凍干海藻糖磷酸鈣bmp-2緩釋材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料及其制備方法，將骨誘導(dǎo)因子BMP-2與海藻糖溶液滴加到磷酸鈣支架材料表面，先置于-80°C冰箱中，預(yù)凍3小時(shí)后放入凍干機(jī)中進(jìn)一步凍干24小時(shí)即可。通過添加海藻糖提高磷酸鈣BMP-2緩釋材料中骨誘導(dǎo)因子的生物活性以及優(yōu)化骨誘導(dǎo)因子的緩釋速度，延長(zhǎng)骨誘導(dǎo)因子的保存時(shí)間，提高磷酸鈣生物支架材料構(gòu)建組織工程化骨的成骨效率。
【專利說明】?jī)龈珊Ｔ逄橇姿徕}BMP-2緩釋材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)，具體地說，涉及一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料及其制備以及在骨組織再生中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]骨組織缺損的修復(fù)與重建仍然是生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)面臨的重大難題，利用組織工程技術(shù)構(gòu)建骨組織為骨缺損的修復(fù)提供了新的思路。磷酸鈣(CPC)類支架材料是組織工程技術(shù)中常用的支架材料，具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，但缺乏骨誘導(dǎo)性。近年來，有學(xué)者通過凍干法將成骨誘導(dǎo)因子與磷酸鈣材料復(fù)合以增加材料的骨誘導(dǎo)性。這種方法雖然可以在一定程度上達(dá)到提高磷酸鈣類材料骨誘導(dǎo)性的效果，但是在凍干過程中所產(chǎn)生的冷凍和干燥壓力會(huì)破壞骨誘導(dǎo)因子的生物活性，并且在骨誘導(dǎo)因子和磷酸鈣材料之間產(chǎn)生較大的結(jié)合力使其很難從材料表面釋放而發(fā)揮促進(jìn)成骨的作用；同時(shí)在存放過程中骨誘導(dǎo)因子也易因溫度、PH值的變化和(或)酶的作用而發(fā)生進(jìn)一步的變性。為了能夠保護(hù)骨誘導(dǎo)因子的生物活性在凍干過程中不受影響，優(yōu)化骨誘導(dǎo)因子的釋放速度，并有效保存骨誘導(dǎo)因子的生物學(xué)活性，我們選擇對(duì)蛋白質(zhì)分子有保護(hù)作用的海藻糖為保護(hù)劑，嘗試通過凍干的方法將骨誘導(dǎo)因子(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，BMP-2)與磷酸鈣材料復(fù)合，并將這種方法制備的磷酸鈣緩釋材料與未添加海藻糖的磷酸鈣緩釋材料相對(duì)照，分析添加海藻糖后對(duì)骨誘導(dǎo)因子生物活性，緩釋速度以及成骨效果的影響，探索以海藻糖為保護(hù)劑通過凍干法在制備磷酸鈣骨誘導(dǎo)因子緩釋材料中的可行性。
[0003]為了優(yōu)化磷酸鈣BMP-2緩釋材料的緩釋效果，有研究先將白蛋白溶液預(yù)處理磷酸鈣材料，然后在復(fù)合BMP-2以減小BMP-2與磷酸鈣材料之間的結(jié)合力，從而促進(jìn)BMP-2的緩釋；也有研究將殼聚糖或者凝膠包裹BMP-2蛋白形成微球結(jié)構(gòu)，然后與磷酸鈣材料復(fù)合。雖然這些方法可以改善磷酸鈣BMP-2緩釋材料的緩釋效果，但是效果有限，且目前的研究都未曾對(duì)復(fù)合后以及釋放后的BMP-2的生物活性進(jìn)行明確的闡述，所制備的磷酸鈣BMP-2緩釋材料是否可以保存及保存有效期限亦未曾報(bào)道。本研究所采用的海藻糖(Trehalose)是生物組織的非特異性天然保護(hù)劑，屬于非滲透性低溫保護(hù)劑，可使生物體及生物大分子的活性在冷凍、高溫、脫水、高滲透壓及有毒試劑等環(huán)境中仍然能夠得以保持。目前其已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域，有學(xué)者將其用于保存血小板、細(xì)胞、組織、器官、疫苗、蛋白質(zhì)等，并取得了顯著的成果，但未曾應(yīng)用于緩釋材料的制備。發(fā)明人前期已經(jīng)將磷酸鈣材料用于骨組織缺損的修復(fù)，表現(xiàn)出良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性。通過此項(xiàng)研究，我們可以進(jìn)一步改善磷酸鈣類生物支架材料的骨誘導(dǎo)性，延長(zhǎng)骨誘導(dǎo)因子的保存時(shí)間，優(yōu)化骨誘導(dǎo)因子的緩釋速度，提高磷酸鈣生物支架材料構(gòu)建組織工程化骨的成骨效率。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的第一個(gè)目的是，提供一種具有優(yōu)良骨誘導(dǎo)性的磷酸鈣BMP-2緩釋材料。
[0005]本發(fā)明的第二個(gè)目的是，提供一種具有優(yōu)良骨誘導(dǎo)性的磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法。
[0006]本發(fā)明的第三個(gè)目的是，提供一種具有優(yōu)良骨誘導(dǎo)性的磷酸鈣BMP-2緩釋材料的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供海藻糖在促進(jìn)磷酸鈣BMP-2緩釋材料的骨誘導(dǎo)性中的應(yīng)用。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料，其特征在于，磷酸鈣BMP-2緩釋材料添加海藻糖。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將骨誘導(dǎo)因子BMP-2與海藻糖溶液滴加到磷酸鈣支架材料表面，先置于-80° C冰箱中，預(yù)凍3小時(shí)后放入凍干機(jī)中進(jìn)一步凍干24小時(shí)即可。
[0010]作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述骨誘導(dǎo)因子BMP-2的濃度是I mg/ml，所述海藻糖溶液的濃度是0.3 mol/1 ο
[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料在骨組織再生中的應(yīng)用。
[0012]為了實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)發(fā)明發(fā)明，本發(fā)明提供了海藻糖在促進(jìn)磷酸鈣BMP-2緩釋材料的骨誘導(dǎo)性中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，通過對(duì)凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料與未添加海藻糖的磷酸鈣BMP-2緩釋材料的生物學(xué)特性體內(nèi)外比較，探索凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料中骨誘導(dǎo)因子的生物活性和緩釋規(guī)律及其在再生醫(yī)學(xué)中的價(jià)值。研究結(jié)果表明凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料有如下的特點(diǎn):(1) BMP-2可以從磷酸鈣材料表面持續(xù)釋放。(2)凍干過程沒有對(duì)BMP-2的生物活性產(chǎn)生影響。(3)緩釋材料能夠較好的促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化。(4)添加海藻糖能夠延長(zhǎng)BMP-2的保存時(shí)間。(5)與骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合具有較好的促進(jìn)大鼠臨界大小顱骨缺損修復(fù)的能力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1.磷酸鈣緩釋生物支架材料的掃描電鏡觀察。分別為凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(A)、凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(B)、單純磷酸鈣支架材料(C)(標(biāo)尺為5μ m)。
[0015]圖2.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2) BMP-2緩釋曲線圖。
[0016]圖3.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2)所釋放BMP-2的生物活性分析。
[0017]圖4.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2)對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因的影響，分別為Runx2 (A)、OPN (B)、0CN (C),BSP (D) (*表示與Lyo-BMP-2材料組和單純CPC組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Ρ〈0.05)。
[0018]圖5.凍干海藻糖磷酸鈣ΒΜΡ-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2)對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響(*表示與單純細(xì)胞組(Blank組)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P〈0.05)。
[0019]圖6.不同存貯時(shí)間和溫度對(duì)凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP-2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre_BMP-2) BMP-2生物活性的影響(圖A:存貯2周，圖B:存貯5周；*表示與Lyo-Tre-BMP-2組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P〈0.05)。
[0020]圖7.4組細(xì)胞材料復(fù)合體植入大鼠顱骨缺損5周后的非脫鈣組織切片，分別為凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組(A: Lyo-Tre-BMP-2)、凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組(B: Lyo-BMP-2)、磷酸鈣材料+細(xì)胞組(C: bMSC/CPC)、單純磷酸鈣材料組(D:CPC) (200X)。(E)表示四組植入體成骨面積分析(*表示兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P〈0.05)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Samtoook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022]實(shí)施例1.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備及生物學(xué)特性 步驟一、海藻糖BMP-2溶液的配制
以無(wú)菌雙蒸水ddH20為溶劑,在超凈臺(tái)中按lmg/ml BMP-2, 0.3mol/l (113.5mg/ml)海藻糖的濃度配制海藻糖BMP-2的混合溶液，同時(shí)配制lmg/ml的BMP-2溶液。 [0023]步驟二、凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備和掃描電鏡觀察
(I)材料的制備:磷酸鈣(CPC)生物支架材料(直徑5mm，厚度2mm，孔隙率75%)高溫消毒備用，與海藻糖BMP-2溶液復(fù)合前24小時(shí)與無(wú)菌ddH20中浸泡以充分排出孔隙中的氣泡。用消毒濾紙吸出孔隙中的液體后滴加30 μ I海藻糖ΒΜΡ-2溶液,30min后待溶液完全吸入支架材料內(nèi)，將材料放入-80° C冰箱中預(yù)凍3小時(shí)，然后再置于冷凍干燥機(jī)中，繼續(xù)凍干24小時(shí)，即完成凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備。按同樣方法制備凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料。
[0024](2)材料掃描電鏡觀察:將制備的緩釋材料迅速置入戊二醛液中固定2小時(shí)，漂洗樣品3次，用餓酸固定樣品1.5-2小時(shí)，漂洗樣品3次，乙醇系列脫水，然后置于醋酸異戊酯中過渡，用臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥。最后，用離子真空噴度儀噴金，將噴金樣品置于掃描電鏡樣品室內(nèi)，抽真空后Philips SEM XL-30掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0025]步驟三、凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的生物學(xué)特性檢測(cè)
(I)材料BMP-2緩釋檢測(cè):將制備好的緩釋材料置于離心管中，加入Iml PBS溶液，于加入？85后的1小時(shí)、1、3、7、10、14、21、28天分別從離心管中吸取10(^1溶液，并置換為新的PBS溶液Iml。吸取的BMP-2溶液用BMP-2酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒檢測(cè)BMP-2的濃度，并根據(jù)初始BMP-2濃度計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)BMP-2的釋放百分比。
[0026](2)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng):無(wú)菌狀態(tài)下,取6周齡雄性Fischer 344大鼠胚骨和股骨，切除兩端干骺端，顯露骨髓腔，用含有肝素(200U/ml)、10%FBS的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，所得細(xì)胞懸液1200rpm離心5分鐘，吸去上清液和漂浮于液面的脂肪。加DMEM培養(yǎng)液，均勻吹散至10ml，接種于直徑為IOcm的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)條件為37° C，100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)增殖成單層細(xì)胞后，吸去培養(yǎng)液，PBS輕搖洗兩次后用0.25%胰蛋白酶液消化，收集細(xì)胞于無(wú)菌離心管。離心去上清液并加入培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)皿中。同樣的方法進(jìn)行二次傳代，取第三代細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
[0027](3)緩釋液BMP-2生物活性檢測(cè)
收集前7天的BMP-2緩釋液用于BMP-2生物活性檢測(cè)。將第三代骨髓基質(zhì)細(xì)胞以
2.0 X IO4每孔的密度接種于48孔板，24小時(shí)后，培養(yǎng)液換為含5%FBS的DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)加入100ng/ml的BMP-2緩釋液，以相同濃度的新鮮BMP-2為陽(yáng)性對(duì)照；培養(yǎng)3、7、14天后用Triton X-100分別裂解細(xì)胞，用ALP定量試劑盒檢測(cè)經(jīng)BMP-2緩釋液誘導(dǎo)后ALP蛋白的表達(dá)，同時(shí)用BCA法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白的表達(dá)，計(jì)算ALP在總蛋白中的百分比以確定BMP-2的生物活性。
[0028](4)材料對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響
將第三代骨髓基質(zhì)細(xì)胞以lX105cell/ml的密度接種于6孔的Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)(上層為材料，下層為細(xì)胞)，加入DMEM培養(yǎng)液(完全覆蓋材料)，培養(yǎng)3、7、14天后提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)cDNA，進(jìn)行realtime-PCR反應(yīng)(ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀)。各基因及引物設(shè)計(jì)如下:Runx2 S: 5 ’ -GCTTCTCCAACCCACGAATG-3，，Runx2A: 5’ -GAACTGATAGGACGCTGACGA-3’ ; OPN S: 5’ -GACGGCCGAGGTGATAGCTT-3’ ， OPNA: 5’ -CATGGCTGGTCTTCCCGTTGC-3’，OCN S: 5’ -AAAGCCCAGCGACTCT-3’，OCN A:5’ -CTAAACGGTGGTGCCATAGAT-3’ ; BSP S: 5’ -GATAGTTCGGAGGAGGAGGG-3’ ， BSP A:5’ -CTAACTCCAACTTTCCAGCGT-3’ ; GAPDH S: 5’ -CCTGCACCACCAACTGCTTA-3’ ， GAPDH A:5’ -GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3’，退火溫度 58。C，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小分別是 212bp、208bp、232bp、172bp、140bp?；虮磉_(dá)變化以未放置任何材料的單純細(xì)胞為對(duì)照。
[0029](5)材料對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響
將第三代骨髓基質(zhì)細(xì)胞以5X 104cell/ml的密度接種于6孔的Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)(上層為材料，下層為細(xì)胞)，加入DMEM培養(yǎng)液(完全覆蓋材料)，培養(yǎng)1、3、7、14天后用細(xì)胞增殖試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中DNA含量的變化以確定細(xì)胞增殖情況，以未放置任何材料的單純細(xì)胞為對(duì)照。
[0030](6)存貯時(shí)間和溫度對(duì)BMP-2生物活性的影響
緩釋材料密封在離心管中分別放置于-20° C、4° C、25° C的環(huán)境溫度下，2周和5周后分別取出置于PBS溶液中一周，取100ng/ml BMP-2緩釋液檢測(cè)其生物學(xué)活性，方法同步驟三(3)，以相同濃度的新鮮BMP-2為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算材料組ALP含量與新鮮BMP-2組ALP
含量百分比。
[0031]實(shí)施例2.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料復(fù)合骨髓基質(zhì)細(xì)胞修復(fù)大鼠臨界大小顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)
步驟一、材料與細(xì)胞復(fù)合
將如前所述的第三代大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞制成細(xì)胞密度為20X 106/ml的細(xì)胞懸液，緩慢滴加到材料表面至飽和狀態(tài)，復(fù)合后的細(xì)胞支架材料復(fù)合物即刻植入。
[0032]步驟二、大鼠顱骨缺損修復(fù)
取上述所構(gòu)建的組織工程復(fù)合體植入大鼠顱骨臨界大小骨缺損，實(shí)驗(yàn)按照隨機(jī)原則分為:凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組(η = 12)，凍干磷酸鈣ΒΜΡ-2緩釋材料+細(xì)胞組(η = 12)，磷酸鈣材料+細(xì)胞組(η = 12)，單純磷酸鈣材料組(η = 12)。觀察時(shí)間為5周。取12周齡雄性Fischer 344大鼠,全麻下頡頂骨部皮膚備皮,消毒后沿矢狀向切開皮膚黏膜，在左右顱頂骨分別制備直徑為5mm的全層缺損，分別將各組復(fù)合體植入缺損部位，分層縫合，術(shù)后青霉素30萬(wàn)單位肌注3天，預(yù)防感染。術(shù)后5周取材。
[0033]步驟三、組織病理學(xué)觀察
標(biāo)本處理過程如下:①固定:10%甲醛溶液固定3d，自來水沖洗過夜梯度酒精脫水:75%，85%，90%, 95%，100% 5個(gè)梯度對(duì)標(biāo)本行脫水處理。每個(gè)梯度2d 透明化:棄酒精，將標(biāo)本放在甲苯中浸泡4h ;④包埋:將標(biāo)本放入單體中，單體應(yīng)高于標(biāo)本頂部1-1.5cm，加入固化單體(最為催化劑)，在干燥器內(nèi)抽氣處理(防止產(chǎn)生氣泡)，4° C放置一周，室溫下放置至單體變粘稠，轉(zhuǎn)入37° C烘箱內(nèi)至單體硬化。⑤硬組織切片:MMA完全硬化后，采用LeicaSP1600硬組織切片機(jī)切片，切片厚度為150 μ m,打磨至50 μ m,封片，拋光?？辔端?品紅(Van Geison)染色:①超聲洗片2min 將切片放置在0.1 %甲酸溶液中3min，水沖洗切片2min。③將切片放置20%甲醇溶液中，2h，擦干。④60° C Stevenol藍(lán)染色5_15min，流水沖洗切片2 mirio⑤Van Geison—苦味酸品紅染色3_8min, 100%乙醇清洗；蒸懼水洗，晾干。切片在40X下整體統(tǒng)計(jì)新骨形成面積百分比。
[0034]統(tǒng)計(jì)方法:組間差異采用ANOVA和SNK法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有統(tǒng)計(jì)過程均在SAS
6.12統(tǒng)計(jì)分析軟件中進(jìn)行。P〈0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0035]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
材料電鏡觀察:凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料表面可見玻璃態(tài)的海藻糖晶體和BMP-2顆粒(圖1A)，凍干磷酸`鈣BMP-2緩釋材料表面可見大量的BMP-2顆粒緊密粘附在磷酸鈣晶體表面(圖1B)，磷酸鈣材料的表面為成簇的片狀磷灰石晶體(圖1C)。
[0036]材料BMP-2緩釋曲線:凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料能夠持續(xù)釋放BMP-2，未見明顯的平臺(tái)期，28天的累積釋放量超過50%;而凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料的釋放速度較慢，10天后基本進(jìn)入平臺(tái)期,28天累積釋放量不足30% (圖2)。
[0037]凍干對(duì)BMP-2生物活性的影響:BMP-2緩釋液與細(xì)胞培養(yǎng)后的3、7、14天，凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料所釋放的BMP-2與新鮮BMP-2的活性未見明顯差別(P>0.05)，而凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料所釋放的BMP-2活性明顯低于其他兩組(P〈0.05)，說明凍干過程中添加海藻糖可以保護(hù)BMP-2，使其活性不受影響(圖3)。
[0038]材料對(duì)細(xì)胞成骨分化的影響:骨髓基質(zhì)細(xì)胞與凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料共培養(yǎng)，細(xì)胞中Runx2、OPN mRNA的表達(dá)較凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料組在第3、7、14天時(shí)均明顯升高(P〈0.05)，0CN、BSP mRNA的表達(dá)在第14天時(shí)明顯升高(P〈0.05)，細(xì)胞與單純磷酸鈣材料共培養(yǎng)時(shí)成骨相關(guān)基因的表達(dá)均維持在較低水平(圖4)。
[0039]材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響:骨髓基質(zhì)細(xì)胞與材料共培養(yǎng)1、3天后，各組細(xì)胞增殖情況沒有明顯差異，共培養(yǎng)7、14天后凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料組、凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料組、單純磷酸鈣材料組均明顯高于單純細(xì)胞組(P〈0.05),而三材料組之間無(wú)明顯差異(Ρ>0.05)(圖 5)。
[0040]存貯條件對(duì)BMP-2生物活性的影響:緩釋材料在-20° C、4° C、25° C的環(huán)境溫度下，經(jīng)過2周和5周的存放后，其中凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料中BMP-2的生物活性都有明顯的下降(P〈0.05)，而凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料中BMP-2的活性得到了較好的保持(圖6)。
[0041]大鼠顱骨臨界大小骨缺損修復(fù)組織學(xué)觀察:根據(jù)5周取材后非脫鈣組織標(biāo)本光鏡觀察新骨形成面積百分比情況，其中凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組明顯高于凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組、磷酸鈣材料+細(xì)胞組和單純材料組(P〈0.05)，而凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組高于磷酸鈣材料+細(xì)胞組和單純材料組(P〈0.05)，磷酸鈣材料+細(xì)胞組則高于單純材料組(P〈0.05)(圖7)。
[0042]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料，其特征在于，磷酸鈣BMP-2緩釋材料添加海藻糖。
2.權(quán)利要求1所述的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將骨誘導(dǎo)因子BMP-2與海藻糖溶液滴加到磷酸鈣支架材料表面，先置于-80° C冰箱中，預(yù)凍3小時(shí)后放入凍干機(jī)中進(jìn)一步凍干24小時(shí)即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述骨誘導(dǎo)因子BMP-2的濃度是I mg/ml，所述海藻糖溶液的濃度是0.3 mol/1。
4.權(quán)利要求1所述的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料在骨組織再生中的應(yīng)用。
5.海藻糖在促進(jìn)磷酸鈣BMP-2緩釋材料的骨誘導(dǎo)性中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61L27/28GK103768657SQ201210408022
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月24日
【發(fā)明者】趙君, 沈剛, 張志愿, 蔣欣泉, 王紹義, 張秀麗 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院