻照源可為脈沖模式。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明借助穿透性很強(qiáng)的射頻作用，不受腫瘤在生物體分布的限制，即可治療生物體表附近的腫瘤，也可治療生物體深部器官或組織的腫瘤。

2、本發(fā)明針對(duì)腫瘤血管和正常血管的差異，特異性阻斷腫瘤血管治療腫瘤，從而具有廣譜性。

3、本發(fā)明中氨基酸修飾的金屬富勒烯碳籠完整性更強(qiáng)，生物安全性更高，對(duì)正常生物組織無(wú)毒副作用。

4、與目前臨床普遍使用的環(huán)磷酰胺、紫杉醇等比較，本發(fā)明腫瘤血管阻斷劑給藥劑量小，毒性低，單次治療就能達(dá)到高抑瘤率；相比于同類金屬富勒醇藥物，本發(fā)明腫瘤血管阻斷劑在其基礎(chǔ)上更加降低了給藥劑量，以及給藥后射頻照射時(shí)間更短，治療速度更快，療效高。

附圖說(shuō)明

圖1、本發(fā)明實(shí)施例1中制備得到的Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆(簡(jiǎn)寫為GF-Ala)熱重分析及微商熱重分析曲線。

圖2、本發(fā)明實(shí)施例2水溶性羥基修飾的Gd@C₈₂納米顆粒(簡(jiǎn)寫為GF-OH)的熱重分析及微商熱重分析曲線。

圖3、GF-Ala及GF-OH兩種藥物的磁化曲線及磁化強(qiáng)度-溫度曲線。

圖4、GF-Ala及GF-OH兩種藥物的高分辨原子力顯微鏡圖片。

圖5、GF-Ala及GF-OH兩種藥物的熒光猝滅擬合曲線，由此計(jì)算可得兩種藥物的蛋白結(jié)合率，其中F₀是不加富勒烯時(shí)蛋白的熒光，F(xiàn)是加富勒烯后蛋白的熒光，Q是富勒烯濃度。

圖6、GF-Ala及GF-OH兩種藥物在pH＝7時(shí)的平均水合半徑和Zeta電勢(shì)比較。

圖7、本發(fā)明實(shí)施例2中GF-Ala藥物在治療前、治療后及治療后24h的磁共振成像圖片。

圖8、本發(fā)明實(shí)施例2中兩種藥物的抑瘤率比較，在長(zhǎng)期觀察12天期間，小鼠腫瘤在不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤狀態(tài)變化，以及12天后小鼠的腫瘤體積和重量對(duì)比。

圖9、本發(fā)明實(shí)施例2中兩種藥物在治療后24h后腫瘤血管的環(huán)境掃描照片(其中a為GF-Ala加射頻，b為a的局部放大圖，c為GF-OH加射頻，d為GF-Ala不加射頻，e為生理鹽水加射頻，f為只注射生理鹽水)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中，水溶性羥基修飾的Gd@C₈₂納米顆粒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式為Gd@C₈₂(OH)₂₆(簡(jiǎn)寫為GF-OH)，其制備方法參照文獻(xiàn)Carbon，2013,65,175。

實(shí)施例1、金屬富勒烯丙氨酸納米顆粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆的制備

把約10mg Gd@C₈₂固體加入10ml單口瓶中，加入6ml NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14％的β-丙氨酸堿溶液(β-丙氨酸與NaOH的摩爾比為1:2)，50℃下劇烈攪拌1.5h，黑色固體逐漸溶解生成棕黑色溶液。過(guò)濾除去未反應(yīng)的少量固體粉末，濾液使用Mw＝3500透析袋透析除去小分子雜質(zhì)，使用220nm微孔濾膜過(guò)濾后得到的棕黑色溶液即為本發(fā)明的氨基酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆(又稱為β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯納米顆粒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式為Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆，簡(jiǎn)寫為GF-Ala)。

表1β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒元素分析結(jié)果

對(duì)本發(fā)明β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯水溶性納米顆粒進(jìn)行元素分析所得碳、氮、氫元素比，如表1所示。由表1可知，根據(jù)熱重曲線分析可以得出原固體粉末中含11.5％的水，經(jīng)過(guò)計(jì)算約為13個(gè)H₂O分子，再結(jié)合元素分析，進(jìn)一步推測(cè)得到該物質(zhì)的平均分子式為Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

如圖1所示為Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆(簡(jiǎn)寫為GF-Ala)熱重分析及微商熱重分析曲線，經(jīng)計(jì)算固體中含11.5％的水份，結(jié)合元素分析中C、H、N含量可推測(cè)平均分子式為Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆。

由圖6和表2可知，本發(fā)明Gd@C₈₂(OH)₁₃(NHCH₂CH₂COOH)₆在pH＝7的水中平均粒徑為127.7nm，Zeta電勢(shì)為-44.7mV。

表2納米顆粒在pH＝7的水中的平均粒徑及Z電勢(shì)

實(shí)施例2、β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯納米顆粒在射頻作用下腫瘤治療及效果對(duì)比

1、建立荷瘤鼠動(dòng)物模型：

選取5周周齡體重在16.0～20.0g的雌性BALB/c小鼠，皮下接種100μL濃度為5×10⁷/ml的H22肝癌細(xì)胞。生長(zhǎng)約5-7天后，腫瘤尺寸達(dá)到50-100mm³進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2、腫瘤治療及不同藥物效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)

對(duì)比藥物：水溶性羥基修飾的Gd@C₈₂納米顆粒，其表面修飾了大量的羥基基團(tuán)，如圖2所示為其熱重分析TGA及DTG曲線，結(jié)合元素分析C、H、N含量(C 36.95％，H 2.36％，N<0.3％)推測(cè)其平均分子式為Gd@C₈₂(OH)₂₆。

通過(guò)尾靜脈注射β-丙氨酸衍生化GF-Ala和羥基化GF-OH這兩種藥物(濃度為1mmol/L，2mg/kg)于荷瘤鼠體內(nèi)，隨后施加射頻(200MHz，5mW)治療30min。分別采集治療前、治療后和治療后24h的T2磁共振成像，并長(zhǎng)期觀察兩種藥物的抑瘤效果。設(shè)置三個(gè)對(duì)照組，分別為只注射生理鹽水(Saline)、注射生理鹽水和施加射頻(Saline+RF)，只注射β-丙氨酸修飾的金屬富勒烯藥物(GF-Ala)。

由圖3可知，經(jīng)測(cè)試計(jì)算本發(fā)明金屬富勒烯氨基酸納米顆粒的有效磁矩為8.9μ，高于同類金屬富勒醇8.5μ；由圖4可知，同時(shí)改變碳籠表面修飾的官能團(tuán)或分子，改善了納米顆粒的分散性和均一性，有利于藥物的穩(wěn)定性；其次其與體內(nèi)蛋白等的親和性也因表面修飾的不同而發(fā)生了變化，根據(jù)熒光猝滅機(jī)理，按照F0/(F0-F)＝1/faKa[Q]+1/fa計(jì)算藥物與蛋白的結(jié)合常數(shù)，如圖5所示，得到本發(fā)明金屬富勒烯氨基酸納米顆粒與蛋白的結(jié)合常數(shù)為0.98×105L·mol^-1，同類金屬富勒醇僅為0.13×105L·mol^-1。由上述實(shí)驗(yàn)證明，使用本發(fā)明所的氨基酸修飾的金屬富勒烯納米顆粒GF-Ala相比于同類金屬富勒醇GF-OH在腫瘤治療中的效果更為優(yōu)異。具體表現(xiàn)為丙氨基酸修飾的金屬富勒烯納米顆粒GF-(Ala)是羥基修飾的金屬富勒烯納米顆粒GF-(OH)的使用劑量的1/5～1/10，可能的原因是改變了金屬富勒烯水溶化制備方法，反應(yīng)條件更為溫和，碳籠表面修飾的官能團(tuán)或小分子更少，碳籠的完整性更強(qiáng)，使得金屬富勒烯納米顆粒的磁性更強(qiáng)。

圖7所示為本發(fā)明GF-Ala藥物在治療前、治療后及治療后24h時(shí)腫瘤部位的T2磁共振成像狀況。從圖7中可以看出，治療后腫瘤中心區(qū)域出現(xiàn)大面積壞死情況，在成像上表現(xiàn)為變黑，治療后24h壞死比例大幅度提高。

圖8為本發(fā)明GF-Ala藥物與GF-OH藥物在同等劑量下長(zhǎng)期抑瘤率的比較。本發(fā)明GF-Ala藥物治療后腫瘤組織呈現(xiàn)明顯的壞死變黑現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)12天的連續(xù)觀察，腫瘤部位幾乎結(jié)痂脫落；而GF-OH藥物相比于對(duì)照組表現(xiàn)出一定的治療效果，其治療后12天時(shí)腫瘤體積和重量約為本發(fā)明GF-Ala藥物的兩倍。

圖9為本發(fā)明GF-Ala藥物、GF-OH藥物及對(duì)照組在治療后24h時(shí)腫瘤血管的環(huán)境掃描照片。從圖中可以觀察到本發(fā)明GF-Ala藥物在射頻輔助治療后腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)大范圍的脫落，露出血管基膜，說(shuō)明本發(fā)明GF-Ala藥物可以快速靶向摧毀腫瘤血管，切斷腫瘤部位的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。而GF-OH藥物內(nèi)皮細(xì)胞脫落較少，在同等劑量下對(duì)腫瘤血管的攻擊力不如本發(fā)明GF-Ala藥物。