專利名稱：一種亮斑扁角水虻抗菌肽及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種亮斑扁角水虻(Hermetiaillucens L.)抗菌肽基因,還涉及一種亮斑扁角水蛇抗菌肽的制備方法,還涉及一種亮斑扁角水虻抗菌肽在抗菌功能方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
昆蟲抗菌肽是當(dāng)昆蟲在受到意外損傷或病原菌感染時所產(chǎn)生的一類抗菌活性物質(zhì)，它是生物體內(nèi)非特異性免疫防御系統(tǒng)中的一種免疫應(yīng)答產(chǎn)物，主要產(chǎn)生在血血淋巴中，具有多方面的優(yōu)點，如分子量小、熱穩(wěn)定性好、廣譜抗菌作用和病原菌不易產(chǎn)生抗性等。目前病原微生物的耐藥性不斷增強，耐藥譜也在不斷擴大，因此對臨床抗病、抗感染、農(nóng)業(yè)動植物病害等治療效果影響較為嚴(yán)峻。人們在積極進行研究耐藥菌耐藥機制的同 時，不斷尋找和研究新的不同于傳統(tǒng)藥物作用機制的抗微生物藥物，由此抗菌肽的相關(guān)研究便成了人們關(guān)注和研究的熱點。美國和日本已經(jīng)投入巨資進行天然抗菌肽的研究和開發(fā)，并把昆蟲資源的開發(fā)特別是蠅類資源開發(fā)作為高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)之一，但該領(lǐng)域的研究與發(fā)展在我國才開始。目前，國內(nèi)外的專家和學(xué)者從雙翅目類昆蟲(主要是蠅類昆蟲)中的果蠅、家蠅、廄螯蠅、地中海實蠅等體內(nèi)分離得到抗菌肽。這些抗菌肽具有很多較好的特性，如水溶性好、廣譜的抗菌活性、可抑制多種細菌、真菌、病毒及腫瘤癌細胞但不損傷正常的體細胞、無毒副作用等。雙翅目昆蟲亮斑扁角水虻能生長在腐物、糞便和垃圾等含有大量細菌的惡劣環(huán)境中，其自身卻不會因為感染病原菌而引起死亡，這說明亮斑扁角水虻對病原微生物有很強免疫力(何正波等，2001)。而這種免疫力很可能來自亮斑扁角水虻本身所分泌的活性物質(zhì)所起作用。昆蟲自身免疫產(chǎn)生的抗菌肽的研究已經(jīng)比較多，尤其是針對于家蠅所產(chǎn)生的抗菌肽研究較多，從早期的昆蟲的活性物質(zhì)的提取和分離純化到目前階段的用基因工程方法來進行活性肽分子的鑒定與克隆。但在環(huán)境安全方面，以亮斑扁角水虻作為研究材料不僅不會傳播病原菌，而且亮斑扁角水虻本身還是處理農(nóng)業(yè)廢棄物的好材料，所以相對其它昆蟲材料用來進行抗菌肽研究會更加安全，具有可行性。亮斑扁角水虻在利用糞便等能分泌抗菌物質(zhì)，可能有新的抗菌肽基因，有必要對其抗菌肽基因進行篩查，因此，對亮斑扁角水虻中發(fā)掘新的抗菌肽進行深入研究，對醫(yī)藥、食品防腐劑、飼料添加劑和農(nóng)作物病害生物防治等諸多領(lǐng)域具有重要的意義。為亮斑扁角水虻抗菌肽功能和作用機制研究提供了分子基礎(chǔ)，并為抗菌肽在生物防治和醫(yī)藥中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供了一種新抗菌肽基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示，這兩個核苷酸序列的相似度達到99% (該基因序列中存在堿基突變)，與已知的Stomoxyn抗菌肽基因(GeneBank NO AP00484)同源性為46. 29%，能編碼同一種抗菌肽。該序列是首次從亮斑扁角水虻中篩查克隆得到，可以根據(jù)該序列設(shè)計引物，并以亮斑扁角水虻的cDNA為模板，通過PCR或RT-PCR的方法大量擴增該核苷酸序列，連接于表達載體，表達生產(chǎn)抗菌肽。本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種新抗菌肽Stomoxyn ZH1，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 3所示。該抗菌肽具有廣譜的抗菌活性能抗革蘭氏陰性菌大腸桿菌、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌以及抗真菌稻瘟病病原菌；在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)病害防治、飼料添加劑等方面有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明還有一個目的在于提供了一種新抗菌肽Stomoxyn ZHl的制備方法,構(gòu)建真核表達載體，轉(zhuǎn)化到表達菌株后進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心取發(fā)酵上清，將上清采用冷凍干燥濃縮法獲得目的抗菌肽，該方法簡便，快速且成本低廉。本發(fā)明還涉及一種新抗菌肽Stomoxyn ZHl在制備治療或預(yù)防醫(yī)學(xué)抗菌感染等藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種新抗菌肽Stomoxyn ZHl在制備商業(yè)動物抗菌飼料添加劑的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種新抗菌肽Stomoxyn ZHl在制備治療或預(yù)防農(nóng)業(yè)植物病害的生物農(nóng)藥中的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明的一個目的是提供一種新的核苷酸序列，該序列編碼一種新的抗菌肽Stomoxyn ZH1。在本發(fā)明中,抗菌肽Stomoxyn ZHl的核苷酸序列是以亮斑扁角水蛇總RNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，并以設(shè)計的簡并引物通過PCR方法擴增得到的。具體方法如下亮斑扁角水虻武漢種為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物農(nóng)藥國家工程研究中心所提供，取亮斑扁角水虻靠近頭部的上半部分組織，提取總RNA或mRNA為模板(市售的提取RNA和mRNA試劑盒，按照說明書操作)，用逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo dT Primer進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。以上述cDNA第一鏈為模板，再以設(shè)計的多對簡并引物(詳見表I)為引物進行PCR擴增，最終以Stomoxyn為引物的PCR擴增得到ISObp左右的目的片段，將此片段進行回收并克隆測序，得到一種分離的抗菌肽基因，其序列為SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明所要求保護的兩個核苷酸序列，可以通過PCR的方法大量擴增該核苷酸序列。本發(fā)明要求保護的抗菌肽可用如下方法生產(chǎn)該方法所包括的以下具體的操作按照常規(guī)實驗條件，如《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學(xué)出版社中所述的條件進行?！N新抗菌肽Stomoxyn ZHl的制備方法,其步驟為I)提取亮斑扁角水虻的總RNA或mRNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈；2)根據(jù)雙翅目昆蟲所可能產(chǎn)生的抗菌肽設(shè)計多對簡并引物，詳見表I3)以得到亮斑扁角水虻的cDNA第一鏈為PCR模板，用上述的簡并引物來擴增得到目的片段，將所得到的片段進行回收、克隆測序得到序列為SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示的核苷酸全長序列；4)重新設(shè)計帶酶切位點的引物，擴增得到帶酶切位點的SEQ ID NO. I與SEQ IDNO. 25)構(gòu)建重組表達載體步驟4中得到的核苷酸序列和真核表達載體pPICZ a A(實驗室保存，或者市售，irwitrogen公司)進行酶切，連接酶切后的DNA序列和表達載體pPICZ a A,構(gòu)建重組表達載體 pPICZ a A-Stomoxyn ZHl ；6)將步驟5中得到的重組表達載體電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115的宿主細胞中(本實驗室保存)，并于BMGY培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)24h后，接種于BMMY培養(yǎng)基中用1%的甲醇30°C誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3d獲得培養(yǎng)物；7)取步驟6中的培養(yǎng)物離心分離上清，純化步驟6中誘導(dǎo)表達具有所示氨基酸序列的抗菌肽，得到ー種抗菌肽，其序列為SEQ ID NO. 3所示。純度檢測可以用SDS-PAGE方法檢測。一種亮斑扁角水虻抗菌肽在抗菌功能方面的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是 經(jīng)查閱資料了解到Stomoxyn的抗菌活性為抗G+和G_以及抗部分真菌,因此初步對Sto moxyn ZHl表達的蛋白做了對G+代表菌株金黃色葡萄球菌和G—代表菌株大腸桿菌以及稻瘟病病原菌做了抑菌檢測。主要采用打孔平板對峙培養(yǎng)法檢測其抗菌活性。細菌主要是吸取100 U L對數(shù)生長期的懸液均勻涂布在固體培養(yǎng)基平皿上，然后用直徑5mm的打孔器在培養(yǎng)基上對稱均勻地打孔6個。精確吸取抗菌肽Stomoxyn ZHl表達樣品80ul，加入培養(yǎng)基的制備孔中，每個指示菌做三個重復(fù)。病原真菌抑制試驗則是將已經(jīng)活化好的病原真菌菌塊接于培養(yǎng)基(PDA)中央，然后在培養(yǎng)基的制備孔中加入對應(yīng)的抗菌肽Stomoxyn ZHl表達樣品80ul。病原細菌于37°C培養(yǎng)24h，病原真菌在28°C培養(yǎng)2d左右，觀察抑制效果。結(jié)果顯示，表達樣品Stomoxyn ZHl革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌以及真菌稻瘟病病原菌均有抑制效果。醫(yī)學(xué)上主要抗銅綠色假單胞菌、大腸埃希菌、傷寒沙門菌、普通變形菌以及引起人類疾病的白色念珠菌、痢疾桿菌、肺炎桿菌等。醫(yī)學(xué)上部分stomoxyn甚至對含包膜的病毒如皰疹病毒、水泡性口炎病毒也有作用，而對正常細胞無損害。在動物病害方面主要針對于胞內(nèi)寄生原蟲，對剛地弓形蟲、瘧原蟲和布氏錐蟲以及蛔蟲卵有殺傷作用。對多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等動物源性致病菌也有抗性作用?？怪参锛毦圆『曛饕撬景兹~枯病菌，大白菜軟腐病菌和稻瘟病病原真菌等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點I.從昆蟲水蛇中通過設(shè)計抗菌肽基因的簡并引物擴增出新的抗真菌肽StomoxynZHl。2. Stomoxyn ZHl具有廣譜抗菌活性，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)病害防治、飼料添加劑等方面有良好的應(yīng)用前景。3.新抗菌肽Stomoxyn ZHl的制備方法,該方法簡便,快速且成本低廉。
圖I為ー種抗菌肽基因Stomoxyn的PCR擴增電泳示意圖
M DNA 50bp Marker ；1 :Stomoxyn 所擴增條帶。圖2為一種pPICZ a A-Stomoxyn ZHl的構(gòu)建不意中STO為新抗菌肽基因Stomoxyn ZHl。首先設(shè)計含有EcoR I和Not I酶切位點的上下游引物，以亮斑扁角水虻的cDNA為模板，進行PCR，得到兩端含有EcoR I和NotI酶切位點的PCR產(chǎn)物，用EcoR I和Not I酶分別酶切PCR產(chǎn)物和pPICZ a A質(zhì)粒，將STO插入pPICZ a A的多克隆位點完成連接反應(yīng)，從而完成pPICZ a A-Stomoxyn ZHl重組表達載體的構(gòu)建。圖3為ー種畢赤酵母GSl 15 (pPICZ a A-Stomoxyn ZHl)的誘導(dǎo)表達示意圖M，蛋白marker，I為pPICZ a A空載體表達樣品；2-7分別為重組質(zhì)粒的菌株用1%甲醇誘導(dǎo)24h、36h、48h、60h、72h、96h所表達樣 品。圖4為ー種抗菌肽的抑菌實驗示意4中a為Stomoxyn ZHl抑制金黃色葡萄球菌的結(jié)果,ck為空載體表達樣品，1，2加樣為Stomoxyn ZHl表達樣品I ;3，4加樣為Stomoxyn ZHl表達樣品2 ；圖4中b為Stomoxyn ZHl抑制大腸桿菌的結(jié)果，ck為空載體表達樣品，I, 3加樣為Stomoxyn ZHl表達樣品I ;2，4加樣為Stomoxyn ZHl表達樣品2 ；圖4中c為Stomoxyn ZHl抑制稻瘟病病原菌的結(jié)果，I號加樣為GSl 15發(fā)酵上清；2號加樣為空載體表達樣品；3加樣為Stomoxyn ZHl表達樣品。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進ー步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件，《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學(xué)出版社中所述的條件進行，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I亮斑扁角水虻cDNA第一鏈的制備(I)亮斑扁角水虻總RNA的提取將備用的器材(解剖剪、離心管、各個型號Tip頭等)用1%的焦碳酸ニこ酯(DEPC，在上海生エ購置)水浸泡12h ；經(jīng)DEPC處理的各器材進行高壓滅菌處理30min ；將原始材料亮斑扁角水虻用75%的酒精浸泡30min ；用超純水清洗處理材料2-3次；用解剖剪剪下組織樣品置于液氮中處理后立即放入RNase free的研缽進行磨碎，在無菌條件下用超純總RNA快速提取試劑盒(原平皓生物技術(shù)有限公司)提取總RNA，詳細步驟詳見RNA快速提取試劑盒的說明書。RNA放置-70 V保存，備用。(2)合成亮斑扁角水虻cDNA第一條鏈按照Reverse Transcription System試劑盒說明書(在TIANGEN公司購置)，以O(shè)ligo(dT)為引物合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系如下，依次將以下試劑加入經(jīng)DEPC水處理并滅菌過的PCR管中
權(quán)利要求
1.一種分離的抗菌肽基因，其序列為SEQ ID NO. I所示。
2.一種分離的抗菌肽基因，其序列為SEQ ID NO. 2所示。
3.—種權(quán)利要求I或2所述基因編碼的抗菌肽，其序列為SEQ ID NO. 3所示。
4.一種權(quán)利要求3所述的抗菌肽的制備方法，其步驟為 A.提取亮斑扁角水虻的總RNA或mRNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄得到亮斑扁角水虻的cDNA第一鏈； B.查閱抗菌肽數(shù)據(jù)庫，根據(jù)雙翅目昆蟲的抗菌肽進行分析各類抗菌肽的保守區(qū)域，利用Primer5. O來設(shè)計簡并引物，設(shè)計了 6對引物； C.以步驟A中的cDNA第一鏈為模板，以設(shè)計的簡并引物為引物進行基因擴增篩查； D.瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將得到目的大小條帶的PCR產(chǎn)物進行回收； E.酶切步驟D得到的序列和真核表達載體PPICZ a A，并構(gòu)建重組表達載體pPICZ a KStomoxyn ZHl ; F.將步驟E中得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細胞進行大量克隆，再將克隆后的重組表達載體電轉(zhuǎn)化至酵母宿主細胞GS115形成表達抗菌肽的重組菌株；G.將步驟F中得到的重組菌株在30°C條件下用1%的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3d獲得培養(yǎng)物； H.離心步驟F中得到培養(yǎng)物，分離純化上清中表達抗菌肽。
5.一種權(quán)利要求3所述的抗菌肽在制備治療或預(yù)防醫(yī)學(xué)抗菌感染藥物中的應(yīng)用。
6.—種權(quán)利要求3所述的抗菌肽在制備商業(yè)動物抗菌飼料添加劑中的應(yīng)用。
7.—種權(quán)利要求3所述的抗菌肽在制備治療或預(yù)防農(nóng)業(yè)植物病害的生物農(nóng)藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種亮斑扁角水虻新抗菌肽StomoxynZH1及制備方法和應(yīng)用?？咕牡闹苽洳襟E是首先提取昆蟲亮斑扁角水虻的總RNA為模板，通過RT-PCR得到cDNA第一鏈來作為模板，通過PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；其次是酶切得到PCR產(chǎn)物和真核表達載體，構(gòu)建重組表達載體；第三是將得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化至酵母宿主細胞，得到表達抗菌肽StomoxynZH1的重組菌株；第四是將得到的重組的菌株進行誘導(dǎo)培養(yǎng)得到培養(yǎng)物并離心分離得到表達的抗菌肽。該抗菌肽具有廣譜的抗菌活性能抗革蘭氏陰性菌大腸桿菌、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌以及抗真菌稻瘟病病原菌；在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)病害防治、飼料添加劑等方面有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P31/04GK102816769SQ201210286878
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月13日
發(fā)明者張吉斌, 周定中, 王茂淋, 左懷雨, 喻子牛 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)