用于不同治療應用的含熱穩(wěn)定氧載體的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】提供了一種適合用于哺乳動物且不會導致腎損傷和血管收縮的高度純化的和熱穩(wěn)定的、交聯的非聚合四聚體血紅蛋白。執(zhí)行高溫短時(HTST)加熱加工步驟以有效地去除不合乎需要的二聚體形式的血紅蛋白、未交聯的四聚體血紅蛋白、和血漿蛋白雜質。在熱處理后和任選地在熱處理前添加N-乙酰半胱氨酸維持低水平的高鐵血紅蛋白。熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白可以改善和延長常氧和低氧組織中的氧合。在另一方面，該產品用于治療各種類型的癌癥諸白血病、結直腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。本發(fā)明的四聚體血紅蛋白還可以用于預防手術切除腫瘤后的腫瘤轉移和復發(fā)。此外本發(fā)明的四聚體血紅蛋白可以在化療和放射治療之前施用于患者。
【專利說明】用于不同治療應用的含熱穩(wěn)定氧載體的藥物組合物
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請是要求于2011年7月11日提交的美國部分繼續(xù)申請?zhí)?3/179，590、目前為專利號8，048，856的優(yōu)先權的國際專利申請，該美國部分繼續(xù)申請的公開內容通過引用
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[0003]版權通知/許可
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【技術領域】
[0005]本發(fā)明涉及一種用于制備含熱穩(wěn)定氧載體的藥物組合物的方法和由所述方法制備的組合物。本發(fā)明還涉及所述含熱穩(wěn)定氧載體的藥物組合物在人和其他動物的癌癥治療、缺氧病癥(oxygen-deprivation disorder)和器官保存中的用途。
【背景技術】
[0006]血紅蛋白在大多數脊椎動物中對于血管系統(tǒng)和組織之間的氣體交換具有重要作用。其負責經由血液循環(huán)將氧從呼吸系統(tǒng)運送至機體細胞，并且還將代謝廢物二氧化碳從機體細胞運離至呼吸系統(tǒng)，在呼吸系統(tǒng)二氧化碳被呼出。由于血紅蛋白具有此氧運輸特性，因此如果其在離體(ex vivo)狀態(tài)下可以被穩(wěn)定并且可以在體內(in vivo)使用，貝U其可以被用作有效的供氧器。
[0007]天然存在的血紅蛋白是四聚體，當其存在于紅細胞內時通常是穩(wěn)定的。然而，當天然存在的血紅蛋白移出紅細胞時，其在血漿中變得不穩(wěn)定，并且分裂成兩個α-β 二聚體。這些二聚體的每一個的分子量為約32kDa。這些二聚體當通過腎臟過濾和排泄時可能導致顯著的腎損傷。四聚體鍵的斷裂還負面地影響了功能性血紅蛋白在循環(huán)系統(tǒng)中存在的持久性。
[0008]為了解決這個問題，近年來在血紅蛋白加工方面的發(fā)展已經結合了多種交聯技術來形成四聚體內的分子內鍵以及四聚體之間的分子間鍵，從而形成聚合血紅蛋白。現有技術教導聚合血紅蛋白是增加血紅蛋白的循環(huán)半衰期的優(yōu)選形式。然而，本發(fā)明人確定，聚合血紅蛋白在血液循環(huán)中更容易轉變成為聞鐵血紅蛋白。聞鐵血紅蛋白不能結合氧因此不能氧合組織。因此，現有技術教導的導致形成聚合血紅蛋白的交聯作用是有問題的。在本領域中存在著對允許分子內交聯從而形成穩(wěn)定的四聚體而不同時形成聚合血紅蛋白的技術的需求。 [0009]現有技術為穩(wěn)定血紅蛋白進行的嘗試所存在的更多問題包括:產生的四聚體血紅蛋白中包含無法接受的高百分比的二聚體單位；二聚體的存在使得血紅蛋白組合物不能令人滿意地施用于哺乳動物。血紅蛋白的二聚體形式可以導致哺乳動物身體的嚴重腎損傷；此腎損傷可以嚴重到足以導致死亡。因此，本領域中存在著對在終產物中形成具有檢測不到的二聚體形式的穩(wěn)定的四聚體血紅蛋白的需求。
[0010]現有技術血紅蛋白產品存在的另一問題是給藥后血壓的急劇增加。在過去，從上一代基于血紅蛋白的氧載體已經記錄到血管收縮事件。例如，Hcino丨)ure?產品(BiopureC0.,USA)導致與基線(96±10mmHg)相比較高的平均動脈壓(124±9mmHg)或高30%,如由Katz等人，2010公開?，F有技術解決此問題的嘗試依賴于巰基試劑與血紅蛋白巰基反應，據稱以防止內皮細胞舒血管因子與該巰基的結合。然而，巰基處理的使用增加了加工步驟，導致增加的成本和雜質，所述雜質以后必須從血紅蛋白組合物中去除。因此，在本領域中存在著對制備當應用于哺乳動 物時不引起血管收縮和高血壓的血紅蛋白的方法的需求。
[0011]現有技術為形成穩(wěn)定的血紅蛋白進行的嘗試所存在的更多問題包括:存在蛋白雜質諸如免疫球蛋白G，其可以引起哺乳動物中的變態(tài)反應效應。因此，本領域中存在著對可以產生穩(wěn)定的不含蛋白雜質的四聚體血紅蛋白的方法的需求。
[0012]除了上述問題以外，在本領域中還存在著對穩(wěn)定化的四聚體血紅蛋白的需求，所述四聚體血紅蛋白不含二聚體，不含磷脂并且能夠以工業(yè)規(guī)模生產。
【發(fā)明內容】
[0013]本發(fā)明提供了一種加工非聚合的、熱穩(wěn)定的、純化的、交聯的四聚體血紅蛋白的方法，所述四聚體血紅蛋白適合用于哺乳動物，而不會引起嚴重腎損傷、血管有害作用和嚴重不良事件包括死亡。本發(fā)明去除了二聚體形式的血紅蛋白、未交聯的四聚體血紅蛋白、磷脂和蛋白雜質。另外地，本發(fā)明使用(I)用于精確的和受控的低滲裂解的即時細胞裂解設備，
(2)流通柱色譜(flowthrough column chromatography), (3)高溫短時(HTST)設備,其用于在純化過程中熱加工血紅蛋白溶液，以去除不合乎需要的未穩(wěn)定化的血紅蛋白二聚體，并且去除蛋白雜質，例如免疫球蛋白-G，使得可以避免腎損傷、血管有害作用和其他毒性反應，和(4)氣密輸液袋包裝以避免氧侵入至產品中。
[0014]該方法包括哺乳動物全血的起始材料，所述全血至少包括紅細胞和血漿。將哺乳動物全血中的紅細胞與血漿分離，緊接著進行過濾從而獲得濾過的紅細胞級分。洗滌濾過的紅細胞級分從而去除血漿蛋白雜質。在即時細胞裂解設備中以50-1000升/小時的流速通過受控的低滲裂解來破壞所述洗滌過的紅細胞，持續(xù)足以裂解紅細胞卻不裂解白細胞的時間。進行過濾從而從溶胞產物中去除至少一部分廢滲余物。從所述溶胞產物中提取第一血紅蛋白溶液。
[0015]使用超濾濾器進行第一超濾過程，所述超濾濾器被配置成從第一血紅蛋白溶液中去除分子量比四聚體血紅蛋白高的雜質并且進一步去除任何病毒和殘留的廢滲余物，從而獲得第二血紅蛋白溶液。對所述第二血紅蛋白溶液進行流通柱色譜以去除蛋白雜質、二聚體血紅蛋白和磷脂以形成無磷脂的血紅蛋白溶液。使用配置成去除雜質的濾器對所述無磷脂的血紅蛋白溶液進行第二超濾過程，產生濃縮的純化的無磷脂的血紅蛋白溶液。
[0016]通過富馬酸二-3，5-二溴水楊酸酯交聯純化的血紅蛋白的至少α-α亞基，從而形成熱穩(wěn)定的交聯血紅蛋白而不形成聚合血紅蛋白，使得得到的非聚合交聯四聚體血紅蛋白的分子量為60-70kDa。表述“非聚合”當在本文中使用時是指不與其他血紅蛋白分子或任何其他非血紅蛋白分子諸如PEG分子間交聯的四聚體血紅蛋白。用合適的生理緩沖液諸如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、乳酸鹽林格氏溶液、乙酸鹽林格氏溶液或Tris緩沖液交換所述交聯四聚體血紅蛋白。使用切向流過濾去除任何殘留的化學物質。
[0017]在此步驟后，交聯血紅蛋白被熱處理以去除任何殘留的未交聯的四聚體血紅蛋白和任何未穩(wěn)定化的血紅蛋白(例如，二聚體形式的血紅蛋白)和任何其他蛋白雜質。在熱處理之前，任選地向所述交聯四聚體血紅蛋白加入約0.2%的濃度的N-乙酰半胱氨酸以防止高鐵血紅蛋白的形成。在熱處理和冷卻后立即加入約0.2% -0.4%的濃度的N-乙酰半胱氨酸以進一步防止高鐵血紅蛋白的形成。熱處理優(yōu)選是在約70°C -95°C下進行30秒至3小時的高溫短時處理，隨后冷卻至25°C。之后在熱處理期間形成的任何沉淀物均通過離心或過濾設備去除以形成清亮的溶液。
[0018]不含二聚體、不含磷脂、不含蛋白雜質的、熱穩(wěn)定的、非聚合的交聯四聚體血紅蛋白然后加入至藥學上可接受的載體。
[0019]之后，將熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白在定制的和氣密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇(PE、EVA、EV0H)輸液袋中配制和包裝。該包裝防止氧污染，氧污染導致形成無活性的高鐵血紅蛋白。
[0020]通過上述方法制備的熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白用于治療多種癌癥諸如白血病、結直腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。破壞癌細胞的機制是改善低氧條件下腫瘤的氧合，從而提高對放射線和化療劑的敏感性。該熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白也用于在移植期間保護器官組織或用于在體內缺少供氧的情況下(諸如在缺氧心臟中)保護心臟。
[0021]此外，通過上述方法制備的熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白用于減少癌性腫瘤復發(fā)和使腫瘤細胞轉移最小化。在用于腫瘤切除手術的缺血前和在去除腫瘤后重建血供(再灌注)期間施用所述血紅蛋白。所 述血紅蛋白還可以用于增加癌組織的氧合和減小腫瘤的大小。
[0022]附圖簡述
[0023]圖1是描繪本發(fā)明的方法的概況的流程圖。
[0024]圖2示意性描繪了本發(fā)明的方法中使用的即時細胞裂解設備。
[0025]圖3描繪了對于(a)未熱處理的交聯四聚體血紅蛋白、和(b)熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白(其已經在90°C經歷45秒至2分鐘或在80°C經歷30分鐘的熱處理)的高效液相色譜分析。
[0026]圖4描繪了對熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白的電噴霧電離質譜(ESl-MS)分析。
[0027]圖5顯示了對(a)純化的血紅蛋白溶液和(b)熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白的圓二色性光譜分析。
[0028]圖6顯示了正常組織中氧合的改善。注射0.2g/kg熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白溶液導致(A)血漿血紅蛋白濃度和(B)至肌肉的氧輸送的顯著增加。與血漿血紅蛋白水平相比觀察到持續(xù)較長時間段的氧合顯著增加。
[0029]圖7顯示了低氧的腫瘤組織中氧合的改善。注射0.2g/kg熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白溶液導致至頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)異種移植物的氧輸送顯著增加。
[0030]圖8顯示了⑷鼻咽癌(NPC)和⑶肝腫瘤的嚙齒動物模型中的部分腫瘤縮小。
[0031]圖9示出了在用熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白治療后，嚴重出血性休克的大鼠模型中的平均動脈壓變化。
[0032]圖10是流通柱色譜的洗脫圖；血紅蛋白溶液處于流過級分中。
[0033]圖11示意性描繪了用于工業(yè)規(guī)模操作的具有超濾作用的流通CM柱色譜系統(tǒng)。
[0034]圖12是用于HTST熱處理加工步驟的設備的示意性圖示。
[0035]圖13示出了 HTST加工設備中的溫度曲線和在本發(fā)明的系統(tǒng)中在85°C和90°C去除未被穩(wěn)定化的四聚體(二聚體)所需的時間。
[0036]圖14示出了在圖12的HTST加工設備中在85°C和90°C在系統(tǒng)中高鐵血紅蛋白形成的速率。
[0037]圖15是用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白的輸液袋的示意性圖示。
[0038]圖16顯示了總結在肝切除術期間的手術和血紅蛋白產品給藥操作的示意圖。
[0039]圖17顯示了在肝切除術和缺血/再灌注操作后IR損傷組大鼠中誘發(fā)的肝內肝癌復發(fā)和轉移以及遠處肺轉移以及使用本發(fā)明的熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白的保護作用的代表性實例。
[0040]圖18顯示了在肝切除和IR損傷操作后4周時實驗組和對照組中的組織學檢查。
[0041]圖19A顯示了在肝切除術和IR操作后的IR損傷組(對照組)大鼠以及已經用本發(fā)明的熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白治療的大鼠(Hb治療組)中發(fā)現的復發(fā)肝腫瘤的體積(cm3)。
[0042]圖19B顯示了在肝切除術和IR操作后的IR損傷大鼠(對照組)以及已經用本發(fā)明的熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白治療的大鼠(Hb組)的肝復發(fā)率(左)和平均復發(fā)腫瘤大小(右)。
[0043]圖20顯示了在肝切除術和缺血/再灌注操作后IR損傷組大鼠(對照組:C10和C13)和使用本發(fā)明的熱穩(wěn)定的交聯四聚體血紅蛋白治療的大鼠(Hb治療組:Y9、YlO和Yll)中誘發(fā)的肝內肝癌復發(fā)和轉移以及遠處肺轉移的代表性實例。
[0044]圖21顯示了在整個肝臟手術和再灌注中從第一次施用本發(fā)明的血紅蛋白產品或RA緩沖液(對照)起的肝氧分壓(_Hg)的代表性實例。
[0045]圖22顯示了在肝臟手術后用或不用本發(fā)明的血紅蛋白產品治療28天的情況下大鼠外周血中循環(huán)內皮祖細胞水平(EPC)的比較。
【具體實施方式】
[0046]血紅蛋白是哺乳動物和其他動物的血液的紅細胞中含鐵的氧運輸蛋白。血紅蛋白顯示蛋白的三級和四級結構兩者的特性。血紅蛋白中的大多數氨基酸形成由短的非螺旋段連接的α螺旋。氫鍵穩(wěn)定血紅蛋白內部的螺旋段，產生其分子內的吸引力，將每條多肽鏈折疊成特定的形狀。血紅蛋白分子由四個球狀蛋白亞基組裝而成。每個亞基由排列成一組α -螺旋結構段的多肽鏈構成，所述α -螺旋結構段以“肌紅蛋白折疊”排列方式與包埋的血紅素基團連接。
[0047]血紅素基團由固定在稱為卟啉的雜環(huán)中的鐵原子組成。鐵原子與位于一個平面中的環(huán)中心中的所有4個氮原子同等地結合。然后氧能夠結合于與卟啉環(huán)的平面垂直的鐵中心。因此，單個血紅蛋白分子具有與四個氧分子結合的能力。
[0048]在成人中，最常見類型的血紅蛋白是稱為血紅蛋白A的四聚體，其由稱為α2β2的兩個a和兩個β非共價結合的亞基組成，每個亞基分別由141和146個氨基酸殘基構成。a和β亞基的尺寸和結構彼此非常類似。對于總分子量為約65kDa的四聚體，每個亞基的分子量為約16kDa。四條多肽鏈通過鹽橋、氫鍵和疏水相互作用彼此結合。牛血紅蛋白的結構與人血紅蛋白類似(α鏈中的同一性為90.14% ；β鏈中的同一性為84.35% )。不同之處在于牛血紅蛋白中的兩個巰基位于β Cys93處，而人血紅蛋白中的巰基分別位于a Cysl04、β Cys93 和 β Cysll2 處。
[0049]在紅細胞內部的天然存在的血紅蛋白中，α鏈與其相應的β鏈的締合非常強并且在生理條件下不會離解。然而，在紅細胞外，一個α β 二聚體與另一個α β 二聚體的締合相當弱。該結合具有分裂成兩個α β 二聚體的傾向，每個二聚體為約32kDa。這些不需要的二聚體足夠小從而被腎臟過濾和排泄，結果造成潛在的腎損傷和并導致顯著減少的血管內滯留時間。
[0050]因此，從功效和安全性兩方面來看，穩(wěn)定在紅細胞外使用的任何血紅蛋白是必要的。下面概述了制備穩(wěn)定的血紅蛋白的方法；本發(fā)明的方法的概況呈現在圖1的流程圖中。
[0051]首先，選擇全血來源作為來自紅細胞的血紅蛋白的來源。選擇哺乳動物全血，包括，但不限于，人、牛、豬、馬和犬全血。將紅細胞與血漿分離、過濾、和洗滌以去除血漿蛋白雜質。
[0052]為了從紅細胞釋放血紅蛋白，需裂解細胞膜。盡管多種技術可以用來裂解紅細胞，但本發(fā)明利用可以以適合于工業(yè)規(guī)模生產的體積以精確受控的方式在低滲條件下的裂解。為此，圖2中所示的即時細胞裂解設備用來裂解紅細胞。低滲裂解形成溶胞產物溶液，其包含血紅蛋白和廢滲余物。為了能夠進行工業(yè)規(guī)模生產，小心地控制裂解作用使得僅紅細胞被裂解卻不裂解白細胞或其他細胞。在一個實施方案中，選擇即時細胞裂解設備的尺寸使得紅細胞在2-30秒內或另外地在足以裂解紅細胞的時間內(優(yōu)選30秒內)穿越該設備。所述即時細胞裂解設備包括靜`態(tài)混合器。去離子的和蒸餾的水用作低滲溶液。當然要理解使用具有不同的鹽濃度的其他低滲溶液將導致紅細胞裂解的時間段不同。由于受控的裂解步驟僅裂解紅細胞，不裂解白細胞或細胞性物質，因此其使毒性蛋白、磷脂或DNA從白細胞和其他細胞性物質的釋放最小化。在30秒后，即在含有紅細胞的溶液已經穿越即時細胞裂解設備的靜態(tài)混合器部分后，立即加入高滲溶液。得到的血紅蛋白與使用其他裂解技術得到的血紅蛋白相比具有較高的純度和較低水平的污染物諸如不合乎需要的DNA和磷脂。分別通過聚合酶鏈式反應(檢出限=64pg)和高效液相色譜(HPLC，檢出限=I μ g/mL)方法沒有在該血紅蛋白溶液中檢測到來自白細胞的不合乎需要的核酸和磷脂雜質。
[0053]進行兩個超濾過程:一個過程在流通柱色譜前去除分子量比血紅蛋白大的雜質，另一個過程在流通柱色譜后去除分子量比血紅蛋白小的雜質。后一超濾過程濃縮血紅蛋白。在一些實施方案中，IOOkDa濾器用于第一超濾過程，而30kDa濾器用于第二超濾過程。
[0054]流通柱色譜用來去除純化血紅蛋白溶液中的蛋白雜質諸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些實施方案中，通過使用一種市售離子交換柱或其組合來進行柱色譜，所述離子交換柱諸如DEAE柱、CM柱、羥基磷灰石柱等。用于柱色譜的典型pH為6-8.5。在一個實施方案中，使用流通CM柱色譜步驟在pH8.0去除蛋白雜質。進行酶聯免疫吸附測定(ELISA)以檢測從柱色譜洗脫后的樣品中殘留的蛋白雜質和磷脂。此獨特的流通柱色譜分離能夠實現連續(xù)的分離方案以進行工業(yè)規(guī)模生產。ELISA結果顯示在洗脫的血紅蛋白中這些雜質的量非常低(免疫球蛋白-G:44.3ng/mL ;白蛋白:20.37ng/mL ;碳酸酐酶:81.2 μ g/mL)。使用不同類型的柱采用不同的pH值去除蛋白雜質的結果顯示在下面的表1中。
[0055]表1
[0056]
【權利要求】
1.含有非聚合的、高度純化的和熱穩(wěn)定的氧載體的組合物在制備用于在哺乳動物中減少癌性腫瘤復發(fā)和/或最小化腫瘤細胞轉移的藥物中的用途，其中所述組合物包含具有檢測不到的二聚體濃度的交聯的四聚體血紅蛋白。
2.權利要求1所述的用途，其中所述組合物在手術去除腫瘤期間的中斷血液供應前和重建血液供應期間被施用于所述哺乳動物。
3.權利要求2所述的用途，其中所述組合物以大約0.2g/kg-l.2g/kg所述哺乳動物的體重的范圍施用。
4.權利要求1所述的用途，其中所述癌性腫瘤和腫瘤細胞是肝的或鼻咽的。
5.權利要求1所述的用途，其中所述癌性腫瘤和腫瘤細胞是低氧的。
6.權利要求1所述的用途，其中所述交聯的四聚體血紅蛋白具有60-70kDa的分子量和0.2-0.4%濃度的N-乙酰半胱氨酸。
7.權利要求6所述的用途，其中所述組合物不含引起血管收縮的雜質和蛋白雜質，是無致熱原的、無內毒素的、無磷脂的、無基質的和具有小于5%的高鐵血紅蛋白水平。
8.含有非聚合的、高度純化的和熱穩(wěn)定的氧載體的組合物在制備用于治療癌組織的藥物中的用途，其中所述組合物包含具有檢測不到的二聚體濃度的交聯的四聚體血紅蛋白。
9.權利要求8所述的用途，其中所述癌組織通過放射治療或化療治療來治療。
10.權利要求9所述的用途，其中所述組合物在所述癌組織的放射治療或化療治療前被施用于癌組織。
11.權利要求8所述的用途，其中所述癌組織是鼻咽癌或肝腫瘤。
12.權利要求8所述的用途，其中所述癌組織是低氧的。
13.權利要求8所述的用途，其中所述交聯的四聚體血紅蛋白具有60-70kDa的分子量和0.2-0.4%濃度的N-乙酰半胱氨酸。
14.權利要求13所述的用途，其中所述組合物不含引起血管收縮的雜質和蛋白雜質，是無致熱原的、無內毒素的、無磷脂的、無基質的和具有小于5%的高鐵血紅蛋白水平。
15.權利要求10所述的用途，其中所述組合物以約0.2-1.2g/kg體重的范圍和小于IOml/小時/kg體重的速率通過輸注施用。
16.含有非聚合的、高度純化的和熱穩(wěn)定的氧載體的組合物在制備用于增加癌組織的氧合的藥物中的用途，其中所述組合物包含具有檢測不到的二聚體濃度的交聯的四聚體血紅蛋白。
17.含有非聚合的、高度純化的和熱穩(wěn)定的氧載體的組合物在制備用于減少腫瘤尺寸的藥物中的用途，其中所述組合物包含具有檢測不到的二聚體濃度的交聯的四聚體血紅蛋白。
18.一種含有非聚合 的、高度純化的和熱穩(wěn)定的氧載體的組合物，其用于在哺乳動物中減少癌性腫瘤復發(fā)和/或最小化腫瘤細胞轉移，其中所述組合物包含具有檢測不到的二聚體濃度的交聯的四聚體血紅蛋白。
19.權利要求18所述的組合物，其中所述組合物在手術去除腫瘤期間的中斷血液供應前和重建血液供應期間被施用于所述哺乳動物。
20.權利要求19所述的組合物,其中所述組合物以大約0.2g/kg-l.2g/kg所述哺乳動物的體重的范圍施用。
21.權利要求18所述的組合物，其中所述交聯的四聚體血紅蛋白具有60-70kDa的分子量和0.2-0.4%濃度的N-乙酰半胱氨酸。
22.權利要求18所述的組合物，其中所述組合物不含引起血管收縮的雜質和蛋白雜質，是無致熱原的、無內毒素`的、無磷脂的、無基質的和具有小于5%的高鐵血紅蛋白水平。
【文檔編號】A61K47/48GK103687609SQ201280034336
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年7月11日 優(yōu)先權日:2011年7月11日
【發(fā)明者】黃炳镠, 郭瑞儀, 劉思行 申請人:億京國際有限公司