水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗及其制備方法和用途。本發(fā)明的二聯(lián)活疫苗中，有效成分包括水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61以及水貂犬瘟熱病毒弱毒疫苗株CDV3-CL，其中所述的人工致弱的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC NO.9560。安全性試驗(yàn)表明，使用本發(fā)明的二聯(lián)活疫苗接種水貂無任何不良反應(yīng)發(fā)生；效力試驗(yàn)表明，單劑量接種疫苗后，可使水貂免于犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒檢驗(yàn)用強(qiáng)毒的攻擊，獲得保護(hù)。本發(fā)明的二聯(lián)活疫苗可用于同時(shí)預(yù)防水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎兩種疾病，實(shí)現(xiàn)“一針防兩病”，具有廣闊的應(yīng)用前景。CGMCC NO 956020140813
【專利說明】水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種二聯(lián)活疫苗及其制備方法和用途，特別涉及一種水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗及其制備方法和用途，本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬犬瘟熱病毒引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，其主要特征是以侵害黏膜系統(tǒng)為主，出現(xiàn)雙相體溫升高，伴有卡他性肺炎、胃腸炎，偶有神經(jīng)癥狀，容易繼發(fā)其他細(xì)菌病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高達(dá)80%。帶毒動(dòng)物是最危險(xiǎn)的傳染源，通過眼及鼻分泌物、唾液、尿、糞便排出病毒，主要經(jīng)消化道、呼吸道傳染，是水貂養(yǎng)殖業(yè)三大疫病之一，俗稱“貂瘟”。
[0003]水貂細(xì)小病毒性腸炎是由細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬水貂細(xì)小病毒引起的急性、高度接觸性傳染病，是水貂養(yǎng)殖業(yè)三大疫病之一。不同年齡和品種的水貂均有易感性，但50?60日齡的仔貂和幼貂最為易感，幼貂的發(fā)病率為70%以上，其死亡率可達(dá)90% ;成年貂的發(fā)病率為30%左右，死亡率在30%以下?；疾∷鹾湍瓦^貂是該病的主要傳染源，通過糞、尿、唾液排毒，經(jīng)消化道和呼吸道傳染給易感染的健康貂。該病全年都可發(fā)生，常呈地方性流行，一旦傳入貂場，如獸醫(yī)防疫衛(wèi)生措施不完善，常常導(dǎo)致該病長期存在和周期性發(fā)生。
[0004]我國毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)從上世紀(jì)50年代起步，90年代獲得蓬勃發(fā)展，現(xiàn)金已成為畜牧業(yè)養(yǎng)殖的重要組成部分。目前，我國水貂存欄數(shù)可達(dá)5000萬只，主要集中在山東、河北、吉林、遼寧、黑龍江等省份地區(qū)，并形成了較大的產(chǎn)業(yè)鏈。在某些地區(qū)水貂等毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)甚至成為區(qū)域經(jīng)濟(jì)的支柱性產(chǎn)業(yè)?？梢娒?dòng)物養(yǎng)殖業(yè)對推動(dòng)“三農(nóng)”經(jīng)濟(jì)發(fā)展，促進(jìn)農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，增加農(nóng)民就業(yè)和收入起到了重要的作用。水貂犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎是危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的兩種最重要傳染病，由于缺乏特效的治療方法，目前仍以疫苗接種作為兩種疫病的主要防控手段。
[0005]目前國內(nèi)市場上流行的水貂犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎疫苗多為未凍干的單疫苗，往往需要對水貂進(jìn)行兩次或兩次以上的免疫，既提高了養(yǎng)殖成本，加大養(yǎng)殖戶的工作量，又對獸群造成嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，甚至導(dǎo)致各別水貂的猝死。同時(shí)濕苗還具有保存期短，不易運(yùn)輸和儲(chǔ)存等缺點(diǎn)。因此，研制出安全、有效、保存期長、容易儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)乃跞翢?細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗是控制水貂犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎的有效方法，實(shí)現(xiàn)“一針防兩病”，是行業(yè)和市場的迫切需求，具有廣闊的市場前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]為解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗及其制備方法，本發(fā)明的二聯(lián)活疫苗可用于同時(shí)預(yù)防水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎兩種疾病。
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為:
[0008]本發(fā)明的一種水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗，其特征在于有效成分包括水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61以及水貂犬瘟熱病毒弱毒疫苗株CDV3-CL，其中所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為:CGMCC N0.9560。
[0009]其中，所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61為本發(fā)明發(fā)明人自行經(jīng)過在貓腎細(xì)胞CRFK上多次傳代后獲得的弱毒疫苗株，命名為MEVB-F61，分類命名為水貂細(xì)小病毒(Mink Enteritis Virus),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為:CGMCCN0.9560，保藏時(shí)間為:2014年8月13日。
[0010]所述的水貂犬瘟熱病毒弱毒疫苗株CDV3-CL為市售且已進(jìn)行新獸藥注冊的弱毒疫苗株，該疫苗株由本單位(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所)分離、克隆純化并鑒定。
[0011]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗成品中犬瘟熱病毒滴度(tcid5CI)彡104 7頭份，水貂細(xì)小病毒滴度(tcid5CI)彡105 5/頭份。
[0012]本發(fā)明還提供了一種制備以上所述的水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0013](1)將所述的水貂細(xì)小病毒弱毒株MEVB-F61接種在貓腎細(xì)胞F81或CRFK上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病毒情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80%左右時(shí)即可通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，并進(jìn)行病毒滴度(TCID5(i ^ 106_5)、純凈性檢驗(yàn)，將檢驗(yàn)合格的病毒液保存于-20。。；
[0014](2)水貂犬瘟熱病毒弱毒疫苗株CDV3-CL接種于非洲綠猴腎細(xì)胞Veix)上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病毒情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80%左右時(shí)通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，并進(jìn)行病毒滴度(TCID5(i> 105_°)、純粹性檢驗(yàn)，將檢驗(yàn)合格的病毒液保存于-20°C;
[0015](3)將步驟(1)和(2)收獲的病毒液混合均勻，加入凍干保護(hù)劑混合，定量分裝于無菌的安瓶內(nèi)，加蓋置于凍干機(jī)內(nèi)預(yù)凍、干燥，即得。
[0016]在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，疫苗成品中犬瘟熱病毒滴度> 104 7頭份，水貂細(xì)小病毒滴度彡105.5/頭份。
[0017]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗在制備預(yù)防水貂犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎藥物中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的二聯(lián)苗經(jīng)安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過單劑量(犬瘟熱病毒滴度> 104_°/頭份，水貂細(xì)小病毒滴度> 105.5/頭份)、單劑量重復(fù)和10倍劑量接種水貂，體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)均表現(xiàn)正常，無任何臨床癥狀，剖檢觀察水貂主要臟器均無病變，證明水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗對水貂安全；
[0019]效力試驗(yàn)表明，單劑量接種疫苗后，可保護(hù)水貂免于犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒檢驗(yàn)用強(qiáng)毒的攻擊，有效預(yù)防水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎的發(fā)生。一次免疫接種3周、3個(gè)月后，水貂對犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒的保護(hù)率均為100% ;—次免疫接種6個(gè)月后，水貂對犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒的保護(hù)率均為95% ;—次免疫接種9個(gè)月后，水貂對犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒的保護(hù)率分別為85%和90%。疫苗的免疫期定為6個(gè)月。-8?_10°C的保存期定為12個(gè)月，-15?_20°C疫苗的保存期為15個(gè)月。具體實(shí)施例
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0021 ] 實(shí)施例1水貂細(xì)小病毒MEVB的傳代致弱
[0022]1、水貂細(xì)小病毒MEVB的傳代致弱
[0023](1)將水貂細(xì)小病毒疫苗株MEVB以同步接毒的方法接種在貓腎細(xì)胞CRFK上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80%左右時(shí)即可通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒，標(biāo)記為MEVB-F1 (第1代)。
[0024](2)將第1代病毒MEVB-F1按照上面所述的方法接種、收獲病毒，標(biāo)記為MEVB-F2 (第2代)。使用同樣的方法，將病毒傳代到61代，標(biāo)記為MEVB-F61。
[0025](3)當(dāng)水貂細(xì)小病毒MEVB連續(xù)傳代到第10代(MEVB-F10)時(shí)，對病毒進(jìn)行克隆噬斑純化。其方法為:將待純化的病毒作10倍比稀釋至10_7，取10_3?10_75個(gè)稀釋度病毒懸液0.1ml，與CRFK細(xì)胞同步接種于6孔培養(yǎng)板，并設(shè)未接毒細(xì)胞對照孔。置培養(yǎng)箱(35°C、5% C02)中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，去掉培養(yǎng)液，用無血清MEM清洗2次，加入預(yù)熱至37°C的低熔點(diǎn)營養(yǎng)瓊脂3mL/孔，室溫冷卻凝固，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)3?5d，每天觀察噬斑。選擇最高稀釋度病毒接種孔，挑取相對獨(dú)立的單個(gè)噬斑，標(biāo)記為F+1代(即F11代)。挑出的帶有病毒的低熔點(diǎn)瓊脂噬斑用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，與CRFK細(xì)胞同步接種于6孔培養(yǎng)板，繼續(xù)傳代，標(biāo)記為F+2代(即F12代)。從F+3代(即F13代)開始仍用細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代，此后病毒每傳10?20代進(jìn)行一次噬斑克隆純化。
[0026]2、水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61的遺傳變異分析
[0027]同原始毒株MEVB(GenBank登陸號(hào)FJ592174)相比，弱毒株MEVB-F61的主要蛋白氨基酸及其基因序列發(fā)生了一定的突變，表現(xiàn)在于結(jié)構(gòu)蛋白VP2第145位氨基酸由I突變?yōu)長 ;第300位氨基酸(主要抗原決定簇位點(diǎn)之一)由V突變?yōu)锳 ;第411位氨基酸由A突變?yōu)镋 ;第562位氨基酸由V突變?yōu)長。
[0028]3.水貂細(xì)小病毒致弱株MEVB-F61毒力返強(qiáng)試驗(yàn)
[0029](1)第1代毒力返強(qiáng)試驗(yàn)使用第61代病毒MEVB-F61灌胃接種抗體陰性水貂(10ml/只，107TCID50/ml)，同時(shí)設(shè)不接種陰性對照。
[0030](2)將前1代接種動(dòng)物第4?8天排泄物混合到一起，經(jīng)PBS重懸、氯仿抽提后，取上清作為下一代毒力返強(qiáng)試驗(yàn)的接種物，灌胃接種量為10ml/只，連續(xù)接種5代。
[0031](3)每次接種病毒后連續(xù)14天觀察水貂的體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)，并剖檢觀察接種水貂腸道病變情況。
[0032](4)結(jié)果表明，連續(xù)5代動(dòng)物回歸試驗(yàn)中接種水貂體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)均表現(xiàn)正常，未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，剖檢觀察接種水貂腸道無病變，說明疫苗株MEVB-F61未發(fā)生毒力返強(qiáng)，可用于疫苗研究。
[0033]所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為:CGMCC N0.9560，保藏時(shí)間為:2014年8月13日。
[0034]實(shí)施例2水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗的制備
[0035]1.優(yōu)化二聯(lián)苗中犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的配比
[0036](1)將制備的弱毒株 MEVB-F61 稀釋為:104_5TCID5(l/ml、105 °TCID5(l/ml、105_5TCID5(l/ml和106_°TCID5(l/ml，后肢肌肉接種陰性水貂，每只1ml，同時(shí)設(shè)未接種對照組。于免疫后6個(gè)月使用細(xì)小病毒檢驗(yàn)用強(qiáng)毒對各組水貂進(jìn)行攻擊，灌胃接種10ml，含100個(gè)LD5CI(半數(shù)致死量)。連續(xù)14天觀察攻毒水貂體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)及死亡情況。結(jié)果顯示，接種不同滴度病毒的保護(hù)率分別為:85%、90%、95%和95%。
[0037](2)將制備的弱毒株 CDV3-CL稀釋為:103_5TCID5(l/ml、104 °TCID5(l/ml 和 104 5TCID50/ml，后肢肌肉接種陰性水貂，每只1ml，同時(shí)設(shè)未接種對照組。于免疫后6個(gè)月使用犬瘟熱檢驗(yàn)用強(qiáng)毒對各組水貂進(jìn)行攻擊，后肢肌肉接種1ml，含100個(gè)LD5(i。連續(xù)14天觀察攻毒水貂體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)及死亡情況。結(jié)果顯示，接種不同滴度病毒的保護(hù)率分別為:80%、90%和 90%。
[0038](3)當(dāng)水貂細(xì)小病毒弱毒株MEVB-F61的病毒滴度彡105 5/ml，犬瘟熱病毒弱毒株CDV3-CL的病毒滴度> 104 7ml時(shí)，接種水貂可產(chǎn)生較好的免疫效果，保護(hù)接種水貂免于強(qiáng)毒攻擊。因此，二聯(lián)苗中犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒的配比定為:犬瘟熱病毒滴度彡104 0TCID50/頭份，水貂細(xì)小病毒滴度> 105 5TCID50/頭份。
[0039]2.水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗的制備
[0040](1)將保藏的水貂細(xì)小病毒弱毒株MEVB-F61同步接種在貓腎細(xì)胞F81或CRFK上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病毒情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80%左右時(shí)即可通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，并進(jìn)行病毒滴度(TCID5(I> 106_5)、純凈性檢驗(yàn)。將檢驗(yàn)合格的病毒液保存于_20°C。
[0041](2)將保藏的水貂犬瘟熱病毒弱毒疫苗株CDV3-CL接種于非洲綠猴腎細(xì)胞Vero上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病毒情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80%左右時(shí)通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，并進(jìn)行病毒滴度(TCID5(I> 105_°)、純粹性檢驗(yàn)。將檢驗(yàn)合格的病毒液保存于-20。。。
[0042](3)制備凍干保護(hù)劑
[0043]將明膠、水解乳蛋白和蔗糖溶解于水中，按照質(zhì)量百分比計(jì)，使明膠的終濃度為2?7%，水解乳蛋白的終濃度為10-25%，蔗糖終濃度為15?30%，于116°C、30min高壓滅菌后得到。
[0044](4)將收獲的病毒液按照一定比例混合均勻，按照3份病毒混合液與1凍干保護(hù)劑混合的比例混合，定量分裝于無菌的安瓶內(nèi)，加蓋置于凍干機(jī)內(nèi)預(yù)凍、干燥。
[0045](5)疫苗成品進(jìn)行病毒滴度、純粹性檢驗(yàn)，犬瘟熱病毒滴度> 104 7頭份，水貂細(xì)小病毒滴度> 105.5/頭份。
[0046]實(shí)施例3水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗的安全性試驗(yàn)
[0047]取檢驗(yàn)合格的水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗3批(實(shí)施例2方法制備)，后肢肌肉接種抗體陰性水貂，設(shè)單劑量(犬瘟熱病毒滴度> 1047頭份，水貂細(xì)小病毒滴度> ?ο5.5/頭份)、單劑量重復(fù)和超劑量(?ο倍)免疫組，同時(shí)設(shè)不接種疫苗水貂作為對照。疫苗接種后，連續(xù)14天觀察水貂的體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)，并剖檢觀察接種水貂主要臟器病變情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，水貂經(jīng)單劑量、單劑量重復(fù)和超劑量接種后，各項(xiàng)生理指標(biāo)均正常，未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，剖檢觀察接種水貂主要臟器無病變。說明水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗對水貂安全。
[0048]實(shí)施例4水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗的效力試驗(yàn)
[0049]1、方法
[0050](1)取檢驗(yàn)合格的水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎活疫苗3批(實(shí)施例2方法制備)，后肢肌肉接種抗體陰性水貂，每只1ml，同時(shí)設(shè)接種CRFK細(xì)胞培養(yǎng)液對照組，免疫后每月采血、分離血清，用于中和抗體和血凝抑制抗體檢測。
[0051](2)試驗(yàn)動(dòng)物接種3周、3個(gè)月、6個(gè)月和9個(gè)月后，按照實(shí)施例2所示方法進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。每天觀察攻毒水貂體溫、食欲、精神狀態(tài)等生理指標(biāo)。
[0052]2、結(jié)果
[0053]觀察發(fā)現(xiàn)，一次免疫接種后3周、3個(gè)月水貂對犬瘟熱、細(xì)小病毒的保護(hù)率均為100%，接種水貂各項(xiàng)生理指標(biāo)均正常，無任何臨床癥狀出現(xiàn)；一次免疫接種6個(gè)月后，水貂對犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒的保護(hù)率均為95% ;—次免疫接種9個(gè)月后，水貂對犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒的保護(hù)率分別為85%和90%。因此，疫苗的免疫期設(shè)定為6個(gè)月。接種犬瘟熱檢驗(yàn)用強(qiáng)毒的對照組水貂表現(xiàn)出體溫升高達(dá)40°C以上，呈雙相熱，精神沉郁、食欲減退或廢絕，兩眼眼眵增多、結(jié)膜炎，排稀便、粘便，甚至煤焦油樣血便。接種細(xì)小病毒檢驗(yàn)用強(qiáng)毒的對照組水貂表現(xiàn)出體溫升高，劇烈腹瀉，排出混有腸粘膜的水樣稀便或管型便，且經(jīng)檢驗(yàn)血液中白細(xì)胞明顯減少。
[0054]以上結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的二聯(lián)活疫苗可有效保護(hù)水貂免于犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒強(qiáng)毒的攻擊，可有效預(yù)防水貂犬瘟熱、細(xì)小病毒性腸炎的發(fā)生。
[0055]實(shí)施例5水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗的保存期測定
[0056]取檢驗(yàn)合格的水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗3批(實(shí)施例2方法制備)保存于_8?-10°C和-15?_20°C，分別于保存的第3、6、9、12、15、18和24個(gè)月取樣，進(jìn)行性狀、真空度、剩余水分、病毒滴度檢測。結(jié)果表明，3批疫苗在-8?-10°C保存12個(gè)月性狀仍為白色疏松團(tuán)塊，加入稀釋液后迅速溶解，真空度和剩余水分均在要求范圍內(nèi)，犬瘟熱、細(xì)小病毒的病毒滴度(TCID5Q)分別為:10413/ml和105 6Vml、104 21/ml和105 77/ml、104 34/ml和10 5 67/ml ;而保存于-15?_20°C 15個(gè)月后性狀為白色疏松團(tuán)塊，加入稀釋液后迅速溶解，真空度和剩余水分均在要求范圍內(nèi)，犬瘟熱、細(xì)小病毒的病毒滴度(TCID5(i)分別為:104-12/ml 和 105_76/ml、10417ml 和 105_65/ml、104_29/ml 和 105 86/ml。高于疫苗的免疫要求(犬瘟熱病毒滴度> 1047頭份，水貂細(xì)小病毒滴度> 105 5/頭份)，因此將該疫苗在-8?-10°c的保存期定為12個(gè)月，-15?-20°c的保存期定為15個(gè)月。
【權(quán)利要求】
1.水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗，其特征在于其有效成分包括水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61以及水貂犬瘟熱病毒弱毒疫苗株CDV3-CL，其中所述的水貂細(xì)小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為:CGMCC N0.9560。
2.如權(quán)利要求1所述的水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗，其特征在于疫苗成品中犬瘟熱病毒滴度TCID5tl ^ 14-0/頭份，水貂細(xì)小病毒滴度TCID5tl ^ 15 5/頭份。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將所述的水貂細(xì)小病毒弱毒株MEVB-F61接種在貓腎細(xì)胞F81或CRFK上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病毒情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80 %時(shí)即可通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，并進(jìn)行病毒滴度、純凈性檢驗(yàn)，將檢驗(yàn)合格的病毒液保存于_20°C ； (2)水貂犬瘟熱病毒弱毒疫苗株CDV3-CL接種于非洲綠猴腎細(xì)胞Vero上進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病毒情況，待細(xì)胞病變達(dá)到80 %時(shí)通過反復(fù)凍融的方法收獲病毒液，并進(jìn)行病毒滴度、純粹性檢驗(yàn)，將檢驗(yàn)合格的病毒液保存于_20°C ； (3)將步驟(I)和(2)收獲的病毒液混合均勻，加入凍干保護(hù)劑，定量分裝于無菌的安瓶內(nèi)，加蓋置于凍干機(jī)內(nèi)預(yù)凍、干燥，即得。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于疫苗成品中犬瘟熱病毒滴度TCID5tl> 14-0/頭份，水貂細(xì)小病毒滴度TCID5tl ^ 15 5/頭份。
5.權(quán)利要求1或2所述的水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)活疫苗在制備預(yù)防水貂犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/23GK104383530SQ201410577427
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】閆喜軍, 胡博, 白雪, 趙建軍, 張蕾, 張海玲, 柴秀麗, 劉昊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所