用于治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變的重組腺相關(guān)病毒-NADH脫氫酶亞單位4基因全長(zhǎng)以及藥劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變的重組腺相關(guān)病毒-NADH脫氫酶亞單位4基因全長(zhǎng)以及藥劑，該基因全長(zhǎng)，核苷酸序列SEQ ID NO：1所示，其中，該核苷酸序列全長(zhǎng)為3824bp，其由CAG啟動(dòng)子序列、帶Cox10的線粒體定位序列的ND4的編碼序列和長(zhǎng)度為625bp的UTR。將藥劑注入眼玻璃體腔中，用于治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變，本發(fā)明的藥劑注射到玻璃體腔，能夠在玻璃體腔內(nèi)保持活力，并高效轉(zhuǎn)染到視神經(jīng)細(xì)胞，該蛋白N前端的信號(hào)肽，定向引導(dǎo)該蛋白進(jìn)入線粒體，成熟的ND4蛋白進(jìn)入線粒體發(fā)揮作用。因此，藥物能有效地治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變。
【專利說(shuō)明】用于治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變的重組腺相關(guān)病 毒-NADH脫氫酶亞單位4基因全長(zhǎng)以及藥劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地指一種用于治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變 的重組腺相關(guān)病毒-NADH脫氫酶亞單位4基因全長(zhǎng)以及藥劑。
【背景技術(shù)】
[0002] Leber 遺傳性視神經(jīng)病變（Leber，s hereditary optic neuropathy，LH0N)是由 于線粒體基因突變所致的疾病，Leber遺傳性視神經(jīng)病變是世界公認(rèn)的青少年致盲眼病之 一，本病好發(fā)于青中年男性，臨床表現(xiàn)為雙眼同時(shí)或先后急性或亞急性無(wú)痛性視力減退，同 時(shí)可伴有中心視野缺損及色覺(jué)障礙。
[0003] 學(xué)者已確認(rèn)有20多個(gè)線粒體突變位點(diǎn)導(dǎo)致LH0N的發(fā)生，包括11778位點(diǎn)、14484 位點(diǎn)、3460位點(diǎn)、3490位點(diǎn)等等。其中111778位點(diǎn)突變最常見(jiàn)，占我國(guó)LH0N的89. 2%，且 預(yù)后最差，很多患者雙眼視力在〇. 1 -下，11778位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致ND4蛋白功能受損，ND4蛋 白功能下降可以降低電子流動(dòng)效率影響酶的活性從而減少視神經(jīng)細(xì)胞ATP的產(chǎn)生，細(xì)胞逐 漸凋亡，從而導(dǎo)致患者發(fā)生LHON。LH0N目前尚無(wú)方法治療，隨著基因治療的發(fā)展，LH0N的基 因治療成為可能，我們前期研究了腺相關(guān)病毒-NADH脫氫酶亞單位4 (AAV2-ND4)。將ND4導(dǎo) 入視神經(jīng)，代替因?yàn)橥蛔兌鴮?dǎo)致受損的ND4蛋白，治療LH0N。但在實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)：前期研 究的這個(gè)AAV2-ND4轉(zhuǎn)染效率較低，達(dá)不到治療的目的：由于AAV2-ND4需要注射到眼睛的玻 璃體腔內(nèi)，轉(zhuǎn)染到視神經(jīng)，但眼睛的玻璃體腔注射量有限，最多能夠注射〇. lml，劑量非常 小，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染到視神經(jīng)的正常ND4非常少，如果增加AAV-ND4的濃度，會(huì)引起機(jī)體的免疫反 應(yīng)，反復(fù)給藥也會(huì)因?yàn)槊庖叻磻?yīng)而沒(méi)有作用。因此最佳辦法是提高AAV2-ND4的轉(zhuǎn)染效率。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是提供一種用于治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變的 重組NADH脫氫酶亞單位4基因全長(zhǎng)以及藥劑。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的一種用于治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變的重 組NADH脫氫酶亞單位4基因全長(zhǎng)，核苷酸序列SEQ ID N0 :1所示，其中，該核苷酸序列全長(zhǎng) 為3824bp，其由CAG啟動(dòng)子序列、帶CoxlO的線粒體定位序列的ND4的編碼序列和長(zhǎng)度為 625bp 的 UTR。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種含有重組NADH脫氫酶亞單位4基因的腺相關(guān)病毒載體，該載 體命名為 AAV2-CAG-ND4。
[0007] 其CoxlO和長(zhǎng)度為625bp的UTR目的是保證AAV2導(dǎo)入的ND4蛋白進(jìn)入到線粒體內(nèi) 發(fā)揮正常的生理作用，在ND4的前后增加兩個(gè)序列分別是線粒體靶向序列，將它設(shè)計(jì)在ND4 序列的前面，其作用是引導(dǎo)AAV2轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核的翻譯成的ND4蛋白進(jìn)入線粒體。N0 :4是 非編碼序列，設(shè)計(jì)在ND4蛋白的后面，其作用是穩(wěn)定線粒體靶向序列和ND4的表達(dá)。此前的 非編碼序列都是1400個(gè)堿基，不便于包裝到AAV2,我們將這個(gè)序列縮短到625個(gè)堿基，既能 保證ND4的穩(wěn)定性，又能提高AAV2-ND4的包裝效率，提高出毒率。能夠在視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞高效表達(dá)ND4蛋白。其目的是保證ND4蛋白在視神經(jīng)高效表達(dá)，達(dá)到治療Leber遺傳 性視神經(jīng)病變作用。
[0008] 使用CAG啟動(dòng)子代替普通的CMV啟動(dòng)子，提高了 AAV2-CAG-ND4在玻璃體腔的轉(zhuǎn)染 效率，達(dá)到注射小劑量能治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變的效果，符合眼玻璃體腔注射小量， 高效的要求。
[0009] 其中，NADH脫氫酶亞單位4基因（ND4)序列，以漢人的線粒體基因序列為基礎(chǔ)，其 在Genebank的序列號(hào)是AY963573. 2。我們對(duì)這個(gè)序列進(jìn)行修改，使新的基因序列在細(xì)胞核 里編碼的ND4蛋白序列與AY963573. 2在線粒體內(nèi)編碼的ND4蛋白完全相同。其核苷酸序 列SEQ ID N0 :2所示。修改方法如下：
【權(quán)利要求】
1. 一種用于治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變的重組NADH脫氫酶亞單位4基因全長(zhǎng)，核 苷酸序列SEQ ID NO :1所示，其中，該核苷酸序列全長(zhǎng)為3824bp，其由CAG啟動(dòng)子序列、帶 CoxlO的線粒體定位序列的ND4的編碼序列和長(zhǎng)度為625bp的UTR。
2. 含有權(quán)利要求1所述重組NADH脫氫酶亞單位4基因的腺相關(guān)病毒載體，該載體命名 為 AAV2-CAG-ND4。
3. 用于獲得權(quán)利要求1所述重組NADH脫氫酶亞單位4基因全長(zhǎng)的引物對(duì)，其特征在 于：所述引物對(duì)為： 正向引物 IF: 5 ' -ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3 '， 反向引物 1R: 5 ' -GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3 '。
4. 一種權(quán)利要求1或3所述重組NADH脫氫酶亞單位4基因的獲得方法，其特征在于： 以具有重組NADH脫氫酶亞單位4基因的腺相關(guān)病毒載體全基因組DNA為模板，采用以下引 物對(duì)： 正向引物 1F:5' -ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3' 反向引物 1R: 5 ' -GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3 ' 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其所獲得的重組NADH脫氫酶亞單位4基因?yàn)镾EQ IDN0. 1。
5. -種權(quán)利要求2所述的載體在制備用于治療Leber遺傳性視神經(jīng)病變的藥劑中的應(yīng) 用，其特征在于：將含有AAV2-CAG-ND4的藥劑注入眼玻璃體腔中，用于治療Leber遺傳性視 神經(jīng)病變。
6. -種權(quán)利要求5所述的藥劑，其特征在于：所述藥劑中，AAV2-CAG-ND4含量：有效 量控制在每一毫升藥劑中含有1011的AAV2-CAG-ND4,其中，所述藥劑還包括輔料，其中， a，a-海藻糖二水合物含量為0.5?1.5%、鹽酸組氨酸一水合物含量為0.05?0.2% ; 聚山梨醇酯20含量為0. 5?2%。
【文檔編號(hào)】A61P25/02GK104450747SQ201410491726
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】李斌 申請(qǐng)人:李斌