專利名稱：副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畜類生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌病和豬鏈球菌病是目前我國豬群中最主要的兩種細(xì)菌傳染病。副豬嗜血桿菌病是副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, Hps)引起的豬的多發(fā)性衆(zhòng)膜炎和關(guān)節(jié)炎，該病又稱為豬革拉澤氏病(Glsser’s Disease)。副豬嗜血桿菌可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，通常見于5 8周齡的豬，發(fā)病率可達(dá)40 %，死亡率可達(dá)50 %。主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂；主要剖檢病變表現(xiàn)為纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。此外，副豬嗜血桿菌還可引起敗血癥，并且在急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。在大量分離副豬嗜血桿菌的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)該菌的血清型復(fù)雜多樣，按Kieletein-Rapp-Gabriedson (KRG)瓊脂擴(kuò)散血清分型方法,至少可將副豬嗜血桿菌分為15個血清型；根據(jù)我國血清流行病學(xué)調(diào)查和分離菌株的鑒定，以4、5型最為流行。近年來，由于我國目前飼養(yǎng)技術(shù)的調(diào)整進(jìn)行不當(dāng)，以及突發(fā)新的呼吸道綜合征，使得該病日趨流行，危害日漸嚴(yán)重。豬鏈球菌病是一種人畜共患的急性、熱性傳染病,表現(xiàn)為急性出血性敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、哺乳仔豬下痢和孕豬流產(chǎn)等，在特定誘因作用下，發(fā)病豬死亡率可達(dá)80%，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。豬鏈球菌病在我國華南、西南、華東、江西及江蘇等地曾大面積爆發(fā)流行過，發(fā)病率和死亡率都較高，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，主要血清型為蘭氏C群，其次為蘭氏D群、E群。近年來，在豬鏈球菌眾多血清型中，豬鏈球菌2型(R群)是豬的最主要病原,致病性最強(qiáng),從表征健康的豬體扁桃體內(nèi)分離的所有豬鏈球菌中，2型多達(dá)50.6%,而且可感染特定人群發(fā)病，并可致死亡，危害嚴(yán)重，其中1998年江蘇部分地區(qū)爆發(fā)的豬鏈球菌，造成25人感染，14人死亡；2005年四川部分地區(qū)爆發(fā)2型疫情，造成205人感染，37人死亡；根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，我國C群鏈球菌依然存在，而豬鏈球菌2型有后來居上的趨勢。采用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防是國內(nèi)外控制副豬嗜血桿菌病和豬鏈球菌病的根本手段，而市場銷售的商品疫苗只有副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(血清4型MD0322+血清5型SH0165)、副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(Z-1517株)、副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(血清I型SVl+血清6型SV6)，豬鏈球菌C群活疫苗、豬鏈球菌二價滅活疫苗(2型+馬鏈球菌獸疫亞種)，這些疫苗的應(yīng)用起到了一定的預(yù)防作用，但隨著病原流行株和混合感染已經(jīng)使現(xiàn)有疫苗很難達(dá)到預(yù)期的免疫效果，而且市售商品疫苗需多次免疫，成本較高，對豬只的應(yīng)激較大 ’另外同時針對控制副豬嗜血桿菌病和豬鏈球菌病的疫苗，國內(nèi)外也還是空白。因此，需要發(fā)明一種副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗(JS株+ZJ株+SC株)以解決上述問題。
專利CN101745105A公開了一種豬鏈球病、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗及其制備方法，該疫苗是以已滅活的蘭氏C群馬連球菌獸疫亞種C55138株培養(yǎng)液，豬鏈球菌2型HA9801株培養(yǎng)濃縮液，巴氏桿菌莢膜A群菌培養(yǎng)濃縮液、巴氏桿菌莢膜B群菌培養(yǎng)濃縮液等菌量混合作為抗原，以氫氧化鋁凝膠作為佐劑制成，其濃縮過程采用沉淀法，去除毒素過程中不能最大限度去掉內(nèi)毒素和培養(yǎng)基中的血清雜蛋白。專利CN101721696A公開了一種豬副嗜血菌血清4型、5型、13型三價油乳劑滅活疫苗。它是應(yīng)用我國豬副嗜血菌三個主要的流行血清型和分離株作為抗原，通過用TSB肉湯培養(yǎng)擴(kuò)繁24h后，經(jīng)過0.3%甲醛滅活11 13h，三個血清型的抗原以1:1:1的比例混合，然后加入與抗原總體積相等的油相，再經(jīng)乳化制備而成。該疫苗佐劑為白油，此佐劑疫苗副反應(yīng)較大，會在注射部位形成炎癥或腫脹；另外據(jù)研究資料顯示，使用礦物油佐劑會在一定程度上激發(fā)和提高豬圓環(huán)等豬病的發(fā)病率。而且，該疫苗制備過程中，所獲得的抗原沒有滅活后滅活效果的判定及相關(guān)檢驗，無法得知抗原滅活是否完全，所獲得的抗原不能作為制苗用抗原。因此，現(xiàn)急需發(fā)明一種副作用小，不含內(nèi)毒素和不含雜蛋白，可同時免疫預(yù)防由副豬嗜血桿菌引起的副豬嗜血桿菌病和豬鏈球菌引起的豬鏈球菌病及二者的混合感染，安全有效的疫苗及其制備技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗及制備方法，該疫苗由已滅活的副豬嗜血桿菌血清4型JS株(Haemophilus Parasuis Serotype4, Strain JS ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC ;保藏日期為2011年5月18日，保藏號為CCTCC NO:M 2011172)、5型ZJ株(Haemophilus Parasuis Serotype 5, Strain ZJ ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,簡稱CCTCC ;保藏日期:2011年5月18日，保藏號:CCTCC NO:M 2011173)、豬鏈球菌血清2型SC株(Streptococcus suis Serotype 2, Strain SC ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,簡稱CCTCC ;保藏日期:2011年10月12日，保藏號:CCTCC NO:M 2011351)和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equisubsp.zooepidemicus ;購于美國菌種保藏中心，American Type Culture Collection,簡稱ATCC)抗原，以及獸醫(yī)學(xué)可接受的佐劑制成,可同時免疫預(yù)防由副豬嗜血桿菌引起的副豬嗜血桿菌病和豬鏈球菌引起的豬鏈球菌病及二者的混合感染，該疫苗副作用小，不含內(nèi)毒素和血清中不含雜蛋白，具有較好的免疫安全性。為此，本發(fā)明提供了一種副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗，包括:抗原和佐劑，其中，所述抗原包含副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的滅活抗原濃縮-重懸稀釋液。所述副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的滅活抗原濃縮-重懸稀釋液的總含量為疫苗總量的70% 90% (V/V)。所述副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的滅活抗原濃縮-重懸稀釋液的體積比為2.5: 2.5:1:1 3.5: 3.5:1:1。上述用語“疫苗總量”指的是抗原和佐劑的總量。 在本發(fā)明的一個 優(yōu)選實施例中，所述疫苗含副豬嗜血桿菌血清4型JS株滅活抗原濃縮-重懸稀釋液滅活前活菌數(shù)不少于1.0X 109CFU/mL ;所述副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株滅活抗原濃縮-重懸稀釋液滅活前活菌數(shù)不少于1.0 X 109CFU/mL ;所述豬鏈球菌2型SC株滅活抗原濃縮-重懸稀釋液滅活前活菌數(shù)不少于5 X 108CFU/mL ;所述馬鏈球菌獸疫亞種滅活抗原濃縮-重懸稀釋液滅活前活菌數(shù)不少于5X 108CFU/mL。在本發(fā)明的一個其他實施例中，本發(fā)明所述抗原還可以采用其他致病性副豬嗜血桿菌血清型菌株以及其他豬鏈球菌血清型菌株；所述其他致病性副豬嗜血桿菌血清型菌株包括副豬嗜血桿菌血清2型、血清12型、血清13型等中的一種或兩種；其他豬鏈球菌血清型菌株為豬鏈球菌血清7型。根據(jù)本發(fā)明，所述佐劑為獸醫(yī)學(xué)可接受的水性佐劑，其含量為10% 30% (V/V)。所述獸醫(yī)學(xué)可接受的水性佐劑為Montanide GEL系列佐劑，包括GEL OlPR或MontanidePET GEL A0在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述疫苗中還含有防腐劑，包括硫柳汞、二甲基汞或疊氮鈉，其含量為疫苗總量的O 0.01% (V/V)。本發(fā)明還提供了一種本發(fā)明所述疫苗的制備方法，包括:步驟A，將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種分別進(jìn)行繁殖制備其生產(chǎn)用毒株，并對該產(chǎn)物進(jìn)行純粹檢驗；步驟B，將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種生產(chǎn)用毒 株分別接種到其制苗用培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)制得抗原液，并對該產(chǎn)物進(jìn)行純粹檢驗及活菌計數(shù)；步驟C，副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種抗原液分別經(jīng)滅活制得其滅活抗原液，并對該產(chǎn)物進(jìn)行滅活檢驗和安全性檢驗；步驟D，副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種滅活抗原液分別經(jīng)濃縮制得其滅活抗原濃縮液；步驟E，將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種滅活抗原濃縮液與佐劑混合乳化制備副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活乳劑疫苗，并對該產(chǎn)物進(jìn)行無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗；步驟F，副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活乳劑疫苗分裝、貯存；其中，步驟E包括用稀釋劑將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的抗原濃縮液重懸稀釋；將所獲得的四種抗原濃縮-重懸稀釋液混合，再加入佐劑混合乳化，并在乳化結(jié)束前加入防腐劑，制得副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗。根據(jù)本發(fā)明，步驟E中所述稀釋劑為生理鹽水；所述重懸稀釋包括:將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株的抗原濃縮液稀釋至濃度為2.8X 109CFU/mL
4.5X 109CFU/mL，將豬鏈球菌2型SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的抗原濃縮液均稀釋至 5.0X 109CFU/mL 5.5X 109CFU/mL。根據(jù)在本發(fā)明方法，步驟A包括對副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種進(jìn)行一級種子繁殖及二級種子繁殖制得副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種生產(chǎn)用毒株。在本發(fā)明的一個具體的實施例中，對副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種進(jìn)行一級種子繁殖。將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株凍干菌種，分別劃線接種于TSA/NAD平板上，于37°C條件下，培養(yǎng)18 24h，選取符合要求的菌落，接種于TSB/NAD液體培養(yǎng)基中，于37°C條件下，培養(yǎng)12 16h，作為一級種子；豬鏈球菌2型SC株、C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株凍干菌種，分別劃線接種于Clumbia羊血平板上，于37°C條件下，培養(yǎng)18 24h作為一級種子。在本發(fā)明的另一個實施例中，對副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種進(jìn)行二級種子繁殖。將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株取一級種子的培養(yǎng)物，按I %的量加入TSB/NAD液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12 16h，經(jīng)檢驗純粹后作為二級種子；豬鏈球菌2型SC株、C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株分別選取符合要求的一級種子，接種于含有15ml/L犢牛血清的改良馬丁肉湯培養(yǎng)基中，于37°C條件下，靜置培養(yǎng)12 16h，經(jīng)羊血平板純粹檢驗合格后作為二級種子；將所獲得的二級種子用作生產(chǎn)用毒株。根據(jù)本發(fā)明方法，步驟B中所述制苗用培養(yǎng)基包括:副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基及其輔助因子，豬鏈球菌培養(yǎng)基及其輔助因子；其中，所述副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基為胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基，其輔助因子包括小牛血清、葡萄糖；所述豬鏈球菌培養(yǎng)基為改良馬丁肉湯培養(yǎng)基，其輔助因子包括犢牛血清、葡萄糖。在本發(fā)明的一個具體的實施例中，接種副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株生產(chǎn)用毒株所采用的制苗用培養(yǎng)基為市售副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基(TSB:胰蛋白胨17.0g/L、大豆蛋白胨3.0g/L、氯化鈉5.0g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氫二鉀15.0g/L);接種豬鏈球菌2型SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種生產(chǎn)用毒株所采用的制苗用培養(yǎng)基為豬鏈球菌培養(yǎng)基(改良馬丁肉湯:蛋白胨5.0g/L、硫酸鎂0.5g/`L、葡萄糖20.0g/L、酵母粉2.0g/L、磷酸氫二鉀 1.0g/L)。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施例中，步驟C分別向增殖培養(yǎng)獲得的副豬嗜血桿菌4型JS株菌液、5型ZJ株菌液和豬鏈球菌2型SC株、豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種抗原液中按總量的0.2% (V/V)分別加入甲醛溶液，放置于37°C滅活24h，期間攪拌3 5次。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個實施例中，也可以采用β-丙內(nèi)酯(BPL)、縮水甘油醛(GDA) ,60Co照射和加熱等其他滅活方法。根據(jù)本發(fā)明方法，步驟D采用切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，并同時除去毒素和雜蛋白，所用超濾膜的截留分子量為500KD 1000KD。在本發(fā)明的一個其他的實施例中，步驟D還可以采用其他分離技術(shù)進(jìn)行濃縮，并同時除去毒素和雜蛋白。所屬其他技術(shù)包括:離心法、中空纖維超濾法、石棉及活性碳吸附法、凝膠層析法、鋁膠吸附沉淀法等。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施例中，步驟F以適量體積分裝副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗，蓋上瓶塞，并壓鋁蓋。根據(jù)本發(fā)明方法，所述疫苗的制備過程中，步驟A包含對所獲得的生產(chǎn)用毒株進(jìn)行純粹檢驗；步驟B包含對所獲得的四種抗原液進(jìn)行純粹檢驗及活菌計數(shù)；步驟C包含對所獲得的滅活抗原液進(jìn)行滅活檢驗和安全性檢驗；步驟E包含對所獲得的副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行物理性狀檢驗、無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗。以確保疫苗的安全性、可靠性。根據(jù)本發(fā)明，所述純粹檢驗是在培養(yǎng)結(jié)束后，取樣，并根據(jù)《中華人民共和國獸藥典(2010年版)》附錄對樣品進(jìn)行純粹檢驗，結(jié)果應(yīng)為純粹。所述活菌計數(shù)是在培養(yǎng)結(jié)束后，取樣，副豬嗜血桿菌用TSA/NAD平板培養(yǎng)進(jìn)行活菌計數(shù)；豬鏈球菌用血瓊脂平板進(jìn)行活菌計數(shù)，以確定培養(yǎng)的菌數(shù)。所述無菌檢驗是按照《中華人民共和國獸藥典》附錄對待測樣品進(jìn)行無菌檢驗，結(jié)果應(yīng)為無菌生長。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個具體實施例中，步驟C對所獲得的滅活抗原液進(jìn)行滅活檢驗，是取已經(jīng)滅活的副豬嗜血桿菌抗原液5mL接種于IOOmL含0.01% 0.05% NAD、5 % 10 %的血清、0.1 % 5 %的葡萄糖的副豬嗜血桿菌TSB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，再移植于上述IOOmL培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24h ;取滅活的副豬嗜血桿菌抗原液0.5mL劃線接種于TSA/NAD平板培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h。兩種方法培養(yǎng)后，均應(yīng)無菌生長。取已經(jīng)滅活的豬鏈球菌抗原液5mL接種于IOOmL加入1.5%的犢牛血清、0.1% 5%的葡萄糖改良馬丁肉湯培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，再移植于上述IOOmL培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24h ;取已經(jīng)滅活的豬鏈球菌菌液0.5mL劃線接種于羊血瓊脂平板培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h。兩種方法培養(yǎng)后，均應(yīng)無菌生長。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個具體實施例中，步驟C對已滅活抗原液進(jìn)行安全性檢驗，是取已滅活的菌液分別靜脈注射18 22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2mL，三天內(nèi)5/5健活，方為滅活徹底。在根據(jù)本發(fā)明 方法的又一具體實施例中，步驟E對副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行安全檢驗。對小白鼠的安全性:取三批副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗分別接種18 22g的Balb/C小鼠，每只皮下注射0.4ml，觀察14日，無局部反應(yīng)且全部健活為合格。對仔豬的安全性:取三批副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗各肌肉注射30日齡健康易感豬5頭，每頭4mL，14日內(nèi)無局部反應(yīng)且全部健活為合格。根據(jù)本發(fā)明方法，對副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗進(jìn)行效力檢驗。Balb/C小鼠效力試驗:18 22g的Balb/C小鼠，皮下接種0.1mL 二聯(lián)滅活苗，免后28天分成3組，連同對照組每組各10只，分別用副豬嗜血桿菌血清4型JS株腹腔注射5LD5(I(含菌量為4.0X IO9CFU)，5型ZJ株進(jìn)行腹腔注射5LD5(I(含菌量為2.5X IO9CFU);豬鏈球菌2型SC株皮下注射2LD5(i (含菌量為1.0X IO2CFU)，豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株皮下注射5LD5(I (含菌量為4.0X IO2CFU)另外10只設(shè)為空白對照，觀察14天。仔豬效力試驗:取副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗，每組疫苗各用21 35日齡的健康易感豬20頭，每頭肌肉注射2mL，含I個使用劑量，28天后，將注射了每種疫苗的免疫試驗豬隨機(jī)分為四組，分別用所述副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型SC株和馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株各自攻毒。對照豬20頭，分四組，分別用所述副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型SC株和馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246 株。副豬嗜血桿菌血清4型JS株:選取免疫豬各5頭，連同條件相同的對照豬5頭，腹腔注射I個發(fā)病量的血清4型JS株菌液，觀察14天，免疫豬4/5以上保護(hù)，對照豬4/5以上發(fā)病。副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株:選取免疫豬5頭，連同條件相同的對照豬5頭，腹腔注射I個發(fā)病量的血清5型ZJ株菌液，觀察14天，免疫豬4/5以上保護(hù)，對照豬4/5以上發(fā)病。豬鏈球菌2型SC株:選取免疫豬5頭，連同條件相同的對照豬5頭，靜脈注射I個致死量的豬鏈球菌2型SC株菌液，觀察14天，免疫豬4/5以上保護(hù)，對照豬4/5以上死亡。馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株:選取免疫豬5頭，連同條件相同的對照豬5頭，靜脈注射I個致死量的豬鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株菌液，觀察14天，免疫豬4/5以上保護(hù)，對照豬4/5以上死亡。本發(fā)明基于現(xiàn)有技術(shù)不足而提供一種可以同時預(yù)防由副豬嗜血桿菌引起的副豬嗜血桿菌病和豬鏈球菌引起的豬鏈球菌病及二者的混合感染的副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+馬鏈球菌獸疫亞種)。該疫苗副作用小，不含內(nèi)毒素和血清中不含雜蛋白，具有較好的免疫安全性，臨床上達(dá)到一針多防的效果，降低成本，并可以滿足不同用戶的要求。mmm副豬嗜血桿菌血清4 型 JS 株(Haemophilus Parasuis Serotype 4, Strain JS),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ；地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏號:CCTCC NO:M 2011172。副豬嗜血桿菌血清5 型 ZJ 株(Haemophilus Parasuis Serotype 5, Strain ZJ)，由普萊柯生物工程股份 有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ；地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏號:CCTCC NO:M 2011173。豬鏈球菌血清2 型 SC 株(Streptococcus suis Serotype 2, Strain SC),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ;地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學(xué))進(jìn)行保藏，保藏日期:2011年10月12日，保藏號:CCTCC NO:M 2011351。豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株(Streptococcus equisubsp.zooepidemicus),購于美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection,簡稱ATCC)。為獲得免疫性強(qiáng)的菌種，各菌種經(jīng)敏感豬體復(fù)壯鑒定合格后凍干保存并保藏。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實施例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明的具體實驗方法可參見《中華人民共和國獸藥典(二〇一〇年版)》及附錄。其他未注明的試劑或原料均可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)獲得。實施例
實施例1:制備副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株)1.制備生產(chǎn)用毒株對副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株和豬鏈球菌2型SC株、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株進(jìn)行一級種子繁殖及二級種子繁殖制得副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株和豬鏈球菌2型SC株、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株的生產(chǎn)用毒株。(I) 一級種子繁殖對副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株和豬鏈球菌2型SC株、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株進(jìn)行一級種子繁殖。將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株凍干菌種，分別劃線接種于TSA/NAD平板上，于37°C條件下，培養(yǎng)18h，選取符合要求的菌落，接種于TSB/NAD液體培養(yǎng)基中，于37°C條件下，培養(yǎng)12h，作為一級種子；豬鏈球菌2型SC株、、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株凍干菌種，劃線接種于Clumbia羊血平板上，于37°C條件下，培養(yǎng)18h作為一級種子。(2) 二級種子繁殖對副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株和豬鏈球菌2型SC株、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株一級種子進(jìn)行二級種子繁殖。將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株一級種子，按1%的量加入TSB/NAD液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h，經(jīng)純粹檢驗合格后作為二級種子；豬鏈球菌2型SC株、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株選取符合要求的一級種子，接種于含有15ml/L犢牛血清的改良馬丁肉湯培養(yǎng)基中，于37°C條件下，靜置培養(yǎng)12h，經(jīng)羊血平板純粹檢驗合格后作為二級種子，將所獲得的二級種子用作生產(chǎn)用毒株。2.制備抗原液(I)制備抗原液在副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基(市售TSB:胰蛋白胨17.0g/L、大豆蛋白胨3.0g/L、氯化鈉5.0g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氫二鉀15.0g/L)中，加入0.05% NAD、10%的血清、5%的葡萄糖配制成制苗培養(yǎng)基，將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株生產(chǎn)用毒株分別按1%的量加進(jìn)制苗培養(yǎng)基中，各自混合均勻后，分別進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:溫度為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為180rmp，D0為80 0，ρΗ值為7.2 6.5，培養(yǎng)時間為18h。當(dāng)培養(yǎng)液液的濃度OD6tltl達(dá)到2.5以上、DO值降至O后又開始上升、pH值降低至6.5以下時停止培養(yǎng)，分別收獲抗原液。在豬鏈球菌培養(yǎng)基(市售改良馬丁肉湯:蛋白胨5.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、葡萄糖20.0g/L、酵母粉2.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L)中，加入1.5 %的犢牛血清、5 %的葡萄糖配制成制苗培養(yǎng)基，將豬鏈球菌2型SC株、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株生產(chǎn)用毒株按5%的量加進(jìn)制苗培養(yǎng)基中，混合均勻后進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:溫度為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速為200rmp, DO為80 0，pH值7.4 6.5，培養(yǎng)時間為18h。當(dāng)培養(yǎng)液的濃度OD600達(dá)到2.5以上、DO值降至O后又開始上升、pH值降低至6.0以下時停止培養(yǎng)，分別收獲抗原液。(2)純粹檢驗培養(yǎng)結(jié)束后，分別從所獲得的四種抗原液中取樣，根據(jù)《中華人民共和國獸藥典(2010年版)》附錄進(jìn)行純粹檢驗， 應(yīng)純粹。
(3)活菌計數(shù)
分別從所獲得的四種抗原液中取樣，副豬嗜血桿菌用TSA/NAD平板培養(yǎng)進(jìn)行活菌計數(shù)；豬鏈球菌用血瓊脂平板進(jìn)行活菌計數(shù)，以確定培養(yǎng)的菌數(shù)。3.抗原液滅活(I)抗原液滅活 檢驗合格的抗原液分別進(jìn)行滅活。向上述四種培養(yǎng)好的抗原液中，按總量的0.2%(V/V)加入甲醛溶液，并于37°C條件下滅活24h，期間攪拌5次。(2)滅活檢驗分別取已經(jīng)滅活的2種副豬嗜血桿菌抗原液5mL接種于IOOmL含有0.05% NAD、10 %的小牛血清、5 %的葡萄糖的副豬嗜血桿菌TSB培養(yǎng)基中，在37 V條件下培養(yǎng)24h，再移植于上述IOOmL培養(yǎng)基中，并于37°C條件下培養(yǎng)24h ;取滅活的2種副豬嗜血桿菌菌液
0.5mL劃線接種于TSA/NAD平板培養(yǎng)基，于37°C條件下培養(yǎng)24h。兩種方法培養(yǎng)后，均應(yīng)無菌生長。取已經(jīng)滅活的豬鏈球菌抗原液5mL接種于IOOmL,含有1.5%的犢牛血清、5%的葡萄糖的改良馬丁肉湯培養(yǎng)基中，于37°C條件下培養(yǎng)24h，再移植于上述IOOmL培養(yǎng)基中，于37°C條件下培養(yǎng)24h ;取已經(jīng)滅活的豬鏈球菌抗原液0.5mL劃線接種于羊血瓊脂平板培養(yǎng)基，于37°C條件下培養(yǎng)24h。兩種方法培養(yǎng)后，均應(yīng)無菌生長。(3)安全性檢驗取上述四種滅活抗原液分別靜脈注射18 22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2mL,三天內(nèi)5/5健活，方為滅活徹底。4.超濾濃縮將上述四種滅活抗原液用美國Millipore公司的Pellicon切向流超濾系統(tǒng)濃縮，制得其滅活抗原濃縮液。5.配制副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株)(I)第一批(批號 09001)用生理鹽水重懸稀釋上述四種滅活抗原濃縮液，參照菌落計數(shù)結(jié)果，將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株的抗原濃縮液稀釋至濃度至少為4.5X 109CFU/mL，將豬鏈球菌2型SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株的抗原濃縮液稀釋至濃度為
5.0X109CFU/mL。將四種抗原濃縮-重懸稀釋液按2.5: 2.5: I: I的體積比混合。按照70% (V/V)的量取四種抗原濃縮-重懸稀釋液混合物，再按照30% (V/V)量加入佐劑混合乳化，并在乳化結(jié)束前加入疫苗總量的0.01% (V/V)的硫柳汞，制得副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗。(2)第二批(批號 O9OO2)用生理鹽水重懸稀釋上述四種滅活抗原濃縮液，參照菌落計數(shù)結(jié)果，將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株的抗原濃縮液稀釋至濃度為3.3X109CFU/mL,將豬鏈球菌2型SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株的抗原濃縮液稀釋至濃度為
5.5X109CFU/mL。將四種抗原濃縮-重懸稀釋液按3.0: 3.0: I: I的體積比混合。按照80% (V/V)的量取四種抗原濃縮-重懸稀釋液混合物，再按照20% (V/V)量加入佐劑混合乳化，制得副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗。
(3)第三批(批號 O9OO3)用生理鹽水重懸稀釋上述四種滅活抗原濃縮液，參照菌落計數(shù)結(jié)果，將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株的抗原濃縮液稀釋至濃度為2.8X IO9CFU,將豬鏈球菌2型SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株的抗原濃縮液稀釋至濃度為
5.5X109CFU/mL。將四種抗原濃縮-重懸稀釋液按3.5: 3.5: I: I的體積比混合。按照90% (V/V)的量取四種抗原濃縮-重懸稀釋液混合物，再按照10% (V/V)量加入佐劑混合乳化，并在乳化結(jié)束前加入疫苗總量的0.01% (V/V)的二甲基汞，制得副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗。6、疫苗的物理性狀檢測、無菌檢驗對所制備的3批副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗(JS株+ZJ株+SC株+馬鏈球菌獸疫亞種)(批號分別為09001、09002、09003)進(jìn)行物理性狀檢測，按照《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行無菌檢驗，結(jié)果無菌生長(見表I)。表I 二聯(lián)滅活疫苗物理性狀檢驗及無菌檢驗
權(quán)利要求
1.一種副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗，包括:抗原和佐劑，其中，所述抗原包含副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的滅活抗原濃縮-重懸稀釋液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于:所述副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的滅活抗原濃縮-重懸稀釋液的總含量為疫苗總量的70% 90% (V/V)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于:所述副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的滅活抗原濃縮-重懸稀釋液的體積比為 2.5: 2.5:1:1 3.5: 3.5:1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于:所述疫苗含副豬嗜血桿菌血清4型JS株滅活抗原濃縮-重懸稀釋液滅活前活菌數(shù)不少于1.0X 109CFU/mL ;所述副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株滅活抗原濃縮-重懸稀釋液滅活前活菌數(shù)不少于1.0X 109CFU/mL ;所述豬鏈球菌2型SC株滅活抗原濃縮-重懸稀釋液滅活前活菌數(shù)不少于5 X 108CFU/mL ;所述馬鏈球菌獸疫亞種滅活抗原濃縮-重懸稀釋液滅活前活菌數(shù)不少于5X 108CFU/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于:所述佐劑為獸醫(yī)學(xué)可接受的水性佐劑，其含量為10% 30% (V/V);所述獸醫(yī)學(xué)可接受的水性佐劑為Montanide GEL系列佐劑，包括 GEL 01 PR 或 Montanide PET GEL A。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于:所述疫苗中還含有防腐劑，包括硫柳汞、二甲基汞或疊氮鈉，其含量為疫苗總量的O 0.01% (V/V)。
7.—種權(quán)利要求1 6中任意一項所述疫苗的制備方法,包括: 步驟A，將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種分別進(jìn)行繁殖制備其生產(chǎn)用毒株，并對該產(chǎn)物進(jìn)行純粹檢驗； 步驟B，將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種生產(chǎn)用毒株分別接種到其制苗用培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)制得抗原液，并對該產(chǎn)物進(jìn)行純粹檢驗及活菌計數(shù)； 步驟C，副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種抗原液分別經(jīng)滅活制得其滅活抗原液，并對該產(chǎn)物進(jìn)行滅活檢驗和安全性檢驗； 步驟D，副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種滅活抗原液分別經(jīng)濃縮制得其滅活抗原濃縮液； 步驟E，將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種滅活抗原濃縮液與佐劑混合乳化制備副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活乳劑疫苗，并對該產(chǎn)物進(jìn)行無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗； 步驟F，副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活乳劑疫苗分裝、貯存； 其特征在于:步驟E包括用稀釋劑將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的抗原濃縮液重懸稀釋；將所獲得的四種抗原濃縮-重懸稀釋液混合，再加入佐劑混合乳化，并在乳化結(jié)束前加入防腐劑，制得副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法， 其特征在于:步驟E中所述稀釋劑為生理鹽水；所述重懸稀釋包括:將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株的抗原濃縮液稀釋至濃度為·2.8 X 109CFU/mL 4.5 X 109CFU/mL,將豬鏈球菌2型SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的抗原濃縮液均稀釋至5.0X 109CFU/mL 5.5X 109CFU/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:步驟B中所述制苗用培養(yǎng)基包括:副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基及其輔助因子，豬鏈球菌培養(yǎng)基及其輔助因子；其中，所述副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基為胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基，其輔助因子包括小牛血清、葡萄糖；所述豬鏈球菌培養(yǎng)基為改良馬丁肉湯培養(yǎng)基，其輔助因子包括犢牛血清、葡萄糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:步驟D采用切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，并同時除去毒素和雜蛋白， 所用超濾膜的截留分子量為500KD 1000KD。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病二聯(lián)滅活疫苗及制備方法，該疫苗由已滅活的副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株、豬鏈球菌2型R群SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種作為抗原，以及獸醫(yī)學(xué)可接受的佐劑制成，可同時免疫預(yù)防由副豬嗜血桿菌引起的副豬嗜血桿菌病和豬鏈球菌引起的豬鏈球菌病及二者的混合感染，該疫苗副作用小，不含內(nèi)毒素和血清中不含雜蛋白，具有較好的免疫安全性，臨床上達(dá)到一針多防的效果，降低成本，并可以滿足不同用戶的要求。
文檔編號A61K39/102GK103157101SQ201110407619
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者張許科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司