專利名稱：重組微纖維蛋白溶酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物學(xué)藥物領(lǐng)域，具體地涉及一種應(yīng)用于眼科疾病方面的重組微纖維蛋白溶酶及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病理性纖維增殖導(dǎo)致的后玻璃體粘連變形是增殖型玻璃體視網(wǎng)膜病變等疾病發(fā)展的結(jié)果。由病理性纖維增殖膜及玻璃體后皮質(zhì)對(duì)視網(wǎng)膜的粘連、牽拉，成為影響黃斑性目盲疾病治療和預(yù)后的重要因素。玻璃體切除術(shù)是現(xiàn)今治療增殖型玻璃體視網(wǎng)膜病變等疾病的一種醫(yī)療手段。但是在這些疾病中，病理性纖維增殖膜和玻璃體后皮質(zhì)與視網(wǎng)膜緊密粘連，難于完整剝離，手術(shù)難度大，并發(fā)癥多。因此探尋分離玻璃體后皮質(zhì)、松解病理性纖維增殖膜與視網(wǎng)膜之間的粘連的新方法成為當(dāng)前亟待解決的難題。糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變是目前的多發(fā)病之一。糖尿病已成為威脅人類健康的第三大殺手，中國(guó)的糖尿病患者人數(shù)第一、增長(zhǎng)速度最快，目前患病人數(shù)接近一個(gè)億。糖尿病嚴(yán)重時(shí)可累及全身各個(gè)器官，引起多種并發(fā)癥，致死致殘。視網(wǎng)膜病變是糖尿病的主要并發(fā)癥，已成為主要致盲眼病。玻璃體黃斑粘連是其病變和預(yù)后的主要因素。如上所述，現(xiàn)今治療方案是用外科手術(shù)完全切除玻璃體后皮質(zhì)及病理性纖維增殖膜，解除其對(duì)視網(wǎng)膜黃斑的粘連和牽拉。此手術(shù)方法具有費(fèi)用高、手術(shù)難度大，及因剝離不完全而導(dǎo)致術(shù)后并發(fā)癥多等缺點(diǎn)。因此現(xiàn)在有廣大的糖尿病患者因得不到治療而導(dǎo)致盲目。非手術(shù)、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的藥物治療玻璃體黃斑粘連是當(dāng)前的迫切需求。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種重組微纖維蛋白溶酶，通過(guò)對(duì)患者的眼部玻璃體或/和水狀體施加一定有效量的包括重組`微纖維蛋白溶酶的藥物組合物，以溶解玻璃體和/或引起玻璃體后脫離。本發(fā)明可用于降低玻璃體粘性，溶解玻璃體，誘導(dǎo)玻璃體后脫離，降低眼內(nèi)出血，清除或降低對(duì)眼睛有毒的物質(zhì)，增加眼部用藥的擴(kuò)散，減低外視網(wǎng)膜新血管生成及任何以上病狀的復(fù)合。本發(fā)明可輔助或者代替?zhèn)鹘y(tǒng)的機(jī)械玻璃體切除術(shù)。應(yīng)用本發(fā)明的酶解法可避免手術(shù)，應(yīng)用簡(jiǎn)單，使病理性纖維增殖膜及玻璃體后皮質(zhì)對(duì)視網(wǎng)膜的粘連剝離完全，無(wú)并發(fā)癥，及治療費(fèi)用低廉。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種重組微纖維蛋白溶酶原多肽，具有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)上述的重組微纖維蛋白溶酶原多肽的方法，步驟如下:
(1)將編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列插入基于質(zhì)粒的大腸桿菌疋表達(dá)載體PETll中，然后傳導(dǎo)到大腸桿菌宿主中，并用氨芐青霉素選擇抗性克??；所述的編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列如SEQ ID N0.1所示；
(2)重組微纖維蛋白溶酶原多肽的表達(dá)、復(fù)性以及純化:①將(I)中選擇的培養(yǎng)攜帶表達(dá)質(zhì)粒的疋coli抗性克隆在培養(yǎng)基中培養(yǎng)到A600=0.6-0.9的生長(zhǎng)期加入IPTG誘導(dǎo)蛋白以包涵體形式表達(dá)，37 °C下繼續(xù)培養(yǎng)3-5小時(shí)；③離心收獲細(xì)菌，然后通過(guò)凍融和漂洗得到純化的包涵體；@在pH 8-10的8M尿素緩沖液中溶解包涵體； 將含有包涵體的尿素緩沖液快速稀釋到20倍的20 mM Tris, 0.2 M精氨酸，pH 9.0的緩沖液中，得復(fù)性蛋白；⑥采用分子排阻色譜法將復(fù)性蛋白完全分離出來(lái)；⑦采用離子交換和親和層析進(jìn)一步純化復(fù)性蛋白，即為重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。一種重組微纖維蛋白溶酶:是將上述的重組微纖維蛋白溶酶原多肽經(jīng)活化酶激活成重組微纖維蛋白溶酶。所述的激活酶是尿激酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、或普激酶。上述的重組微纖維蛋白溶酶作為有效成分用于制備治療玻璃體黃斑牽引綜合癥、黃斑裂洞、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜撕裂、視網(wǎng)膜新生血管形成、視網(wǎng)膜出血、視網(wǎng)膜水腫、或者處理玻璃體后脫離不完全的手術(shù)并發(fā)癥的藥物。重組微纖維蛋白溶酶的用量為:每只眼睛0.005毫克-0.2毫克。本發(fā)明的重組微纖維蛋白溶酶(μρ )可以溶解造成后玻璃體粘連的纖維蛋白，包括fibronectin和Iaminin,從而達(dá)到酶解法后玻璃體脫離的治療效果。本發(fā)明采用大腸桿菌生產(chǎn)重組μρ πι，通過(guò)眼部的玻璃體腔注射μρ πι可以有效解除玻璃體黃斑粘連，具有特異性強(qiáng)、免疫原性低、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。利用本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組μρ πι，制備治療玻璃體黃斑粘連的藥物，具有表達(dá)量高，生 產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本低，和表達(dá)蛋白活性穩(wěn)定，制品使用安全等特點(diǎn)。應(yīng)用本發(fā)明可開發(fā)出經(jīng)濟(jì)安全，非手術(shù)治療玻璃體黃斑粘連的藥物，以克服目前外科切除手術(shù)所面臨的費(fèi)用高、手術(shù)難度大和并發(fā)癥多等問(wèn)題。
圖1是重組微纖維蛋白溶酶原多肽(mPlg)在用尿激酶激活成重組微纖維蛋白溶酶(mPlm)前的SDS-PAGE電泳圖。線道1，標(biāo)準(zhǔn)分子量；線道2，非還原的mPlg ;線道3，還原的mPlg。圖2是重組微纖維蛋白溶酶原多肽的氨基酸序列。圖中標(biāo)記了酶原的激活健(R27V21)。圖3是本發(fā)明復(fù)性的重組微纖維蛋白溶酶與市場(chǎng)纖維蛋白溶酶(Sigma，St.Louis, MO)的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較(Hanes plot kinetic comparison)。酶解底物是發(fā)色作用物 S-2403 (Chromogenix, Goteberg, Sweden)。圖4是圖三中動(dòng)力學(xué)常數(shù)的總結(jié)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1重組微纖維蛋白溶酶 (一)重組微纖維蛋白溶酶原多肽的制備
(I)本發(fā)明的重組微纖維蛋白溶酶原多肽在大腸桿菌中表達(dá)。將編碼所需重組微纖維蛋白溶酶原多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示)的DNA序列(如SEQ ID NO:1所示)插入基于質(zhì)粒的大腸桿菌(萬(wàn).co7i)表達(dá)載體(如pETll載體)中，然后傳導(dǎo)到合適的大腸桿菌宿主(如BL21(DE3))中，并用氨節(jié)青霉素(Ampicillin)選擇抗性克隆。
(2)重組微纖維蛋白溶酶原多肽(PPlg)的表達(dá)、復(fù)性以及純化。具體流程如下:I)將(I)中選擇的培養(yǎng)攜帶表達(dá)質(zhì)粒的疋coli抗性克隆在培養(yǎng)基(如LB/Ampicillin)中培養(yǎng)到一定的生長(zhǎng)期(如A600=0.6-0.9) ；2)加入IPTG誘導(dǎo)蛋白以包涵體形式表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)一定的時(shí)間(如3-5小時(shí)，37 °C) ；3)通過(guò)離心等方法收獲細(xì)菌，然后通過(guò)凍融和漂洗等方法得到純化的包涵體；4)在SM尿素緩沖液中溶解包涵體，此緩沖液包括一種或多種還原劑，和使溶液緩沖至約pH 8-10的緩沖劑，如20 mM Tris ；5)用復(fù)性方法將變性蛋白復(fù)性成它的天然構(gòu)象，如用快速稀釋法將包含體緩沖液稀釋到20倍的20 mM Tris,0.2 M精氨酸，pH 9.0的緩沖液中,得復(fù)性蛋白；6)采用分子排阻色譜(size ExclusionChromatography, SEC)法從部分或全部未折疊的KPlg或它的多聚體中將復(fù)性蛋白完全分離出來(lái)，示例性的SEC柱層析包括Superdex 200和Superdex 75,示例性的層析柱緩沖液為20 mM Tris, 0.2 M精氨酸，0.2 M NaCl, pH 8.0 ；7)采用離子交換和親和層析技術(shù)進(jìn)一步純化復(fù)性蛋白，即為重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；8)SEC純化的PPlg可以進(jìn)一步用其他層析柱如離子交換柱和輸水柱等方法純化。圖1顯示了純化后的重組微纖維蛋 白酶原多肽。(3) PPlg 的活化:
以上所純化的重組微纖維蛋白溶酶原多肽(KPlg)可以用不同的方法激活成重組微纖維蛋白溶酶(μρ πι)。激活重組微纖維蛋白溶酶原多肽的活化酶可以是尿激酶，組織纖溶酶原激活物(tPA)，鏈激酶，及普激酶。激活的過(guò)程采用本領(lǐng)域的常規(guī)知識(shí)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所共知的。激活后所得到的μρ πι可以用離子交換柱層析方法純化，然后傳入到穩(wěn)定緩沖液中。穩(wěn)定緩沖液包括:20 mM檸檬酸，10%蔗糖，pH 3.1。此緩沖液中的微纖維蛋白溶酶可以作為一種藥物組合物制備成藥物劑型。(二)酶動(dòng)力學(xué)及實(shí)驗(yàn)分析
(I)重組μρ πι與商用纖溶酶在動(dòng)力學(xué)方面的比較。如圖3和圖4所示，本發(fā)明復(fù)性純化的μ Plm與市場(chǎng)的血纖維蛋白溶酶的特異活性及動(dòng)力學(xué)性質(zhì)都相似。具體動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的。下面是一個(gè)簡(jiǎn)單的描述。用固定濃度的μ Plm，在21° C環(huán)境下，與不同濃度的一系列纖溶酶底物S-2403混合。用酶標(biāo)儀測(cè)定各反應(yīng)速度并具此計(jì)算動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。圖3和圖4用此處所描述的顯色法比較了重組型μ Plm與商業(yè)的血纖維蛋白溶酶(Sigma，Cat # P1867)動(dòng)力學(xué)特性。原始數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換為μ M單位，并采用Hanes plot方法進(jìn)行分析工作。如圖3所示。μΡΙπι和血纖維蛋白溶酶按照固定的濃度混合成一系列濃度的s-2403 (200-2000 μ Μ)，分成四組用titertek公司的微量洗液管移到96孔板中。每間隔 5 15 分鐘使用 384 板的酶標(biāo)儀(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)測(cè)試 A405nm30秒，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換成μ M格式并使用Hanes plot進(jìn)行分析。如圖4所示，μΡΙπι和血纖維蛋白溶酶的Km’s and Kcats非常相似?？偟膩?lái)說(shuō)，μΡΙπι的催化效率比血纖維蛋白溶酶(15.2μ M min-1 vs.11.9 μ M min-1)的效率要高 1.27 以上。(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
Ca)毒理學(xué)的動(dòng)物物種選擇。下列動(dòng)物可以用于本發(fā)明的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。.采用豬作為非嚙齒類動(dòng)物，可以獲得有效的數(shù)據(jù)；
采用兔子作為嚙齒類動(dòng)物，因?yàn)橥米右驯粡V泛的應(yīng)用于眼科研究的試驗(yàn)中，并且兔子眼睛的尺寸更易于在玻璃體內(nèi)給藥和取樣； 選擇小鼠作為系統(tǒng)性的毒性物種，因?yàn)樾∈笫且环N可以獲得有效數(shù)據(jù)的物種。(b)豬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)示例
下列是重組微纖維蛋白溶酶的實(shí)驗(yàn)劑量:在0.1毫升的體積中，包括劑量為0.0625，
0.125,0.156, 0.25和0.390毫克。上述重組微纖維蛋白溶酶分別注射入新鮮宰殺的豬眼睛的玻璃體內(nèi)液中。在室溫(約24 °C)注射量為0.0625毫克，約I小時(shí)后可觀察到玻璃體后剝離，但注射量為0.125毫克約半小時(shí)后即可觀察到玻璃體后剝離。另外，在注射量低于0.25毫克的情況下觀察不到任何眼睛或視網(wǎng)膜的毒性，說(shuō)明有效濃度是在毒性濃度以下。(C)玻璃腔體內(nèi)單次和重復(fù)給藥的毒理研究總結(jié)
單次給藥:在兔子和豬的玻璃腔體內(nèi)單次給藥以獲得急性毒性數(shù)據(jù)，最高劑量設(shè)為3mg/eye(60mg/ml,0.050ml/eye),低劑量和中間劑量為高劑量的1/2遞減(I mg/eye或者
0.3mg/eye)，同時(shí)設(shè)置未給藥的對(duì)照組用于評(píng)估玻璃腔體注射對(duì)眼睛損傷。給藥后采集眼睛中玻璃體的基底膜樣本，用于測(cè)定藥物的殘留，同時(shí)采集血漿樣本用于評(píng)估玻璃腔體注射之后，藥物的系統(tǒng)性分布。
重復(fù)給藥:兔子和豬每周給藥一次，連續(xù)5周，給藥劑量與單次給藥的劑量一致，同時(shí)設(shè)置未給藥的對(duì)照組用于評(píng)估玻璃腔體注射對(duì)眼睛損傷。每次給藥后采集血漿樣，連續(xù)給藥后采集眼睛中玻璃體的基底膜樣本，用于測(cè)定藥物積累效果。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明即使在高劑量，重組微纖維蛋白溶酶對(duì)眼睛組織也沒(méi)有明顯損傷。在中底劑量，重組微纖維蛋白溶酶對(duì)眼睛組織沒(méi)有可觀察到的毒性。(d)單次和重復(fù)靜脈給藥的毒理研究
以小鼠來(lái)做靜脈給藥的毒性研究，首先是用血漿的PK端點(diǎn)做單次給藥的測(cè)距研究。由于對(duì)眼睛的給藥劑量很小，以mg/m2為基礎(chǔ)，在老鼠的靜脈給藥中使用以超過(guò)人類用量100倍的高劑量，而不是使用最大耐受劑量(MTD)或者最高可行劑量(MFD)。所用的大劑量為122mg/kg(350mg/m2),這個(gè)數(shù)值是人體內(nèi)預(yù)計(jì)最高劑量(3 mg/kg, 3.5 mg/m2 )的100倍以上，低劑量及中間劑量分別是10mg/kg和30 mg /kg。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在100倍的高劑量情況下，靜脈給藥的重組微纖維蛋白溶酶對(duì)小鼠沒(méi)有明顯的溶血付作用。在中底劑量，重組微纖維蛋白溶酶對(duì)小鼠沒(méi)有可觀察到的毒性。綜上所述，經(jīng)過(guò)以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的重組微維纖蛋白溶酶安全有效，為臨床實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其特征在于具有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
2.一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的重組微纖維蛋白溶酶原多肽的方法，其特征在于步驟如下: (1)將編碼重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列插入基于質(zhì)粒的大腸桿菌疋表達(dá)載體PETll中，然后傳導(dǎo)到大腸桿菌宿主中，并用氨芐青霉素選擇抗性克?。凰龅木幋a重組微纖維蛋白溶酶原多肽的DNA序列如SEQ ID N0.1所示； (2)重組微纖維蛋白溶酶原多肽的表達(dá)、復(fù)性以及純化:①將(I)中選擇的培養(yǎng)攜帶表達(dá)質(zhì)粒的疋coli抗性克隆在培養(yǎng)基中培養(yǎng)到A600=0.6-0.9的生長(zhǎng)期加入IPTG誘導(dǎo)蛋白以包涵體形式表達(dá)，37 °C下繼續(xù)培養(yǎng)3-5小時(shí)；③離心收獲細(xì)菌，然后通過(guò)凍融和漂洗得到純化的包涵體；@在pH 8-10的8M尿素緩沖液中溶解包涵體； 將含有包涵體的尿素緩沖液快速稀釋到20倍的20 mM Tris, 0.2 M精氨酸，pH 9.0的緩沖液中，得復(fù)性蛋白；⑥采用分子排阻色譜法將復(fù)性蛋白完全分離出來(lái)；⑦采用離子交換和親和層析進(jìn)一步純化復(fù)性蛋白，即為重組微纖維蛋白溶酶原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.重組微纖維蛋白溶酶，其特征在于:將權(quán)利要求1或2所述的重組微纖維蛋白溶酶原多肽經(jīng)活化酶激活成重組微纖維蛋白溶酶，所述的活化酶是尿激酶、組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、或普激酶。
4.權(quán)利要求3所述的重組微纖維蛋白溶酶作為有效成分在制備治療玻璃體黃斑牽引綜合癥、黃斑裂洞、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜撕裂、視網(wǎng)膜新生血管形成、視網(wǎng)膜出血、視網(wǎng)膜水腫、或者處理玻璃體后脫離不完全的手術(shù)并發(fā)癥藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:重組微纖維蛋白溶酶的用量為:每只眼睛.0.005毫克-0.2毫克。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組微纖維蛋白溶酶及其制備方法和應(yīng)用。重組微纖維蛋白溶酶原多肽，具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明采用大腸桿菌生產(chǎn)重組μPlm，通過(guò)眼部的玻璃體腔注射μPlm可以有效解除玻璃體黃斑粘連，具有特異性強(qiáng)、免疫原性低、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。利用本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組μPlm，制備治療玻璃體黃斑粘連的藥物，具有表達(dá)量高，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本低，和表達(dá)蛋白活性穩(wěn)定，制品使用安全等特點(diǎn)。應(yīng)用本發(fā)明可開發(fā)出經(jīng)濟(jì)安全，非手術(shù)治療玻璃體黃斑粘連的藥物，以克服目前外科切除手術(shù)所面臨的費(fèi)用高、手術(shù)難度大和并發(fā)癥多等問(wèn)題。
文檔編號(hào)A61P7/10GK103205410SQ20121000998
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者藺新力 申請(qǐng)人:藺瑩瑩