專利名稱：一種具有治療原發(fā)性痛經(jīng)的中藥復(fù)方揮發(fā)油部位及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥復(fù)方，具體涉及一種具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油及其制備方法和其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
痛經(jīng)為婦科最常見的癥狀之一，約有75％的婦女發(fā)生痛經(jīng)。痛經(jīng)分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類；原發(fā)性痛經(jīng)是指月經(jīng)前及行經(jīng)期間，下腹及腰部痙攣性疼痛，嚴(yán)重時(shí)伴有惡心、嘔吐、肢冷，尤其多見于未婚青年婦女。流行病學(xué)研究表原發(fā)性痛經(jīng)是目前婦科最常見疾病，國(guó)外報(bào)道婦女原發(fā)性痛經(jīng)的比例高達(dá)43％～90％，國(guó)內(nèi)報(bào)道痛經(jīng)發(fā)病率為33.1％，其中原發(fā)性痛經(jīng)占53.2％，中醫(yī)藥治療婦科疾病有悠久的歷史，其治則為發(fā)時(shí)攻邪治標(biāo)，未發(fā)之時(shí)扶正治本，從目前臨床原發(fā)性痛經(jīng)治療來看，以辨證辨病結(jié)合，中醫(yī)藥愈加顯現(xiàn)其獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)，但目前治療痛經(jīng)的復(fù)方藥物多存在使用不便、用藥量大、有效部位不明確，并存在一定的不良反應(yīng)等問題，因此很有必要在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下開發(fā)出一種療效確切，副作用小、服用方便的治療痛經(jīng)的藥物。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種療效好、副作用小、有效成分明確、服用方便的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油，本發(fā)明另一個(gè)目的是提供該中藥復(fù)方揮發(fā)油的制備方法和其在制備治療原發(fā)性痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油，它是由下列重量份數(shù)的原料通過水蒸氣蒸餾的方法制備得到，當(dāng)歸8～10份、川芎8～10份、熟地8～10份、白芍8～10份、桃仁8～10份、紅花5～7份。
作為優(yōu)選方案，本發(fā)明提供的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油，它是由下列重量份數(shù)的原料通過水蒸氣蒸餾的方法制備得到，當(dāng)歸9份、川芎9份、熟地9份、白芍9份、桃仁9份、紅花6份。
本發(fā)明在前期對(duì)古今治療原發(fā)性痛經(jīng)方劑進(jìn)行篩選，在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，辨證施治，結(jié)合原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)理和發(fā)病癥狀，以活血化瘀為治療依據(jù)進(jìn)行篩選處方，確定以當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地配伍活血祛瘀藥桃仁、紅花六味中藥進(jìn)行組方，整方具有活血化瘀、養(yǎng)血補(bǔ)血的雙重功效，主用于婦科血虛血瘀病癥，方中當(dāng)歸補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛；熟地黃滋陰補(bǔ)血，益精填髓；白芍養(yǎng)血柔肝，緩急止痛；川芎活血祛瘀，行氣止痛，四藥相配，動(dòng)靜結(jié)合，滋而不膩，溫而不燥，補(bǔ)而不滯，剛?cè)嵯酀?jì)，陰陽調(diào)和，營(yíng)血得生，共奏補(bǔ)血和血之功，再配伍桃仁和紅花藥對(duì)使組方補(bǔ)血而不留瘀，行血而不傷血。組方六位中藥中富含揮發(fā)性成分，揮發(fā)性成分在中醫(yī)藥理論中具有升發(fā)特點(diǎn)，具有行血、活血、通經(jīng)絡(luò)功效，用于治療血瘀疼痛，本發(fā)明在中醫(yī)藥辨證施治的指導(dǎo)下組方，并根據(jù)組方藥味的理化性質(zhì)特點(diǎn)，采用水蒸氣蒸餾方法制備得到揮發(fā)油，根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)表明，所得的揮發(fā)油部位去除了大量其它非揮發(fā)性成分，活性成分更明確，活血化瘀作用強(qiáng)。
本發(fā)明提供的制備具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油的方法，其包括以下步驟 (1)稱取組方中相應(yīng)重量份數(shù)的原料，混合、粉碎，置于圓底燒瓶中，加總原料6～10倍量的純凈水，振搖混合，浸泡20～60分鐘； (2)將圓底燒瓶連接揮發(fā)油提取器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流入圓底燒瓶時(shí)為止，然后將圓底燒瓶置電熱套中緩緩加熱至水沸騰，并保持水微沸至提取器中油量不再增加，停止加熱，放置冷卻，開啟揮發(fā)油提取器下端活塞，將水緩緩放出，收集揮發(fā)油，并量取揮發(fā)油的量； (3)取步驟(2)得到的揮發(fā)油經(jīng)無水硫酸鈉干燥，得黃色透明揮發(fā)油。
作為優(yōu)選方案，以上所述的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油的制備方法，其中步驟(1)中加入純凈水的量是總原料的10倍，使提取溶液和藥材之間達(dá)到足夠大的濃度差，增加揮發(fā)性成分的溶出率，并且振搖混合后浸泡30分鐘，使藥材充分溶漲，可以提高揮發(fā)性成分溶出，提高得油率。
作為優(yōu)選方案，其中步驟(2)中圓底燒瓶置于電熱套后加熱至110℃使圓底燒瓶?jī)?nèi)溶液沸騰，并保持微沸8小時(shí)，此操作步驟，加熱溫度不能太高，因?yàn)閾]發(fā)油成分在高溫下容易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，或者聚合成其它結(jié)構(gòu)從而失去原有的活性，降低功效。
本發(fā)明采用水蒸氣蒸餾方法制備所得中藥復(fù)方揮發(fā)油的得率為總原料的0.106％，現(xiàn)有技術(shù)中一般采用水蒸氣蒸餾法提取單位藥材中的揮發(fā)油成分，本發(fā)明首次采用水蒸氣蒸餾方法提取由六位中藥組成的復(fù)方中的揮發(fā)油成分，提取效率高。
本發(fā)明提供的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油在制備原發(fā)性痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用。作為優(yōu)選方案，把中藥復(fù)方揮發(fā)油和藥學(xué)上可接受的載體制成膠囊劑、噴霧劑、注射劑、微囊、片劑、軟膏劑或透皮控釋貼劑劑型的藥物。
本發(fā)明提供的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油在制成片劑時(shí)把中藥復(fù)方揮發(fā)油和載體乳糖或玉米淀粉，需要時(shí)加入潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。本發(fā)明提供的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油制成膠囊劑時(shí)把中藥復(fù)方揮發(fā)油和載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。本發(fā)明提供的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油制成顆粒劑時(shí)，把中藥復(fù)方揮發(fā)油和稀釋劑乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。
有益效果本發(fā)明提供的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油具有以下優(yōu)點(diǎn) (1)本發(fā)明提供的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油，根據(jù)中醫(yī)藥理論和原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制選取原料配伍組方，各組份配比科學(xué)合理，通過藥理實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方經(jīng)水蒸氣蒸餾方法制備所得揮發(fā)油具有很好的活血化瘀、止痛作用，且長(zhǎng)期使用無不良反應(yīng)，本發(fā)明提供的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油可以方便的和藥學(xué)上可接受的載體制備成各種劑型的藥物，方便服用。
(2)本發(fā)明提供的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油的制備方法，可操作性強(qiáng)，可以很好的提出由六位中藥組成的復(fù)方中的揮發(fā)油成分，提取效率高，且制備方法成本低、環(huán)保、可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例1 一種中藥復(fù)方揮發(fā)油的制備方法，具體包括以下步驟 (1)取當(dāng)歸180g，川芎180g，熟地180g，白芍180g，桃仁180g和紅花120g組成全方共1020g，粉碎后置于20000mL圓底燒瓶中，加總藥材量10倍量的純凈水，振搖混合后，浸泡30min； (2)將圓底燒瓶連接揮發(fā)油提取器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時(shí)為止，將圓底燒瓶置電熱套中緩緩加熱至110℃沸騰，并保持微沸8小時(shí)，至測(cè)定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測(cè)定器下端活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達(dá)刻度0線上面5mm處時(shí)關(guān)閉測(cè)定器下端活塞，放置1小時(shí)，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0線平齊，收集揮發(fā)油成分，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后得黃色透明油狀揮發(fā)油1.2mL，具有特殊濃郁氣味。
實(shí)施例2 一種中藥復(fù)方揮發(fā)油的制備方法，具體包括如下步驟 (1)取360g，川芎360g，熟地360g，白芍360g，桃仁360g，紅花240g組成全方共2040g，粉碎后置于20000mL圓底燒瓶中，加總藥材量8倍量的純凈水，振搖混合后，浸泡40min； (2)將圓底燒瓶連接揮發(fā)油提取器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時(shí)為止，將圓底燒瓶置電熱套中緩緩加熱至110℃沸騰，并保持微沸10小時(shí)，至測(cè)定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測(cè)定器下端活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達(dá)刻度0線上面5mm處時(shí)關(guān)閉測(cè)定器下端活塞，放置1.5小時(shí)，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0線平齊，收集揮發(fā)油成分，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后得黃色透明油狀揮發(fā)油2.5mL，具有特殊濃郁氣味。
實(shí)施例3 本發(fā)明提供的中藥復(fù)方揮發(fā)油治療原發(fā)性痛經(jīng)的實(shí)驗(yàn)研究 選取健康ICR雌性小鼠36只，體重18～22g，隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥復(fù)方揮發(fā)油組，各12只，以雌激素和縮宮素聯(lián)合制造原發(fā)性痛經(jīng)模型。具體方法為實(shí)驗(yàn)周期為7d，第1-6d給小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇1mg/kg，第5-7d灌胃給揮發(fā)油24μl/kg/d(20g生藥kg/d)，模型組灌同體積蒸餾水，第6d晚至第7d給藥前禁食不禁水。第7d給藥30min后腹腔注射縮宮素2U/只，造成小鼠“痛經(jīng)”模型，觀察記錄小鼠扭體潛伏期和40min內(nèi)的扭體次數(shù)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示 表1中藥復(fù)方揮發(fā)油對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠扭體潛伏期和扭體次數(shù)的影響情況
正常對(duì)照組與模型組比較，**P＜0.01；給藥組與模型組比較，**P＜0.01 由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方揮發(fā)油能夠明顯延長(zhǎng)小鼠扭體潛伏期(P＜0.01)，降低小鼠的扭體次數(shù)(P＜0.01)，與模型組相比本發(fā)明提供的中藥復(fù)方揮發(fā)油對(duì)小鼠原發(fā)性痛經(jīng)具有很好的防治作用，且未見不良反應(yīng)。
實(shí)施例4 本發(fā)明提供的中藥復(fù)方揮發(fā)油對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)小鼠子宮組織勻漿中Ca2+、NO、MDA、SOD和GSH-PX濃度的影響 在小鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型中，觀察記錄小鼠扭體潛伏期和40min內(nèi)的扭體次數(shù)后，將小鼠脫頸處死，迅速剖腹，取出子宮，按試劑盒要求，以冰凍的生理鹽水洗凈拭干稱重，制成10％的子宮組織勻漿，以3000rpm/min低溫離心15min，取上清液冷藏保存待測(cè)。采用南京建成生物有限公司試劑盒測(cè)定小鼠子宮勻漿中NO、MDA(丙二醛)、SOD(超氧化物歧化酶)和GSH-PX(谷胱甘肽過氧化物酶)濃度測(cè)定。均按試劑盒說明書的實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格操作，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和表3所示 表2中藥復(fù)方揮發(fā)油對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)小鼠子宮組織勻漿中Ca2+、NO濃度的影響
正常對(duì)照組與模型組比較，**P＜0.01；給藥組與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05 由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，中藥復(fù)方揮發(fā)油組中Ca2+濃度明顯低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。痛經(jīng)時(shí)，子宮發(fā)生缺血-再灌注損傷，使鈣離子大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載引起細(xì)胞的能量耗竭、細(xì)胞膜受損，此處還可以導(dǎo)致子宮肌攣縮。研究表明，鈣離子超載可導(dǎo)致細(xì)胞核鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，這一切均引起并加重了子宮肌缺血-再灌注損傷。藥物通過降低組織內(nèi)鈣離子濃度，使子宮組織趨向正?；?，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方揮發(fā)油組可以很好的降低子宮組織中的Ca2+濃度，從而具有防治痛經(jīng)的功效，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，子宮中存在左旋精氨酸-NO-環(huán)磷鳥苷(cGMP)系統(tǒng)，并調(diào)節(jié)子宮收縮性。NO在細(xì)胞內(nèi)形成后通過旁分泌作用可迅速擴(kuò)散到細(xì)胞外，作用于鄰近的平滑肌細(xì)胞，激活細(xì)胞膜上的鳥苷酸環(huán)化酶，使該酶活性增大50～200倍，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cGMP生成增多，cGMP進(jìn)而激活cGMP依賴性蛋白激酶，或直接作用于細(xì)胞膜上的鈣通道，引起鈣離子外流或加速細(xì)胞內(nèi)游離鈣的的結(jié)合，從而引起平滑肌細(xì)胞舒張和血管擴(kuò)張。并且由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中藥復(fù)方揮發(fā)油組小鼠子宮中的NO含量明顯高于模型組，從而起到防治血瘀和治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用。
表3中藥復(fù)方揮發(fā)油對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)小鼠子宮組織勻漿中MDA、SOD、GSH-PX的影響
由表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，中藥復(fù)方揮發(fā)油組中小鼠子宮組織勻漿中的SOD和GSH-PX的濃度明顯高于模型組接近與正常組。痛經(jīng)時(shí)，子宮平滑肌陣發(fā)性的收縮導(dǎo)致肌間血管受壓而出現(xiàn)子宮肌層及內(nèi)膜的暫時(shí)性缺血，使子宮組織細(xì)胞由于缺血-再灌注而生成較多的自由基，清除自由基的酶系(如SOD)會(huì)相應(yīng)降低，使組織細(xì)胞內(nèi)微粒體及質(zhì)膜上的脂加氧酶與環(huán)加氧酶被激活，催化花生四烯酸代謝，形成具有高度生物活性的物質(zhì)。另外在GSH-PX的催化下，GSH可還原細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過氧化氫，使其變成水。通過GSH-PX的作用，可以有效降低子宮肌缺血-再灌注損傷時(shí)產(chǎn)生的大量過氧化物，通過這種方式對(duì)子宮肌缺血-再灌注損傷引起的痛經(jīng)起到良好的保護(hù)作用。此外細(xì)胞膜磷脂中多聚不飽和脂肪酸和脂肪酸的不飽和雙鍵極易受到氧自由基攻擊，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，激起自由基的連鎖、增殖反應(yīng)，形成一系列的脂質(zhì)自由基及其降解產(chǎn)物MDA，將進(jìn)一步引起膜的流動(dòng)性降低，通透性增高，線粒體腫脹，溶酶體破壞及溶酶體酶的釋放，更進(jìn)一步加重了子宮內(nèi)膜的損傷，加快了細(xì)胞死亡。而中藥復(fù)方揮發(fā)油組中小鼠子宮組織勻漿中的MDA的濃度低于模型組。因此本發(fā)明提供的中藥復(fù)方揮發(fā)油可以有效通過降低小鼠子宮組織勻漿中的MDA和增加小鼠子宮組織勻漿中的SOD和GSH-PX的濃度來達(dá)到防治原發(fā)性痛經(jīng)的作用。
實(shí)施例5 本發(fā)明提供的中藥復(fù)方揮發(fā)油對(duì)縮宮素刺激離體小鼠子宮組織作用實(shí)驗(yàn) 選取健康ICR雌性小鼠20只，實(shí)驗(yàn)前連續(xù)3d腹腔注射(1mg/kg)苯甲酸雌二醇，以增加子宮對(duì)縮宮素的敏感性。于第4天取出小鼠子宮，置Locke’s溶液中清洗，用細(xì)線分別扎住子宮頸端及兩側(cè)卵巢端，一端固定于浴槽底部，另一端連接在張力換能器上。置于Locke’s液20mL恒溫浴槽中，溫度為(37±0.1)℃，持續(xù)供氧，pH7.3，通過調(diào)節(jié)螺母加1g的負(fù)荷(10mN)，平衡40min，待子宮收縮穩(wěn)定，自發(fā)節(jié)律恢復(fù)后，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。預(yù)先記錄5～10min正常收縮曲線，隨后加入縮宮素注射劑10μl，作用15min后再加入中藥復(fù)方揮發(fā)油20g生藥/ml(終濃度為1g生藥/ml)并觀察記錄各組小鼠子宮組織收縮頻率、收縮幅度、平均收縮肌張力的情況，計(jì)算抑制子宮收縮的百分率(IR％)。計(jì)算公式IR(％)＝(給藥前參數(shù)-給藥后參數(shù))/給藥前參數(shù)×100。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示 表4中藥復(fù)方揮發(fā)油對(duì)縮宮素刺激離體小鼠子宮組織作用情況
正常對(duì)照組與模型組比較，**P＜0.01；給藥組與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05 由表4結(jié)果表明，與模型組相比，中藥復(fù)方揮發(fā)油可以明顯的降低小鼠離體子宮收縮頻率、收縮幅度和平均收縮肌張力，從而可以起到治療痛經(jīng)的作用。
實(shí)施例6 本發(fā)明提供的中藥復(fù)方揮發(fā)油對(duì)縮宮素刺激原代小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞作用實(shí)驗(yàn) 取20只健康ICR雌性小鼠，體重18～22g，脫椎處死，置75％酒精浸泡5min移入無菌室超凈臺(tái)，剖開腹腔取出子宮，正常小鼠子宮為“Y”型，較小，包埋于脂肪組織中，仔細(xì)將子宮與周圍脂肪等組織分離，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的4℃無菌PBS液中洗一遍，在解剖鏡下小心將子宮沿中線縱向剖開于PBS液中洗兩遍，然后置含酶液的10ml離心管中消化。10ml7.5mg/ml胰蛋白酶和25mg/ml胰酶0℃消化60min，室溫消化45min，37℃消化2min。待消化結(jié)束后，倒出含有酶液的PBS，加入含10％FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基3ml終止消化，5min后倒出培養(yǎng)基加入10mlPBS振搖1min，取出子宮組織，此時(shí)懸液中富含上皮細(xì)胞，懸液比較粘稠以1ml/支分裝于10支10ml離心管中用PBS補(bǔ)足到10ml，于1500轉(zhuǎn)離心3min，倒去上清液，加入12mlPBS靜置5min，上清液2ml棄去，1500轉(zhuǎn)離心5min，然后棄去上清液，加入DMEM/F-12培養(yǎng)基(含10％FBS，青霉素100u/ml，鏈霉素100μg/ml)，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率，以200μl每孔種到96孔板，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察可見，胰酶消化后的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈卵圓狀或葡萄串狀，接種24h后仍有部分漂浮。3天后細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，排列緊密，單個(gè)的上皮細(xì)胞呈蝌蚪狀或棒狀，細(xì)胞將生長(zhǎng)匯合至培養(yǎng)孔面積的80％左右。生長(zhǎng)至第4天，細(xì)胞鋪滿板底，第6～7天后，上皮細(xì)胞已經(jīng)完全生長(zhǎng)匯合，繼續(xù)培養(yǎng)可維持2周左右。
實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、中藥復(fù)方揮發(fā)油組。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，10-7U/ml縮宮素刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞造模，中藥揮發(fā)油組給予用培養(yǎng)液配制的終濃度為1g生藥/ml揮發(fā)油，模型組給予同等體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，然后加入20μl的MTT，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，棄去上清液，加入二甲基亞楓(DMSO)150μl振蕩，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A值)，以A值代表細(xì)胞活性，取A值均值。
流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，給藥24h后，棄去培養(yǎng)板中的液體，D-Hank’s液洗滌2次。加入Fluo-3/AM(終濃度為10μmol/L)，37℃、5％CO2避光精確孵育1小時(shí)，用D-Hank’s液液沖洗2次；用細(xì)胞刮輕輕將細(xì)胞從板上刮下，收集細(xì)胞懸液，離心，D-Hank’s液洗滌一次，300目尼龍網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞原發(fā)性痛經(jīng)離體器官模型和細(xì)胞模型的建立及應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm，檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞，取熒光強(qiáng)度平均值。
Griess試劑檢測(cè)NO含量取MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液100μl，加入Griess試劑(含1％對(duì)氨基苯磺酸，0.1％N-1-奈乙二胺鹽酸鹽，2.5％磷酸)100pl，室溫放置10分鐘，用酶標(biāo)儀讀取550nm處OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO含量。
表5中藥復(fù)方揮發(fā)油對(duì)縮宮素刺激原代小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目、Ca2+、NO的影響
正常對(duì)照組與模型組比較，**P＜0.01；給藥組與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05 由表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，中藥復(fù)方揮發(fā)油能抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞過度增殖，且能降低子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的Ca2+濃度，并增加NO的含量，Ca2+濃度的降低和NO的含量的增加均有利于擴(kuò)張血管，舒展平滑肌，從而起到防治原發(fā)性痛經(jīng)的作用。
本發(fā)明根據(jù)中醫(yī)藥理論辨證施治，根據(jù)原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)理，進(jìn)行科學(xué)組方，并采用優(yōu)選的水蒸氣蒸餾方法提取得到揮發(fā)油，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的中藥復(fù)方揮發(fā)油可以很好的舒展子宮平滑肌，擴(kuò)張血管，保持子宮組織血液流暢，抑制血瘀形成，從而起到很好的防治原發(fā)性痛經(jīng)的作用，且實(shí)驗(yàn)過程中未見不良反應(yīng)，因此本發(fā)明提供的中藥復(fù)方揮發(fā)油有望開發(fā)成為新一代防治原發(fā)性痛經(jīng)的藥物。
權(quán)利要求
1.一種具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油，其特征在于，它是由下列重量份數(shù)的原料通過水蒸氣蒸餾的方法制備得到，當(dāng)歸8～10份、川芎8～10份、熟地8～10份、白芍8～10份、桃仁8～10份、紅花5～7份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油，其特征在于，它是由下列重量份數(shù)的原料通過水蒸氣蒸餾的方法制備得到，當(dāng)歸9份、川芎9份、熟地9份、白芍9份、桃仁9份、紅花6份。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油的方法，其特征在于包括以下步驟
(1)稱取權(quán)利要求1所述的重量份數(shù)的原料，混合、粉碎，置于圓底燒瓶中，加總原料6～10倍量的純凈水，振搖混合，浸泡20～60分鐘；
(2)將圓底燒瓶連接揮發(fā)油提取器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流入圓底燒瓶時(shí)為止，然后將圓底燒瓶置電熱套中緩緩加熱至水沸騰，并保持水微沸至提取器中油量不再增加，停止加熱，放置冷卻，開啟揮發(fā)油提取器下端活塞，將水緩緩放出，收集揮發(fā)油，并量取揮發(fā)油的量；
(3)取步驟(2)得到的揮發(fā)油經(jīng)無水硫酸鈉干燥，得黃色透明揮發(fā)油。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油的制備方法，其特征在于，步驟(1)中加入純凈水的量是總原料的10倍，振搖混合后浸泡30分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油的制備方法，其特征在于，步驟(2)中圓底燒瓶置于電熱套中加熱至110℃，并保持微沸8小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油的制備方法，其特征在于，步驟(3)所得干燥后的揮發(fā)油的得率為總原料的0.106％。
7.權(quán)利要求1或2所述的具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油在制備治療原發(fā)性痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的中藥復(fù)方揮發(fā)油在制備治療原發(fā)性痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用，其特征在于把中藥復(fù)方揮發(fā)油和藥學(xué)上可接受的載體制成膠囊劑、噴霧劑、注射劑、微囊、片劑、軟膏劑或透皮控釋貼劑劑型的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有治療原發(fā)性痛經(jīng)作用的中藥復(fù)方揮發(fā)油及其制備方法和其應(yīng)用，該中藥復(fù)方揮發(fā)油是由當(dāng)歸8～10份、川芎8～10份、熟地8～10份、白芍8～10份、桃仁8～10份、紅花5～7份的原料通過水蒸氣蒸餾的方法制備得到，本發(fā)明根據(jù)中醫(yī)藥理論和原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制選取原料配伍組方，通過藥理實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的中藥復(fù)方經(jīng)水蒸氣蒸餾方法制備所得揮發(fā)油具有很好的防治原發(fā)性痛經(jīng)的作用，且長(zhǎng)期使用無不良反應(yīng)，有望開發(fā)成為新一代治療原發(fā)性痛經(jīng)的藥物。
文檔編號(hào)A61K36/804GK101829227SQ201010177158
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者段金廒, 劉立, 馬宏躍, 尚爾鑫, 唐于平 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)