本發(fā)明涉及豬膽粉結(jié)合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸在制備治療支氣管哮喘藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
支氣管哮喘（Bronchial asthma，簡稱哮喘）是常見的慢性呼吸道疾病之一，是由多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)參與的氣道慢性炎癥性疾病。這種慢性炎癥會導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生，通常出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限，并引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，且常在夜間和凌晨發(fā)作。近年來，由于氣候、環(huán)境等的變化，哮喘的發(fā)病率、患病率及死亡率均呈逐年上升趨勢。哮喘嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，并給患者帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，因此該病全球范圍內(nèi)引起了廣泛重視。
目前，糖皮質(zhì)激素、β2受體激動劑、白三稀受體調(diào)節(jié)劑、抗膽堿能藥、IgE抗體等是治療哮喘的主要藥物。然而，由于個體的敏感度不同，仍有部分患者如吸煙者、肥胖哮喘患者和非Th2增高型哮喘患者對上述治療藥物的反應(yīng)較差。
豬膽粉是我國的傳統(tǒng)中藥，具有清熱、潤燥、解毒、止咳平喘等功效，用于熱病燥渴、目赤、喉痹、黃疸、百日咳、哮喘、泄瀉、痢疾、便秘、癰瘡腫毒等癥。豬膽粉結(jié)合型總膽酸中包括?；秦i膽酸（Taurohyocholic acid）、?；秦i去氧膽酸（Taurohyodeoxycholic acid）、?；蛆Z去氧膽酸（Taurochenodeoxycholic acid）、甘氨豬膽酸（Glycohyocholic acid）、甘氨豬去氧膽酸（Glycohyodeoxycholic acid）和甘氨鵝去氧膽酸（Glycochenodeoxycholic acid）。其中，牛磺豬去氧膽酸的含量達到4%以上。
據(jù)發(fā)明人所知，豬膽粉結(jié)合型總膽酸及?；秦i去氧膽酸在制備治療支氣管哮喘藥物中的應(yīng)用，目前還未見報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供豬膽粉結(jié)合型總膽酸和?；秦i去氧膽酸在制備治療支氣管哮喘藥物中的應(yīng)用，涉及一種新用途。
本發(fā)明的實現(xiàn)過程如下：
豬膽粉結(jié)合型總膽酸的制備：取豬膽粉藥材，加入其體積10倍量的質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇，超聲提取使豬膽粉完全溶解，靜置12-14小時，過濾，回收溶劑，得棕黑色浸膏。將柱層析硅膠（100～160目）加入到浸膏中，浸膏與柱層析硅膠的質(zhì)量比為1：2，拌樣，揮干溶劑，研成80目細粉，細粉與中性氧化鋁按質(zhì)量比1：15干法裝于層析柱中，用質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇洗脫，收集洗脫液，用毛細管點樣于硅膠G薄層板上，用展開劑展開后用顯色劑顯色，待薄層板上出現(xiàn)結(jié)合型膽酸斑點時合并洗脫液，至斑點消失時結(jié)束，將收集到的洗脫液減壓回收溶劑，在烘箱內(nèi)80～100℃烘干，得豬膽粉結(jié)合型總膽酸，含量以?；秦i去氧膽酸計在50%以上。
上述的展開劑為乙酸乙酯與甲醇、水、冰醋酸的體積比為10：2：1：0.1的混合溶液，顯色劑為香草醛硫酸試液或乙醇制硫酸試液。
2、牛磺豬去氧膽酸的制備
將上述得到的豬膽粉結(jié)合型總膽酸與柱層析硅膠（100～160目）按質(zhì)量比1：2的比例拌樣，研成80目細粉，細粉與柱層析硅膠（100～160目）按質(zhì)量比1: 25干法裝于層析柱中，經(jīng)反復(fù)柱層析進行分離，以體積比為65：25：10：2的二氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸混合溶劑的下相洗脫，收集洗脫液，用毛細管點樣于硅膠G薄層板上，用展開劑展開后用顯色劑顯色，待薄層板上出現(xiàn)?；秦i去氧膽酸斑點時合并洗脫液，至斑點消失時結(jié)束，將收集到的洗脫液回收溶劑，于丙酮中重結(jié)晶，得牛磺豬去氧膽酸，純度達95%以上。
上述的展開劑為乙酸乙酯與甲醇、水、冰醋酸的體積比為10：2：1：0.1的混合溶液，顯色劑為香草醛硫酸試液或乙醇制硫酸試液。
上述方法制備的豬膽粉結(jié)合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸在制備治療支氣管哮喘藥物中的用途。
有效成分豬膽粉結(jié)合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸制備治療支氣管哮喘的藥物用常規(guī)藥用制劑的形式來使用。所述的常規(guī)藥用制劑含作為活性成分的豬膽粉結(jié)合型總膽酸或牛磺豬去氧膽酸，該活性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于胃腸內(nèi)給藥的有機或無機的固體或液體賦形劑混合。該藥用制劑可以是固體形式如片劑、顆粒劑、膠囊劑；也可以是液體形式如懸浮劑、糖漿劑、灌腸劑等。
上述制劑中可含有輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤濕劑和其它常用的添加劑，如乳糖、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸鎂、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、可可脂、乙二醇、抗壞血酸、甘露醇等。
上述的制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。
采用本發(fā)明得到的豬膽粉結(jié)合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸經(jīng)過治療支氣管哮喘的藥效學(xué)試驗，表明豬膽粉結(jié)合型總膽酸和?；秦i去氧膽酸對哮喘模型小鼠免疫球蛋白、白介素4和白介素13含量升高有抑制作用，顯示豬膽粉結(jié)合型總膽酸和?；秦i去氧膽酸能抑制促炎細胞因子的分泌，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，有效阻斷免疫反應(yīng)性對機體造成的損傷，達到治療目的。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。
實施例1
以豬膽粉100 g為例，豬膽粉結(jié)合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸的制備方法如下：
1.豬膽粉結(jié)合型總膽酸的制備
取豬膽粉藥材100 g，加入其體積10倍量的質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇，超聲提取使豬膽粉完全溶解，靜置12-14小時，過濾，回收溶劑，得棕黑色浸膏。取浸膏5 g，加入100-160目的柱層析硅膠10 g拌樣，揮干溶劑，研成80目細粉，細粉與中性氧化鋁按質(zhì)量比1：15干法裝于層析柱中，用質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇洗脫，收集洗脫液，用毛細管點樣于硅膠G薄層板上，用乙酸乙酯與甲醇、水、冰醋酸的體積比為10：2：1：0.1的混合溶液為展開劑展開，用香草醛硫酸試液顯色，待薄層板上出現(xiàn)結(jié)合型膽酸斑點時合并洗脫液，至斑點消失時結(jié)束。將收集到的洗脫液減壓回收溶劑，在烘箱內(nèi)80～100℃烘干，得豬膽粉結(jié)合型總膽酸，含量以?；秦i去氧膽酸（C26H45O6NS）計在50%以上。
2.?；秦i去氧膽酸的制備
取步驟1中得到的豬膽粉結(jié)合型總膽酸2 g，加入100-160目的柱層析硅膠4 g拌樣，研成80目細粉，細粉與柱層析硅膠（100～160目）按質(zhì)量比1：25干法裝于層析柱中，經(jīng)反復(fù)柱層析進行分離，以體積比為65：25：10：2的二氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸混合溶劑的下相洗脫，收集洗脫液，用毛細管點樣于硅膠G薄層板上，用乙酸乙酯與甲醇、水、冰醋酸的體積比為10：2：1：0.1的混合溶液為展開劑展開，用香草醛硫酸試液顯色，待薄層板上出現(xiàn)?；秦i去氧膽酸斑點時合并洗脫液，至斑點消失時結(jié)束。將收集到的洗脫液回收溶劑，于丙酮中重結(jié)晶，得?；秦i去氧膽酸，純度達95%以上。
實施例2
藥用制劑豬膽粉結(jié)合型總膽酸制備成片劑，以生產(chǎn)片劑1000片為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下：
豬膽粉結(jié)合型總膽酸 50g
糊精 50g
硬脂酸鎂 2g
淀粉 加至300g
其制備方法按制劑學(xué)片劑的常規(guī)方法進行，每片重0.3g，每片含豬膽粉結(jié)合型總膽酸50mg。
藥用制劑?；秦i去氧膽酸制備成片劑，以生產(chǎn)片劑1000片為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下：
?；秦i去氧膽酸 10g
糊精 50g
硬脂酸鎂 2g
淀粉 加至300g
其制備方法按制劑學(xué)片劑的常規(guī)方法進行，每片重0.3g，每片含?；秦i去氧膽酸10mg。
實施例3
藥用制劑豬膽粉結(jié)合型總膽酸制備成膠囊劑，以生產(chǎn)膠囊劑1000粒為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下：
豬膽粉結(jié)合型總膽酸 50g
微晶纖維素 20g
硬脂酸鎂 1g
淀粉 加至300g
其制備方法按制劑學(xué)膠囊劑的常規(guī)方法進行，每粒重0.3g，每粒含豬膽粉結(jié)合型總膽酸50mg。
藥用制劑?；秦i去氧膽酸制備成膠囊劑，以生產(chǎn)膠囊劑1000粒為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下：
牛磺豬去氧膽酸 10g
微晶纖維素 20g
硬脂酸鎂 1g
淀粉 加至300g
其制備方法按制劑學(xué)膠囊劑的常規(guī)方法進行，每粒重0.3g，每粒含?；秦i去氧膽酸10 mg。
實施例4
藥用制劑豬膽粉結(jié)合型總膽酸制備成顆粒劑，以生產(chǎn)顆粒劑產(chǎn)品1000g為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下：
豬膽粉結(jié)合型總膽酸 5g
蔗糖 400g
糊精 加至1000g
制備方法按制劑學(xué)顆粒劑的常規(guī)方法進行，每袋重10g，1g含豬膽粉結(jié)合型總膽酸5 mg。
藥用制劑?；秦i去氧膽酸制備成顆粒劑，以生產(chǎn)顆粒劑產(chǎn)品1000g為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下：
牛磺豬去氧膽酸 1g
蔗糖 400g
糊精 加至1000g
制備方法按制劑學(xué)顆粒劑的常規(guī)方法進行，每袋重10g，1g含?；秦i去氧膽酸1 mg。
實施例5
藥用制劑豬膽粉結(jié)合型總膽酸制備成糖漿劑，以生產(chǎn)糖漿劑1000 mL為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下：
豬膽粉結(jié)合型總膽酸 5g
甜蜜素 10g
蒸餾水 加至1000mL
其制備方法按制劑學(xué)糖漿劑的常規(guī)方法進行，每瓶10mL，1mL含豬膽粉結(jié)合型總膽酸5mg。
藥用制劑?；秦i去氧膽酸制備成糖漿劑，以生產(chǎn)糖漿劑1000 mL為例所用原料和輔料及其質(zhì)量配比如下：
?；秦i去氧膽酸 1g
甜蜜素 10g
蒸餾水 加至1000mL
其制備方法按制劑學(xué)糖漿劑的常規(guī)方法進行，每瓶10mL，1mL含牛磺豬去氧膽酸1 mg。
為了驗證采用本發(fā)明制備的豬膽粉結(jié)合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸的有益效果，發(fā)明人對豬膽粉結(jié)合型總膽酸和?；秦i去氧膽酸進行了治療支氣管哮喘的藥效學(xué)試驗，各種試驗情況如下：
1、實驗藥物
豬膽粉結(jié)合型總膽酸，為黃色至深黃色的固體粉末，味苦，二次重蒸水配制，4℃密閉保存。牛磺豬去氧膽酸，為白色固體粉末，味微苦，二次重蒸水配制，4℃密閉保存。
2、實驗動物
雌性昆明種健康小鼠，體重（22±2）ｇ，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證編號為61001700000563。
3、實驗試劑
卵清蛋白（OVA）試劑購自 Sigma公司，小鼠免疫球蛋白IgE、白介素4（IL-4）和白介素13（IL-13）酶聯(lián)免疫試劑盒購自R&D Systems公司。
4、實驗方法
豬膽粉結(jié)合型總膽酸用二次重蒸水分別配成體積濃度20 mg/ml、10 mg/ml、5 mg/ml 的水溶液，牛磺豬去氧膽酸用二次重蒸水分別配成體積濃度3 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml 的水溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
昆明種健康雌性小鼠，體重（22±2）g，在實驗條件下適應(yīng)1周后，隨機分為8組，即正常對照組、模型組、豬膽粉結(jié)合型總膽酸大、中、小劑量給藥組、?；秦i去氧膽酸大、中、小劑量給藥組，進行試驗。
支氣管哮喘小鼠模型采用OVA制備分為致敏和激發(fā)兩個階段。
致敏階段：正常對照組在小鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水致敏，其余各組小鼠均于實驗第0、7、14天腹腔注射0.2 mL含20 μg OVA和2 mg氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液致敏。
激發(fā)階段：實驗第22、23、24天將除正常對照組外其余各組小鼠置于密閉的有機玻璃箱中，霧化吸入1%（w/v） OVA生理鹽水溶液，每天1次，每次30 min，連續(xù)激發(fā)3天。正常對照組用生理鹽水激發(fā)。
各組小鼠于實驗第18-24天灌胃給藥，每次于霧化前1 小時給藥治療。正常對照組和模型組小鼠分別給予生理鹽水灌胃（20 ml/kg），給藥組豬膽粉結(jié)合型總膽酸按大計量400 mg/kg、中計量200 mg/kg、小劑量100 mg/kg灌胃給藥，給藥組牛磺豬去氧膽酸按大計量60 mg/kg、中計量40 mg/kg、小劑量20 mg/kg灌胃給藥每天一次，持續(xù)七天。末次霧化結(jié)束24小時后，處死小鼠。檢測各組小鼠血清中IgE含量，測定肺泡灌洗液中IL-4和IL-13活性，制備肺組織病理切片。
血清的采集及肺泡灌洗液的制備：
最后一次霧化激發(fā)操作24小時后，對小鼠進行眼球采血。從小鼠眼眶取血1 ml，把血液注入高速離心機，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清液放入-80℃冰箱冷凍保存，用于檢測IgE。
小鼠處死后，開胸暴露氣管至左右分支處，結(jié)扎右主支氣管后，將右肺取下，放入10%甲醛溶液中固定，48 小時后進行水洗，再用不同濃度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脫水，經(jīng)過二甲苯透明后用石蠟包埋，用切片機切成5 μm厚的切片，采用蘇木精-伊紅染色法進行染色。光鏡下觀察肺組織病理改變，拍照記錄。
小鼠處死后，暴露并分離氣管后，經(jīng)頸部氣管插入留置針，向左肺勻速注入2 mL生理鹽水，留置2分鐘，按摩小鼠的胸部30秒后緩慢充分回收肺泡灌洗液，重復(fù)同樣操作3次，保證回收率>80%。充分混勻肺泡灌洗液，以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，吸取上清于離心管中，用于測定細胞因子含量。
實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差表示。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
5、實驗結(jié)果
（1）實驗小鼠病理學(xué)形態(tài)變化
小鼠肺組織用蘇木精-伊紅染色法染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，正常對照組小鼠肺組織切片支氣管壁完整，厚薄均勻，粘膜上皮細胞排列整齊，管腔內(nèi)未見脫落的上皮細胞及炎性滲出物，管壁及肺泡間未見嗜酸性粒細胞。模型組小鼠肺組織切片支氣管壁環(huán)肌肥厚，粘膜上皮細胞排列紊亂，部分上皮細胞脫落，管腔內(nèi)可見炎性滲出物，管壁和肺泡間隔可見較多淋巴細胞、單核細胞及嗜酸性粒細胞。陽性對照組小鼠肺組織切片支氣管粘膜上皮細胞部分破壞，支氣管管壁稍增厚，粘膜下可見輕度充血和水腫，視野下可見少許炎性滲出物。豬膽粉結(jié)合型總膽酸和?；秦i去氧膽酸各劑量給藥組小鼠肺組織切片支氣管壁結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)，管腔內(nèi)無炎性滲出物，粘膜上皮細胞開始恢復(fù)，粘膜下充血及水肺不明顯。
（2）豬膽粉結(jié)合型總膽酸及?；秦i去氧膽酸對小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13活性及血清中IgE含量的影響
豬膽粉結(jié)合型總膽酸及?；秦i去氧膽酸治療組與模型組相比，IL-4、IL-13和IgE含量明顯降低，有顯著性差異（P <0.001或P ﹤0.01或P ﹤0.05），與正常空白對照組相比，差異無顯著性，表明豬膽粉結(jié)合型總膽酸和?；秦i去氧膽酸可明顯抑制卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)小鼠肺泡灌洗液IL-4和IL-13活性及血清IgE含量升高。
6、結(jié)論
實驗結(jié)果表明，豬膽粉結(jié)合型總膽酸和?；秦i去氧膽酸對卵清蛋白誘導(dǎo)的支氣管哮喘模型小鼠免疫球蛋白、白介素4和白介素13含量升高有抑制作用，豬膽汁結(jié)合型總膽酸和牛磺豬去氧膽酸能抑制促炎細胞因子的分泌，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，有效地阻斷免疫反應(yīng)性對機體造成的損傷，達到治療目的。
含有效成分豬膽粉結(jié)合型總膽酸或?；秦i去氧膽酸藥物的功能：消炎。
含有效成分豬膽粉結(jié)合型總膽酸或?；秦i去氧膽酸藥物主治：支氣管哮喘。
含有效成分豬膽粉結(jié)合型總膽酸或牛磺豬去氧膽酸藥物的規(guī)格：片劑每片重0.3g，每片含豬膽粉結(jié)合型總膽酸50 mg，或每片含?；秦i去氧膽酸10 mg；膠囊劑每粒重0.3 g，每粒含豬膽粉結(jié)合型總膽酸50 mg，或每粒含?；秦i去氧膽酸10 mg；顆粒劑每袋重10g，每克含豬膽粉結(jié)合型總膽酸5 mg，或每克含?；秦i去氧膽酸1 mg；糖漿劑每瓶10mL，每毫升含豬膽粉結(jié)合型總膽酸5 mg，或每毫升含?；秦i去氧膽酸1 mg。
含有效成分豬膽粉結(jié)合型總膽酸或?；秦i去氧膽酸藥物的用法用量：口服藥物每日服3次，每次口服片劑1片或膠囊劑1?；蝾w粒劑1袋或糖漿劑1支，小兒酌減。
含有效成分豬膽粉結(jié)合型總膽酸或?；秦i去氧膽酸藥物的儲藏：密封陰涼干燥處儲藏。
含有效成分豬膽粉結(jié)合型總膽酸或牛磺豬去氧膽酸藥物的有效期：兩年。