两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

凍干海藻糖磷酸鈣bmp-2緩釋材料及其制備方法

文檔序號(hào):1242506閱讀:636來源:國(guó)知局
凍干海藻糖磷酸鈣bmp-2緩釋材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料及其制備方法,將骨誘導(dǎo)因子BMP-2與海藻糖溶液滴加到磷酸鈣支架材料表面,先置于-80°C冰箱中,預(yù)凍3小時(shí)后放入凍干機(jī)中進(jìn)一步凍干24小時(shí)即可。通過添加海藻糖提高磷酸鈣BMP-2緩釋材料中骨誘導(dǎo)因子的生物活性以及優(yōu)化骨誘導(dǎo)因子的緩釋速度,延長(zhǎng)骨誘導(dǎo)因子的保存時(shí)間,提高磷酸鈣生物支架材料構(gòu)建組織工程化骨的成骨效率。
【專利說明】?jī)龈珊T逄橇姿徕}BMP-2緩釋材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程技術(shù),具體地說,涉及一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料及其制備以及在骨組織再生中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]骨組織缺損的修復(fù)與重建仍然是生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)面臨的重大難題,利用組織工程技術(shù)構(gòu)建骨組織為骨缺損的修復(fù)提供了新的思路。磷酸鈣(CPC)類支架材料是組織工程技術(shù)中常用的支架材料,具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性,但缺乏骨誘導(dǎo)性。近年來,有學(xué)者通過凍干法將成骨誘導(dǎo)因子與磷酸鈣材料復(fù)合以增加材料的骨誘導(dǎo)性。這種方法雖然可以在一定程度上達(dá)到提高磷酸鈣類材料骨誘導(dǎo)性的效果,但是在凍干過程中所產(chǎn)生的冷凍和干燥壓力會(huì)破壞骨誘導(dǎo)因子的生物活性,并且在骨誘導(dǎo)因子和磷酸鈣材料之間產(chǎn)生較大的結(jié)合力使其很難從材料表面釋放而發(fā)揮促進(jìn)成骨的作用;同時(shí)在存放過程中骨誘導(dǎo)因子也易因溫度、PH值的變化和(或)酶的作用而發(fā)生進(jìn)一步的變性。為了能夠保護(hù)骨誘導(dǎo)因子的生物活性在凍干過程中不受影響,優(yōu)化骨誘導(dǎo)因子的釋放速度,并有效保存骨誘導(dǎo)因子的生物學(xué)活性,我們選擇對(duì)蛋白質(zhì)分子有保護(hù)作用的海藻糖為保護(hù)劑,嘗試通過凍干的方法將骨誘導(dǎo)因子(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2,BMP-2)與磷酸鈣材料復(fù)合,并將這種方法制備的磷酸鈣緩釋材料與未添加海藻糖的磷酸鈣緩釋材料相對(duì)照,分析添加海藻糖后對(duì)骨誘導(dǎo)因子生物活性,緩釋速度以及成骨效果的影響,探索以海藻糖為保護(hù)劑通過凍干法在制備磷酸鈣骨誘導(dǎo)因子緩釋材料中的可行性。
[0003]為了優(yōu)化磷酸鈣BMP-2緩釋材料的緩釋效果,有研究先將白蛋白溶液預(yù)處理磷酸鈣材料,然后在復(fù)合BMP-2以減小BMP-2與磷酸鈣材料之間的結(jié)合力,從而促進(jìn)BMP-2的緩釋;也有研究將殼聚糖或者凝膠包裹BMP-2蛋白形成微球結(jié)構(gòu),然后與磷酸鈣材料復(fù)合。雖然這些方法可以改善磷酸鈣BMP-2緩釋材料的緩釋效果,但是效果有限,且目前的研究都未曾對(duì)復(fù)合后以及釋放后的BMP-2的生物活性進(jìn)行明確的闡述,所制備的磷酸鈣BMP-2緩釋材料是否可以保存及保存有效期限亦未曾報(bào)道。本研究所采用的海藻糖(Trehalose)是生物組織的非特異性天然保護(hù)劑,屬于非滲透性低溫保護(hù)劑,可使生物體及生物大分子的活性在冷凍、高溫、脫水、高滲透壓及有毒試劑等環(huán)境中仍然能夠得以保持。目前其已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域,有學(xué)者將其用于保存血小板、細(xì)胞、組織、器官、疫苗、蛋白質(zhì)等,并取得了顯著的成果,但未曾應(yīng)用于緩釋材料的制備。發(fā)明人前期已經(jīng)將磷酸鈣材料用于骨組織缺損的修復(fù),表現(xiàn)出良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性。通過此項(xiàng)研究,我們可以進(jìn)一步改善磷酸鈣類生物支架材料的骨誘導(dǎo)性,延長(zhǎng)骨誘導(dǎo)因子的保存時(shí)間,優(yōu)化骨誘導(dǎo)因子的緩釋速度,提高磷酸鈣生物支架材料構(gòu)建組織工程化骨的成骨效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的第一個(gè)目的是,提供一種具有優(yōu)良骨誘導(dǎo)性的磷酸鈣BMP-2緩釋材料。
[0005]本發(fā)明的第二個(gè)目的是,提供一種具有優(yōu)良骨誘導(dǎo)性的磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法。
[0006]本發(fā)明的第三個(gè)目的是,提供一種具有優(yōu)良骨誘導(dǎo)性的磷酸鈣BMP-2緩釋材料的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的第四個(gè)目的是,提供海藻糖在促進(jìn)磷酸鈣BMP-2緩釋材料的骨誘導(dǎo)性中的應(yīng)用。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)發(fā)明目的,本發(fā)明提供了一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料,其特征在于,磷酸鈣BMP-2緩釋材料添加海藻糖。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)發(fā)明目的,本發(fā)明提供了凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:將骨誘導(dǎo)因子BMP-2與海藻糖溶液滴加到磷酸鈣支架材料表面,先置于-80° C冰箱中,預(yù)凍3小時(shí)后放入凍干機(jī)中進(jìn)一步凍干24小時(shí)即可。
[0010]作為一個(gè)優(yōu)選方案,所述骨誘導(dǎo)因子BMP-2的濃度是I mg/ml,所述海藻糖溶液的濃度是0.3 mol/1 ο
[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)發(fā)明目的,本發(fā)明提供了的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料在骨組織再生中的應(yīng)用。
[0012]為了實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)發(fā)明發(fā)明,本發(fā)明提供了海藻糖在促進(jìn)磷酸鈣BMP-2緩釋材料的骨誘導(dǎo)性中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于,通過對(duì)凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料與未添加海藻糖的磷酸鈣BMP-2緩釋材料的生物學(xué)特性體內(nèi)外比較,探索凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料中骨誘導(dǎo)因子的生物活性和緩釋規(guī)律及其在再生醫(yī)學(xué)中的價(jià)值。研究結(jié)果表明凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料有如下的特點(diǎn):(1) BMP-2可以從磷酸鈣材料表面持續(xù)釋放。(2)凍干過程沒有對(duì)BMP-2的生物活性產(chǎn)生影響。(3)緩釋材料能夠較好的促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化。(4)添加海藻糖能夠延長(zhǎng)BMP-2的保存時(shí)間。(5)與骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合具有較好的促進(jìn)大鼠臨界大小顱骨缺損修復(fù)的能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1.磷酸鈣緩釋生物支架材料的掃描電鏡觀察。分別為凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(A)、凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(B)、單純磷酸鈣支架材料(C)(標(biāo)尺為5μ m)。
[0015]圖2.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2) BMP-2緩釋曲線圖。
[0016]圖3.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2)所釋放BMP-2的生物活性分析。
[0017]圖4.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2)對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因的影響,分別為Runx2 (A)、OPN (B)、0CN (C),BSP (D) (*表示與Lyo-BMP-2材料組和單純CPC組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Ρ〈0.05)。
[0018]圖5.凍干海藻糖磷酸鈣ΒΜΡ-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP_2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-BMP-2)對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響(*表示與單純細(xì)胞組(Blank組)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P〈0.05)。
[0019]圖6.不同存貯時(shí)間和溫度對(duì)凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre-BMP-2)與凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料(Lyo-Tre_BMP-2) BMP-2生物活性的影響(圖A:存貯2周,圖B:存貯5周;*表示與Lyo-Tre-BMP-2組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P〈0.05)。
[0020]圖7.4組細(xì)胞材料復(fù)合體植入大鼠顱骨缺損5周后的非脫鈣組織切片,分別為凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組(A: Lyo-Tre-BMP-2)、凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組(B: Lyo-BMP-2)、磷酸鈣材料+細(xì)胞組(C: bMSC/CPC)、單純磷酸鈣材料組(D:CPC) (200X)。(E)表示四組植入體成骨面積分析(*表示兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P〈0.05)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無(wú)特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如Samtoook等人,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0022]實(shí)施例1.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備及生物學(xué)特性 步驟一、海藻糖BMP-2溶液的配制
以無(wú)菌雙蒸水ddH20為溶劑,在超凈臺(tái)中按lmg/ml BMP-2, 0.3mol/l (113.5mg/ml)海藻糖的濃度配制海藻糖BMP-2的混合溶液,同時(shí)配制lmg/ml的BMP-2溶液。 [0023]步驟二、凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備和掃描電鏡觀察
(I)材料的制備:磷酸鈣(CPC)生物支架材料(直徑5mm,厚度2mm,孔隙率75%)高溫消毒備用,與海藻糖BMP-2溶液復(fù)合前24小時(shí)與無(wú)菌ddH20中浸泡以充分排出孔隙中的氣泡。用消毒濾紙吸出孔隙中的液體后滴加30 μ I海藻糖ΒΜΡ-2溶液,30min后待溶液完全吸入支架材料內(nèi),將材料放入-80° C冰箱中預(yù)凍3小時(shí),然后再置于冷凍干燥機(jī)中,繼續(xù)凍干24小時(shí),即完成凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備。按同樣方法制備凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料。
[0024](2)材料掃描電鏡觀察:將制備的緩釋材料迅速置入戊二醛液中固定2小時(shí),漂洗樣品3次,用餓酸固定樣品1.5-2小時(shí),漂洗樣品3次,乙醇系列脫水,然后置于醋酸異戊酯中過渡,用臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥。最后,用離子真空噴度儀噴金,將噴金樣品置于掃描電鏡樣品室內(nèi),抽真空后Philips SEM XL-30掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0025]步驟三、凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的生物學(xué)特性檢測(cè)
(I)材料BMP-2緩釋檢測(cè):將制備好的緩釋材料置于離心管中,加入Iml PBS溶液,于加入?85后的1小時(shí)、1、3、7、10、14、21、28天分別從離心管中吸取10(^1溶液,并置換為新的PBS溶液Iml。吸取的BMP-2溶液用BMP-2酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒檢測(cè)BMP-2的濃度,并根據(jù)初始BMP-2濃度計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)BMP-2的釋放百分比。
[0026](2)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng):無(wú)菌狀態(tài)下,取6周齡雄性Fischer 344大鼠胚骨和股骨,切除兩端干骺端,顯露骨髓腔,用含有肝素(200U/ml)、10%FBS的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,所得細(xì)胞懸液1200rpm離心5分鐘,吸去上清液和漂浮于液面的脂肪。加DMEM培養(yǎng)液,均勻吹散至10ml,接種于直徑為IOcm的培養(yǎng)皿中,置于培養(yǎng)條件為37° C,100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)增殖成單層細(xì)胞后,吸去培養(yǎng)液,PBS輕搖洗兩次后用0.25%胰蛋白酶液消化,收集細(xì)胞于無(wú)菌離心管。離心去上清液并加入培養(yǎng)液,接種于培養(yǎng)皿中。同樣的方法進(jìn)行二次傳代,取第三代細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
[0027](3)緩釋液BMP-2生物活性檢測(cè)
收集前7天的BMP-2緩釋液用于BMP-2生物活性檢測(cè)。將第三代骨髓基質(zhì)細(xì)胞以
2.0 X IO4每孔的密度接種于48孔板,24小時(shí)后,培養(yǎng)液換為含5%FBS的DMEM培養(yǎng)液,同時(shí)加入100ng/ml的BMP-2緩釋液,以相同濃度的新鮮BMP-2為陽(yáng)性對(duì)照;培養(yǎng)3、7、14天后用Triton X-100分別裂解細(xì)胞,用ALP定量試劑盒檢測(cè)經(jīng)BMP-2緩釋液誘導(dǎo)后ALP蛋白的表達(dá),同時(shí)用BCA法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白的表達(dá),計(jì)算ALP在總蛋白中的百分比以確定BMP-2的生物活性。
[0028](4)材料對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響
將第三代骨髓基質(zhì)細(xì)胞以lX105cell/ml的密度接種于6孔的Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)(上層為材料,下層為細(xì)胞),加入DMEM培養(yǎng)液(完全覆蓋材料),培養(yǎng)3、7、14天后提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)cDNA,進(jìn)行realtime-PCR反應(yīng)(ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀)。各基因及引物設(shè)計(jì)如下:Runx2 S: 5 ’ -GCTTCTCCAACCCACGAATG-3,,Runx2A: 5’ -GAACTGATAGGACGCTGACGA-3’ ; OPN S: 5’ -GACGGCCGAGGTGATAGCTT-3’ , OPNA: 5’ -CATGGCTGGTCTTCCCGTTGC-3’,OCN S: 5’ -AAAGCCCAGCGACTCT-3’,OCN A:5’ -CTAAACGGTGGTGCCATAGAT-3’ ; BSP S: 5’ -GATAGTTCGGAGGAGGAGGG-3’ , BSP A:5’ -CTAACTCCAACTTTCCAGCGT-3’ ; GAPDH S: 5’ -CCTGCACCACCAACTGCTTA-3’ , GAPDH A:5’ -GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3’,退火溫度 58。C,預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小分別是 212bp、208bp、232bp、172bp、140bp?;虮磉_(dá)變化以未放置任何材料的單純細(xì)胞為對(duì)照。
[0029](5)材料對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響
將第三代骨髓基質(zhì)細(xì)胞以5X 104cell/ml的密度接種于6孔的Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)(上層為材料,下層為細(xì)胞),加入DMEM培養(yǎng)液(完全覆蓋材料),培養(yǎng)1、3、7、14天后用細(xì)胞增殖試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中DNA含量的變化以確定細(xì)胞增殖情況,以未放置任何材料的單純細(xì)胞為對(duì)照。
[0030](6)存貯時(shí)間和溫度對(duì)BMP-2生物活性的影響
緩釋材料密封在離心管中分別放置于-20° C、4° C、25° C的環(huán)境溫度下,2周和5周后分別取出置于PBS溶液中一周,取100ng/ml BMP-2緩釋液檢測(cè)其生物學(xué)活性,方法同步驟三(3),以相同濃度的新鮮BMP-2為陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算材料組ALP含量與新鮮BMP-2組ALP
含量百分比。
[0031]實(shí)施例2.凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料復(fù)合骨髓基質(zhì)細(xì)胞修復(fù)大鼠臨界大小顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)
步驟一、材料與細(xì)胞復(fù)合
將如前所述的第三代大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞制成細(xì)胞密度為20X 106/ml的細(xì)胞懸液,緩慢滴加到材料表面至飽和狀態(tài),復(fù)合后的細(xì)胞支架材料復(fù)合物即刻植入。
[0032]步驟二、大鼠顱骨缺損修復(fù)
取上述所構(gòu)建的組織工程復(fù)合體植入大鼠顱骨臨界大小骨缺損,實(shí)驗(yàn)按照隨機(jī)原則分為:凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組(η = 12),凍干磷酸鈣ΒΜΡ-2緩釋材料+細(xì)胞組(η = 12),磷酸鈣材料+細(xì)胞組(η = 12),單純磷酸鈣材料組(η = 12)。觀察時(shí)間為5周。取12周齡雄性Fischer 344大鼠,全麻下頡頂骨部皮膚備皮,消毒后沿矢狀向切開皮膚黏膜,在左右顱頂骨分別制備直徑為5mm的全層缺損,分別將各組復(fù)合體植入缺損部位,分層縫合,術(shù)后青霉素30萬(wàn)單位肌注3天,預(yù)防感染。術(shù)后5周取材。
[0033]步驟三、組織病理學(xué)觀察
標(biāo)本處理過程如下:①固定:10%甲醛溶液固定3d,自來水沖洗過夜梯度酒精脫水:75%,85%,90%, 95%,100% 5個(gè)梯度對(duì)標(biāo)本行脫水處理。每個(gè)梯度2d 透明化:棄酒精,將標(biāo)本放在甲苯中浸泡4h ;④包埋:將標(biāo)本放入單體中,單體應(yīng)高于標(biāo)本頂部1-1.5cm,加入固化單體(最為催化劑),在干燥器內(nèi)抽氣處理(防止產(chǎn)生氣泡),4° C放置一周,室溫下放置至單體變粘稠,轉(zhuǎn)入37° C烘箱內(nèi)至單體硬化。⑤硬組織切片:MMA完全硬化后,采用LeicaSP1600硬組織切片機(jī)切片,切片厚度為150 μ m,打磨至50 μ m,封片,拋光??辔端?品紅(Van Geison)染色:①超聲洗片2min 將切片放置在0.1 %甲酸溶液中3min,水沖洗切片2min。③將切片放置20%甲醇溶液中,2h,擦干。④60° C Stevenol藍(lán)染色5_15min,流水沖洗切片2 mirio⑤Van Geison—苦味酸品紅染色3_8min, 100%乙醇清洗;蒸懼水洗,晾干。切片在40X下整體統(tǒng)計(jì)新骨形成面積百分比。
[0034]統(tǒng)計(jì)方法:組間差異采用ANOVA和SNK法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有統(tǒng)計(jì)過程均在SAS
6.12統(tǒng)計(jì)分析軟件中進(jìn)行。P〈0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0035]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
材料電鏡觀察:凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料表面可見玻璃態(tài)的海藻糖晶體和BMP-2顆粒(圖1A),凍干磷酸`鈣BMP-2緩釋材料表面可見大量的BMP-2顆粒緊密粘附在磷酸鈣晶體表面(圖1B),磷酸鈣材料的表面為成簇的片狀磷灰石晶體(圖1C)。
[0036]材料BMP-2緩釋曲線:凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料能夠持續(xù)釋放BMP-2,未見明顯的平臺(tái)期,28天的累積釋放量超過50%;而凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料的釋放速度較慢,10天后基本進(jìn)入平臺(tái)期,28天累積釋放量不足30% (圖2)。
[0037]凍干對(duì)BMP-2生物活性的影響:BMP-2緩釋液與細(xì)胞培養(yǎng)后的3、7、14天,凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料所釋放的BMP-2與新鮮BMP-2的活性未見明顯差別(P>0.05),而凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料所釋放的BMP-2活性明顯低于其他兩組(P〈0.05),說明凍干過程中添加海藻糖可以保護(hù)BMP-2,使其活性不受影響(圖3)。
[0038]材料對(duì)細(xì)胞成骨分化的影響:骨髓基質(zhì)細(xì)胞與凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料共培養(yǎng),細(xì)胞中Runx2、OPN mRNA的表達(dá)較凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料組在第3、7、14天時(shí)均明顯升高(P〈0.05),0CN、BSP mRNA的表達(dá)在第14天時(shí)明顯升高(P〈0.05),細(xì)胞與單純磷酸鈣材料共培養(yǎng)時(shí)成骨相關(guān)基因的表達(dá)均維持在較低水平(圖4)。
[0039]材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響:骨髓基質(zhì)細(xì)胞與材料共培養(yǎng)1、3天后,各組細(xì)胞增殖情況沒有明顯差異,共培養(yǎng)7、14天后凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料組、凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料組、單純磷酸鈣材料組均明顯高于單純細(xì)胞組(P〈0.05),而三材料組之間無(wú)明顯差異(Ρ>0.05)(圖 5)。
[0040]存貯條件對(duì)BMP-2生物活性的影響:緩釋材料在-20° C、4° C、25° C的環(huán)境溫度下,經(jīng)過2周和5周的存放后,其中凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料中BMP-2的生物活性都有明顯的下降(P〈0.05),而凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料中BMP-2的活性得到了較好的保持(圖6)。
[0041]大鼠顱骨臨界大小骨缺損修復(fù)組織學(xué)觀察:根據(jù)5周取材后非脫鈣組織標(biāo)本光鏡觀察新骨形成面積百分比情況,其中凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組明顯高于凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組、磷酸鈣材料+細(xì)胞組和單純材料組(P〈0.05),而凍干磷酸鈣BMP-2緩釋材料+細(xì)胞組高于磷酸鈣材料+細(xì)胞組和單純材料組(P〈0.05),磷酸鈣材料+細(xì)胞組則高于單純材料組(P〈0.05)(圖7)。
[0042]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾,這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料,其特征在于,磷酸鈣BMP-2緩釋材料添加海藻糖。
2.權(quán)利要求1所述的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:將骨誘導(dǎo)因子BMP-2與海藻糖溶液滴加到磷酸鈣支架材料表面,先置于-80° C冰箱中,預(yù)凍3小時(shí)后放入凍干機(jī)中進(jìn)一步凍干24小時(shí)即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料的制備方法,其特征在于,所述骨誘導(dǎo)因子BMP-2的濃度是I mg/ml,所述海藻糖溶液的濃度是0.3 mol/1。
4.權(quán)利要求1所述的凍干海藻糖磷酸鈣BMP-2緩釋材料在骨組織再生中的應(yīng)用。
5.海藻糖在促進(jìn)磷酸鈣BMP-2緩釋材料的骨誘導(dǎo)性中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61L27/28GK103768657SQ201210408022
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月24日
【發(fā)明者】趙君, 沈剛, 張志愿, 蔣欣泉, 王紹義, 張秀麗 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日本wwww免费看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 热re99久久国产66热| 天堂俺去俺来也www色官网| 免费黄频网站在线观看国产| 久久久国产精品麻豆| 日韩大码丰满熟妇| 中国国产av一级| 2021少妇久久久久久久久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| a级片在线免费高清观看视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲成人手机| 亚洲伊人色综图| 捣出白浆h1v1| 老鸭窝网址在线观看| 国产一区二区三区av在线| 国产一区二区三区av在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 看免费成人av毛片| 深夜精品福利| 国产一区二区三区综合在线观看| 五月开心婷婷网| 亚洲人成77777在线视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产在线免费精品| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 色94色欧美一区二区| 99国产精品免费福利视频| 欧美精品一区二区大全| 精品欧美一区二区三区在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品一区二区精品视频观看| 两个人免费观看高清视频| 国产成人精品久久久久久| 免费不卡黄色视频| 国产精品熟女久久久久浪| 丝袜喷水一区| 中文字幕人妻丝袜制服| 一边亲一边摸免费视频| 久热爱精品视频在线9| 男女无遮挡免费网站观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产伦理片在线播放av一区| 观看av在线不卡| 精品一区二区三区av网在线观看 | 十分钟在线观看高清视频www| 午夜福利视频精品| 丝袜在线中文字幕| 国产免费现黄频在线看| 亚洲免费av在线视频| netflix在线观看网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 香蕉丝袜av| 色婷婷av一区二区三区视频| 在现免费观看毛片| 18禁国产床啪视频网站| 视频在线观看一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 国产精品一二三区在线看| 1024香蕉在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 制服人妻中文乱码| 老司机靠b影院| 欧美人与善性xxx| 国产黄频视频在线观看| 丁香六月欧美| 国产亚洲精品第一综合不卡| 永久免费av网站大全| 啦啦啦在线观看免费高清www| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产爽快片一区二区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩一级在线毛片| 久久青草综合色| 美女视频免费永久观看网站| 久久久国产精品麻豆| 国产麻豆69| 午夜日韩欧美国产| 国产xxxxx性猛交| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 大码成人一级视频| 一级黄色大片毛片| 1024香蕉在线观看| av福利片在线| 高清欧美精品videossex| 国产高清视频在线播放一区 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 午夜久久久在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 91九色精品人成在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲成人免费电影在线观看 | 亚洲欧美清纯卡通| 精品一区二区三卡| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 丁香六月天网| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 一本久久精品| 久久国产精品影院| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产亚洲精品久久久久5区| 少妇的丰满在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 尾随美女入室| 免费不卡黄色视频| 秋霞在线观看毛片| 色94色欧美一区二区| 首页视频小说图片口味搜索 | 日韩大码丰满熟妇| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲人成电影观看| 亚洲国产最新在线播放| 美女中出高潮动态图| 亚洲av国产av综合av卡| 男男h啪啪无遮挡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 嫁个100分男人电影在线观看 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| xxx大片免费视频| 一二三四在线观看免费中文在| 黄片小视频在线播放| 操出白浆在线播放| 精品福利观看| 深夜精品福利| 狂野欧美激情性xxxx| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美黄色片欧美黄色片| 99热网站在线观看| 性色av一级| 午夜福利免费观看在线| 免费av中文字幕在线| 国产精品一二三区在线看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲,欧美,日韩| 99热国产这里只有精品6| 国产免费一区二区三区四区乱码| 少妇被粗大的猛进出69影院| av福利片在线| 水蜜桃什么品种好| 午夜福利在线免费观看网站| 国产精品欧美亚洲77777| 一级黄片播放器| 九草在线视频观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 好男人电影高清在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 首页视频小说图片口味搜索 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 成人国产av品久久久| 亚洲伊人久久精品综合| 美女国产高潮福利片在线看| 免费在线观看完整版高清| 99热国产这里只有精品6| 91九色精品人成在线观看| 精品人妻在线不人妻| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 波野结衣二区三区在线| 久久性视频一级片| 一级片'在线观看视频| 亚洲五月色婷婷综合| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲av综合色区一区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产成人免费观看mmmm| 久久久精品区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜影院在线不卡| 男人操女人黄网站| 丝袜脚勾引网站| 国产精品二区激情视频| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲欧美激情在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 久久青草综合色| av在线老鸭窝| bbb黄色大片| 不卡av一区二区三区| 一区福利在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 九草在线视频观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| av线在线观看网站| 国产成人影院久久av| 亚洲av片天天在线观看| 熟女av电影| 久久这里只有精品19| 欧美国产精品va在线观看不卡| 尾随美女入室| 大片电影免费在线观看免费| 嫩草影视91久久| 国产成人精品久久二区二区91| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美精品av麻豆av| 亚洲成人免费av在线播放| 美女大奶头黄色视频| 在线观看免费高清a一片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 麻豆国产av国片精品| 我要看黄色一级片免费的| 国产又色又爽无遮挡免| 人人妻人人澡人人看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 黄色视频不卡| 欧美另类一区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品国产三级专区第一集| 精品国产国语对白av| 日本欧美视频一区| 欧美日韩视频精品一区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲综合色网址| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲精品自拍成人| 欧美国产精品va在线观看不卡| 黄色视频不卡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩人妻精品一区2区三区| 99久久综合免费| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本欧美视频一区| 女人精品久久久久毛片| 999久久久国产精品视频| 欧美精品一区二区大全| 亚洲欧美清纯卡通| 国产男女超爽视频在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产主播在线观看一区二区 | 国产真人三级小视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 美女高潮到喷水免费观看| 黑人猛操日本美女一级片| 久久精品国产a三级三级三级| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲中文日韩欧美视频| 深夜精品福利| www.熟女人妻精品国产| 精品一区二区三卡| 爱豆传媒免费全集在线观看| av线在线观看网站| 女警被强在线播放| 999精品在线视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品高清国产在线一区| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲情色 制服丝袜| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 少妇人妻 视频| 一级a爱视频在线免费观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产成人一区二区在线| 一级毛片电影观看| avwww免费| 女警被强在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 2021少妇久久久久久久久久久| 看免费成人av毛片| 久久久久久久精品精品| 蜜桃在线观看..| 777米奇影视久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品国产av成人精品| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲五月色婷婷综合| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品国产一区二区久久| 午夜视频精品福利| 亚洲美女黄色视频免费看| 9热在线视频观看99| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 91国产中文字幕| 国产精品久久久久成人av| 五月开心婷婷网| 国产一区二区 视频在线| 人妻 亚洲 视频| 十分钟在线观看高清视频www| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 后天国语完整版免费观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美激情高清一区二区三区| 丝袜美足系列| 久久久国产精品麻豆| 人人澡人人妻人| av欧美777| 国产成人免费观看mmmm| 日本五十路高清| 欧美成狂野欧美在线观看| 一级黄片播放器| 大型av网站在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 人妻一区二区av| 国产片内射在线| 国产免费又黄又爽又色| 大片电影免费在线观看免费| 国产xxxxx性猛交| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲 国产 在线| 欧美日韩视频精品一区| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲美女黄色视频免费看| 一级a爱视频在线免费观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一本综合久久免费| 国产精品九九99| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 日本欧美视频一区| 在线av久久热| 国产亚洲精品第一综合不卡| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 男人舔女人的私密视频| 亚洲av成人精品一二三区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 视频在线观看一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 一区二区三区精品91| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲欧美精品自产自拍| 无限看片的www在线观看| 大陆偷拍与自拍| 99国产精品99久久久久| 亚洲成色77777| 精品少妇久久久久久888优播| 热99久久久久精品小说推荐| 久久ye,这里只有精品| 久久久欧美国产精品| 亚洲综合色网址| 在线观看一区二区三区激情| e午夜精品久久久久久久| 乱人伦中国视频| 亚洲人成电影免费在线| 好男人电影高清在线观看| 99香蕉大伊视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 99香蕉大伊视频| 午夜视频精品福利| 久久久国产欧美日韩av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费日韩欧美在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 丝袜美足系列| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品国产av成人精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 无限看片的www在线观看| 国产精品.久久久| 色视频在线一区二区三区| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 一区福利在线观看| 免费av中文字幕在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产男人的电影天堂91| 美女午夜性视频免费| 国产精品人妻久久久影院| 在线观看一区二区三区激情| 国产成人啪精品午夜网站| 久久狼人影院| 久久久精品94久久精品| 国产91精品成人一区二区三区 | 成人国产av品久久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| netflix在线观看网站| 日韩大片免费观看网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一区二区三区乱码不卡18| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 高清黄色对白视频在线免费看| e午夜精品久久久久久久| 两个人看的免费小视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品av久久久久免费| 免费av中文字幕在线| 99久久人妻综合| 久久免费观看电影| 好男人视频免费观看在线| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产亚洲欧美精品永久| 男人舔女人的私密视频| 亚洲精品自拍成人| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久国产精品影院| 国产av精品麻豆| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久狼人影院| 中文字幕人妻熟女乱码| 午夜激情av网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久人妻熟女aⅴ| 色婷婷久久久亚洲欧美| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 黄色视频不卡| 91九色精品人成在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 免费在线观看影片大全网站 | 精品福利观看| 大香蕉久久成人网| 国产精品久久久久久精品古装| 操出白浆在线播放| 日本91视频免费播放| 欧美中文综合在线视频| a级片在线免费高清观看视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美日韩精品网址| 香蕉国产在线看| 三上悠亚av全集在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 波多野结衣av一区二区av| 91麻豆av在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 中国国产av一级| 99国产精品免费福利视频| 男男h啪啪无遮挡| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲欧美激情在线| 一区在线观看完整版| 国产深夜福利视频在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 久久久精品免费免费高清| 色视频在线一区二区三区| 看免费成人av毛片| av不卡在线播放| 天天操日日干夜夜撸| 国产亚洲av高清不卡| 婷婷色综合大香蕉| 免费黄频网站在线观看国产| 成人影院久久| 男女床上黄色一级片免费看| 好男人视频免费观看在线| 中文字幕人妻丝袜制服| 又紧又爽又黄一区二区| 少妇人妻 视频| 在线观看一区二区三区激情| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 交换朋友夫妻互换小说| 一本综合久久免费| 黑丝袜美女国产一区| 日日爽夜夜爽网站| 国产一卡二卡三卡精品| 免费观看a级毛片全部| 超碰成人久久| 国产一区二区激情短视频 | 日本av手机在线免费观看| 宅男免费午夜| 国产精品三级大全| 国产xxxxx性猛交| 777米奇影视久久| 无遮挡黄片免费观看| 日韩制服骚丝袜av| 国产爽快片一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 蜜桃国产av成人99| 亚洲人成电影观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久99一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久热在线av| 国产91精品成人一区二区三区 | 久久久亚洲精品成人影院| 激情视频va一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 精品人妻在线不人妻| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 精品久久久久久电影网| 精品一品国产午夜福利视频| 久久青草综合色| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲欧美激情在线| 亚洲美女黄色视频免费看| 少妇 在线观看| 国产成人精品无人区| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲av日韩在线播放| 欧美国产精品va在线观看不卡| 大话2 男鬼变身卡| 日韩免费高清中文字幕av| 国产亚洲精品久久久久5区| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| a级毛片黄视频| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 永久免费av网站大全| 老司机在亚洲福利影院| cao死你这个sao货| 亚洲欧美一区二区三区国产| 免费看十八禁软件| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲人成电影观看| 亚洲中文字幕日韩| 久久99精品国语久久久| 欧美日韩黄片免| 最黄视频免费看| 中文字幕制服av| 日本一区二区免费在线视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 午夜老司机福利片| 婷婷色av中文字幕| 99精品久久久久人妻精品| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 一区二区三区激情视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲,欧美精品.| 久久精品国产综合久久久| 又大又爽又粗| av线在线观看网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久国产精品影院| 成人国产av品久久久| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 又大又黄又爽视频免费| 两个人免费观看高清视频| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲国产日韩一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 热99国产精品久久久久久7| 夫妻性生交免费视频一级片| 中文字幕最新亚洲高清| 一区二区日韩欧美中文字幕| 在线观看国产h片| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 久久久久精品人妻al黑| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 大片电影免费在线观看免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 在线观看国产h片| 久久久久精品人妻al黑| av国产久精品久网站免费入址| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 丝袜脚勾引网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜免费成人在线视频| 久久久久久久久免费视频了| 免费观看人在逋| 午夜精品国产一区二区电影| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产免费现黄频在线看| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲国产欧美在线一区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美日韩av久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 人妻 亚洲 视频| 无限看片的www在线观看| 观看av在线不卡| 国产免费又黄又爽又色| 丝袜美足系列| 国产黄频视频在线观看| 一区福利在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产一区二区三区av在线| 人妻 亚洲 视频|