具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的擬青霉提取物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的擬青霉提取物及其用途。所述擬青霉提取物中含有30.0-99.0%擬青霉酮，擬青霉酮包括擬青霉酮A、擬青霉酮B和擬青霉酮C。擬青霉提取物對酪氨酸酶的半數(shù)抑制濃度（IC50）為13.5～37.7μg/mL；對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度（DC50）為105.5～196.1μg/mL。擬青霉提取物純化品抑制酪氨酸酶的活性和清除自由基的活性都遠(yuǎn)強(qiáng)于目前廣泛用于化妝品的熊果苷，擬青霉提取物純化品作為日用化學(xué)品的添加劑，具有增白、抗氧化、抗老化、保鮮、殺菌、消炎作用。
【專利說明】具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的擬青霉提取物及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制品的提取制備【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及具有酪氨酸酶抑制活性和自由基清除活性的擬青霉酮(包括擬青霉酮A、擬青霉酮B和擬青霉酮C)提取、純化和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]擬青霉酮是從一種擬青霉(Paecilomyces sp.)培養(yǎng)物中分離制備得到的具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的生物活性物質(zhì)。
[0003]擬青霉(Paecilomycessp.)為麥角菌科(Clavicipitaceae)蟲草屬(Cordyceps)的真菌；在我國常見的有蝶擬青霉(Paecilomyces cicadae)、細(xì)腳擬青霉(Paecilomycestenuip)、古尼擬青霉(Paecilomyces gunnii)和蟲甬?dāng)M青霉(Paecilomyces militari)等。其中蛹擬青霉感染昆蟲后形成的蟲菌復(fù)合體為蛹蟲草(Cordyceps militari)被稱作北蟲草，并作為冬蟲夏草的代用品，具有重要經(jīng)濟(jì)價值。上述菌種都可從被擬青霉感染的昆蟲上分離得到或從土壤中分離得到。抑制酪氨酸酶活性:酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的雙重功能，在黑色素合成過程中起關(guān)鍵作用。它能夠把單酚催化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促條件下形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素。具有抑制酪氨酸酶活性的生物活性物質(zhì)可通過抑制酪氨酸酶活性而抑制黑色素生成，因而可用來預(yù)防和治療色素沉著和黑色素瘤等，在醫(yī)藥和日用化學(xué)品等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]清除自由基活性:自由基(free radical),從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看是指含未配對電子的基團(tuán)、原子或分子。自由基具有高度化學(xué)活性。對于生命體來說，自由基是生命活動中多種生化反應(yīng)的中間產(chǎn)物。在正常情況下，人體內(nèi)的自由基是處于產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡之中。自由基是機(jī)體有效的防御系統(tǒng)，如不能維持一定水平的自由基則會對機(jī)體生命活動帶來不利影響。但自由基產(chǎn)生過多或清除過慢，它通過攻擊生命大分子物質(zhì)及各種細(xì)胞器，會造成機(jī)體分子水平、細(xì)胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機(jī)體的衰老進(jìn)程并誘發(fā)各種疾病。最新的研究表明，人類的衰老及許多疾病都與自由基損傷有關(guān)。具有清除自由基活性的物質(zhì)能與自由基反應(yīng)并使之還原成非自由基化合物，可清除機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的過多的自由基，是一種可增進(jìn)人體健康的重要活性物質(zhì)。自由基清除劑在非生命體系中有抗氧化作用，能夠有效地阻止物質(zhì)的氧化敗壞，對于延長物品的保質(zhì)期有著重要作用，被廣泛用于食品、藥品、日用化學(xué)品等中。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為尋找新型天然高效的具有酪氨酸酶抑制活性和清除自由基活性的物質(zhì)，發(fā)明人通過對中國的100余株昆蟲病原真菌代謝物進(jìn)行活性研究，發(fā)現(xiàn)了從擬青霉中提取的擬青霉提取物具有很強(qiáng)的抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的作用。
[0006]本發(fā)明所述擬青霉提取物中含有30.0-99.0%擬青霉酮，所述擬青霉酮包括擬青霉酮A、擬青霉酮B和擬青 霉酮C，三者的結(jié)構(gòu)式見下式:[0007]
【權(quán)利要求】
1.一種擬青霉提取物，其特征在于:所述擬青霉提取物中含有30.0-99.0%擬青霉酮，所述擬青霉酮包括擬青霉酮A、擬青霉酮B和擬青霉酮C，三者的結(jié)構(gòu)式見下式:
2.具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的擬青霉提取物的用途，其特征在于:根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬青霉提取物在制備具有抑制酪氨酸酶活性和清除自由基活性的日用化學(xué)品中的應(yīng)用；所述擬青霉提取物具有以下特性:(1)對酪氨酸酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為:13.5~37.7 yg/mL J^DPPH自由基的半數(shù)清除濃度(DC5tl)為:105.5~196.1 u g/mL ；(2)權(quán)利要求1所述的擬青霉酮A、擬青霉酮B和擬青霉酮C對酪氨酸酶的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)分別為:13.3 ~ 29.1 u g/mL、16.8 ~40.6 y g/mL 和 10.3 ~20.2 y g/mL ;擬青霉酮A、擬青霉酮B和擬青霉酮C對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度(DC5tl)分別為:93.5 ~165.3 u g/mL、161.4 ~265.5 u g/mL 和 61.5 ~113.6 u g/mL。
3.制備權(quán)利要求1或2所述的擬青霉提取物方法，其特征在于:具體操作步驟如下: .1)擬青霉(Paecilomycessp.)菌種選擇 所用的擬青霉(Paecilomyces sp.)為蝶擬青霉(Paecilomyces cicadae)或古尼擬青霉(Paecilomyces gunnii)或蟲甬?dāng)M青霉(Paecilomyces militari)； .2)菌株培養(yǎng) 培養(yǎng)方法為液固混合培養(yǎng)，具體工序如下: .2.1)斜面種子培養(yǎng) 將保藏的擬青霉菌株接種于薩氏(SDAY)斜面培養(yǎng)基，于20~30°C恒溫、培養(yǎng)4~7d,得到一級菌種； . 2.2) 二級液體種子培養(yǎng) 將一級菌種接種至液體搖瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)； 液體搖瓶培養(yǎng)基:葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸餾水定容； 在大于等于100ml三角瓶中加入30~50%三角瓶體積的液體培養(yǎng)基，每個三角瓶接種I~3支斜面菌種，接種后置于全溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度20~30°C、轉(zhuǎn)速100~200rpm，培養(yǎng)3~7d，即得到二級菌種； .2.3)三級液體種子培養(yǎng) 將二級菌種接種到大于等于IOL的發(fā)酵罐，所裝液量為罐體積的50~80%，接種量5~10%，通氣量按體積比1:1 (v/v)，壓力0.1MPa, 20~30°C恒溫通氣培養(yǎng)2~5天，得到三級菌種；發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基同液體搖瓶培養(yǎng)基； .2.4)固體培養(yǎng) 將三級液體菌種拌入固體培養(yǎng)基中，接種量為固體料量的5~10%，20~30°C恒溫通氣培養(yǎng)10~20天，得到發(fā)酵物；所述固體培養(yǎng)基為蒸煮過的大米或小麥，蒸煮后的大米或小麥含水率為40~80% ； . 3)培養(yǎng)物中有效成分的提取和精制 . 3.1)培養(yǎng)物的預(yù)處理 將固體培養(yǎng)物在30~150°C干燥到含水率小于等于20%，然后粉碎到20~120目，用乙醇提取；料液比為1:1~5、提取時間為I~48小時；提取結(jié)束后在轉(zhuǎn)速大于等于1000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心，或真空抽濾；濾液在溫度小于等于100°c濃縮到原體積的1/2~1/10，得到濃縮脫醇液，同時回收乙醇，濃縮液用于進(jìn)一步的色譜法精制； .3.2)提取物的制備和精制 .3.2.1)擬青霉提取物的制備 將前述乙醇提取物經(jīng)過逆流色譜法初步純化，得到權(quán)利要求1所述擬青霉提取物；逆流色譜法的溶劑系統(tǒng)按體積比為正己烷:乙酸乙酯:甲醇:乙酸:水=3~5:4~6:2~4:.0~1:4~6 ;每5分鐘收集一管；合并含有擬青霉酮A、擬青霉酮B和擬青霉酮C的收集管；在小于等于100°C溫度下將收集物濃縮到到原體積的1/2~1/10，并將濃縮物在不高于170°C條件下干燥得到權(quán)利要求1所述擬青霉提取物； 不同批次擬青霉提取物外觀為淺黃綠色到棕黃色；經(jīng)高效液相分析發(fā)現(xiàn)各批次擬青霉提取物中含擬青霉酮30.0~99.0% ;總擬青霉酮中，擬青霉酮A占10.0~20.0%，擬青霉酮B占10.0~30.0%，擬青霉酮C占50.0~80.0% ;各成分的結(jié)構(gòu)式如下:
【文檔編號】A61K8/35GK103655215SQ201310582413
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】胡豐林, 鮑官虎, 陸瑞利, 劉肖肖 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)