專利名稱：與tpo受體結(jié)合的肽的用途的制作方法
與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
本申請(qǐng)是于2004年8月13日提交的美國申請(qǐng)系列號(hào)10/918,561的部分繼續(xù)申請(qǐng)，要求美國申請(qǐng)系列號(hào)10/918,561和60/498,740的優(yōu)先權(quán)，所述美國申請(qǐng)系列號(hào)的整體內(nèi)容引入本文作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明提供了與血小板生成素受體(c-mpl或TPO-R)結(jié)合并激活血小板生成素受體，或以其他方式充當(dāng)TPO激動(dòng)劑的肽化合物。本發(fā)明在生物化學(xué)和醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域中具有應(yīng)用，且具體地提供TPO激動(dòng)劑用于在人疾病治療中使用。
背景技術(shù)：
巨核細(xì)胞是負(fù)責(zé)生產(chǎn)循環(huán)血小板的骨髓衍生細(xì)胞。盡管在大多數(shù)物種中構(gòu)成＜0.25％的骨髓細(xì)胞，但它們具有＞10倍的一般骨髓細(xì)胞體積。參見Kuter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111104-11108(1994)。巨核細(xì)胞經(jīng)歷被稱為核內(nèi)有絲分裂的過程，由此它們復(fù)制它們的細(xì)胞核但不能經(jīng)歷細(xì)胞分裂，且因此產(chǎn)生多倍體細(xì)胞。響應(yīng)減少的血小板計(jì)數(shù)，核內(nèi)有絲分裂率增加，形成較高倍性的巨核細(xì)胞，并且巨核細(xì)胞數(shù)目可以增加最高達(dá)3倍。參見Harker，J.Clin.Invest.，47458-465(1968)。相反，響應(yīng)升高的血小板計(jì)數(shù)，核內(nèi)有絲分裂率減少，形成較低倍性的巨核細(xì)胞，并且巨核細(xì)胞數(shù)目可以減少50％。
循環(huán)血小板團(tuán)(mass)通過其調(diào)節(jié)核內(nèi)有絲分裂率以及骨髓巨核細(xì)胞數(shù)目的確切生理學(xué)反饋機(jī)制未知。涉及介導(dǎo)這種反饋環(huán)的循環(huán)血小板生成因子目前被認(rèn)為是血小板生成素(TPO)。更具體地，在涉及血小板減少癥的情況下，TPO已顯示是主要體液調(diào)節(jié)劑。參見，例如，Metcalf，Nature，369519-520(1994)。在幾項(xiàng)研究中已顯示TPO增加血小板計(jì)數(shù)、增加血小板大小、且增加同位素?fù)饺胧荏w動(dòng)物的血小板內(nèi)。具體地，TPO被認(rèn)為以幾種方式影響巨核細(xì)胞生成(1)它引起巨核細(xì)胞大小和數(shù)目中的增加；(2)它引起DNA含量、多倍性形成、巨核細(xì)胞中的增加；(3)它增加巨核細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂；(4)它引起巨核細(xì)胞的成熟增加；和(5)它引起前體細(xì)胞百分比、小乙酰膽堿酯酶陽性細(xì)胞形成、骨髓中的增加。
血小板(凝血細(xì)胞)是血液凝固所需的。當(dāng)它們的數(shù)目非常低時(shí)，患者處于因?yàn)?zāi)難性出血而死亡的嚴(yán)重危險(xiǎn)中。TPO因此在各種血液學(xué)病癥的診斷和治療中具有潛在有用的應(yīng)用，所述血液學(xué)病癥例如主要由于血小板缺陷的疾病。正在進(jìn)行的使用TPO的臨床試驗(yàn)已指出TPO可以安全地施用于患者。此外，近期研究已提供了關(guān)于TPO療法在血小板減少癥，且特別是起因于化學(xué)療法、放射療法、或作為用于癌癥或淋巴瘤治療的骨髓移植的血小板減少癥治療中的功效預(yù)測基礎(chǔ)。參見，例如McDonald，Am.J.Ped.Hematology/Oncology，148-21(1992)。
編碼TPO的基因已被克隆和表征。參見Kuter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9111104-11108(1994)；Barley等人，Cell 771117-1124(1994)；Kaushansky等人，Nature 369568-571(1994)；Wendling等人，Nature，369571-574(1994)；和Sauvage等人，Nature 369533-538(1994)。血小板生成素是具有至少2種形式的糖蛋白，表觀分子量為25kDa和31kDa，具有共同的N末端氨基酸序列。參見，Bartley等人，Cell，771117-1124(1994)。血小板生成素似乎具有由潛在的Arg-Arg切割位點(diǎn)分開的2個(gè)不同區(qū)域。氨基末端區(qū)域在人和小鼠中是高度保守的，且與促紅細(xì)胞生成素以及干擾素-a和干擾素-b具有一些同源性。羧基末端區(qū)域顯示廣泛的物種趨異。
關(guān)于人TPO(也稱為c-mpl)的DNA序列和編碼的肽序列已得到描述。參見Vigon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895640-5644(1992)。TPO-R是血細(xì)胞生成素生長因子受體家族成員，這是特征為細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的共同結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的家族，包括N末端部分中的4個(gè)保守C殘基和接近于跨膜區(qū)的WSXWS基序(SEQ ID NO1)。參見Bazan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876934-6938(1990)。這種受體在血細(xì)胞生成中起功能作用的證據(jù)包括下述觀察其表達(dá)限制于小鼠中的脾、骨髓、或胎兒肝(參見Souyri等人，Cell 631137-1147(1990))，以及人中的巨核細(xì)胞、血小板和CD34+細(xì)胞(參見Methia等人，Blood 821395-1401(1993))。此外，使CD34+細(xì)胞暴露于對(duì)mpl RNA反義的合成寡核苷酸，顯著抑制巨核細(xì)胞集落的出現(xiàn)，而不影響紅細(xì)胞類或髓樣集落形成。某些工作者假定該受體作為同二聚體發(fā)揮作用，類似于關(guān)于G-CSF和促紅細(xì)胞生成素受體的情況。
關(guān)于TPO-R的克隆的基因的可用性促進(jìn)關(guān)于這種重要受體的激動(dòng)劑的研究。重組受體蛋白的可用性允許在多種隨機(jī)和半隨機(jī)肽多樣性產(chǎn)生系統(tǒng)中研究受體-配體相互作用。這些系統(tǒng)公開于下述參考文獻(xiàn)中美國專利號(hào)6,251,864、6,083,913、6,121,238、5,932,546、5,869,451、5,506,362和6,465,430，以及Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876378-6382(1990)；前述專利申請(qǐng)和出版物各自引入本文作為參考。
在患有血細(xì)胞減少癥的患者中血小板水平緩慢恢復(fù)是嚴(yán)重問題，且已給關(guān)于血液生長因子激動(dòng)劑的研究增加了緊急性，所述激動(dòng)劑能夠加速血小板再生。本發(fā)明提供了此類激動(dòng)劑。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及限定的低分子量肽化合物，所述肽化合物具有針對(duì)TPO-R的強(qiáng)結(jié)合特性、可以激活TPO-R且與已知TPO激動(dòng)劑相比較，可能允許減少副作用。因此，肽化合物可以在由TPO介導(dǎo)的狀況(例如，起因于化學(xué)療法、放射療法、或骨髓輸血的血小板減少癥)治療中用于治療目的，以及在血細(xì)胞生成機(jī)制研究和巨核細(xì)胞(megakaroycytes)和定型祖細(xì)胞的體外擴(kuò)張中用于診斷目的。
如通過例如美國專利號(hào)5,869,451實(shí)施例3中所述的結(jié)合親和力測定所測定的，適合于治療和/或診斷目的肽化合物具有約2mM或更小的IC50，其中較低的IC50與對(duì)于TPO-R較強(qiáng)的結(jié)合親和力相關(guān)。美國專利號(hào)5,869,451中的測定如下肽化合物的結(jié)合親和力在競爭結(jié)合測定中進(jìn)行測量。微量滴定板孔用1mg鏈霉抗生物素蛋白包被，用PBS/1％BSA封閉，隨后為50ng生物素化的(biotnylated)抗受體固定抗體(Ab179)?？纂S后用1∶10稀釋的可溶性TPO-R收獲物進(jìn)行處理。各種濃度的肽化合物與恒定量的與麥芽糖結(jié)合蛋白C末端融合的截短形式的TPO混合，所述截短形式的TPO由殘基1-156組成(MBP-TPO156)。將肽MBP-TPO156混合物加入TPO-R包被的孔中，于4℃溫育2小時(shí)，且隨后用PBS進(jìn)行洗滌。平衡時(shí)結(jié)合的MBP-TPO量通過添加針對(duì)MBP的兔抗血清，隨后為堿性磷酸酶綴合的山羊抗兔IgG來測量。每個(gè)孔中的堿性磷酸酶量隨后使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定。測定在一系列肽化合物濃度上進(jìn)行，且這樣對(duì)結(jié)果作圖，從而使得y軸表示結(jié)合的MBP-TPO量，且x軸表示肽化合物濃度。隨后可以測定肽化合物將使與固定化的TPO-R結(jié)合的MBP-TPO量減少50％的濃度(IC50)。關(guān)于肽的解離常數(shù)(Kd)應(yīng)當(dāng)類似于使用這些測定條件測量的IC50。為了藥學(xué)目的，肽化合物優(yōu)選具有僅僅約100μM的IC50，更優(yōu)選地，僅僅500nM。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，肽化合物的分子量為約250-約8,000道爾頓。如果本發(fā)明的肽化合物是寡聚的、二聚的和/或與如本文所述的用親水聚合物衍生的，那么此類肽化合物的分子量將基本上更大，且可以為約500-約120,000道爾頓，更優(yōu)選約8,000-約80,000道爾頓。
當(dāng)用于診斷目的時(shí)，本發(fā)明的肽化合物優(yōu)選用可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，且因此不含此類標(biāo)記的肽化合物在標(biāo)記的肽化合物的制備中充當(dāng)中間物。
符合關(guān)于分子量和對(duì)于TPO-R結(jié)合親和力的限定標(biāo)準(zhǔn)的肽化合物包含9個(gè)或更多氨基酸，其中所述氨基酸是天然存在的或合成(非天然存在的)氨基酸。
因此，優(yōu)選的肽化合物包含具有下述的化合物 (1)小于約5000道爾頓的分子量，和 (2)如由僅僅約100μM的IC50表示的，對(duì)于TPO-R的結(jié)合親和力， 其中肽化合物的0至所有--C(O)NH--鍵已用選自下述的鍵替換--CH2OC(O)NR--鍵；膦酸酯鍵；--CH2S(O)2NR--鍵；--CH2NR--鍵；和--C(O)NR6--鍵；以及--NHC(O)NH--鍵，其中R是氫或低級(jí)烷基且R6是低級(jí)烷基， 進(jìn)一步地其中所述肽化合物的N末端選自-NRR1基團(tuán)；--NRC(O)R基團(tuán)；--NRC(O)OR基團(tuán)；--NRS(O)2R基團(tuán)；--NHC(O)NHR基團(tuán)；琥珀酰亞胺基團(tuán)；芐氧羰基-NH--基團(tuán)；和在苯基環(huán)上具有1-3個(gè)取代基的芐氧羰基-NH--基團(tuán)，所述取代基選自低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、氯、和溴，其中R和R1獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基， 且再進(jìn)一步地其中所述肽化合物的C末端具有式--C(O)R2，其中R2選自羥基、低級(jí)烷氧基和-NR3R4，其中R3和R4獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基，且其中-NR3R4基團(tuán)的氮原子可以任選是肽N末端的胺基，以便形成環(huán)肽， 及其生理學(xué)可接受的鹽。
在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含如上所述的肽化合物的標(biāo)記的肽化合物，所述肽化合物具有與其共價(jià)附著的能檢測的標(biāo)記。
在一個(gè)實(shí)施方案中，核心肽化合物包含氨基酸序列(SEQ ID NO2) X9 X8 G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 其中X9是A、C、E、G、I、L、M、P、R、Q、S、T、或V；且X8是A、C、D、E、K、L、Q、R、S、T、或V；且X6是β-(2-萘基)丙氨酸(在本文中稱為“2-Nal”)殘基。更優(yōu)選地，X9是A或I；且X8是D、E、或K。進(jìn)一步地X1是C、L、M、P、Q、V；X2是F、K、L、N、Q、R、S、T或V；X3是C、F、I、L、M、R、S、V或W；X4是20種遺傳編碼的L-氨基酸中的任何一種；X5是A、D、E、G、K、M、Q、R、S、T、V或Y；且X7是C、G、I、K、L、M、N、R或V。
特別優(yōu)選的肽化合物包括氨基酸序列I E G P T L R Q(2-Nal)L A AR(Sar)(SEQ ID NO7)，其中(2-Nal)是β-(2-萘基)丙氨酸且(Sar)是肌氨酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽化合物優(yōu)選是二聚或寡聚的，以增加化合物的親和力和/或活性。優(yōu)選二聚的肽化合物的例子包括但不限于，下述；
其中X10是肌氨酸或β-丙氨酸殘基(SEQ ID NO7)。上文結(jié)構(gòu)也可以由下述結(jié)構(gòu)表示(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2。
當(dāng)X10是肌氨酸時(shí)，化合物具有下述結(jié)構(gòu)；
其中(2-Nal)是β-(2-萘基)丙氨酸且(Sar)是肌氨酸(SEQ ID NO7)。這種肽化合物也可以由下述結(jié)構(gòu)(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR(Sar))2K-NH2表示，在本文中稱為“第1號(hào)TPO化合物”。
在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，用于在本發(fā)明中使用的優(yōu)選肽化合物包括與多種親水聚合物中的一種或多種共價(jià)附著的肽化合物。合適的親水聚合物包括但不限于，如美國專利號(hào)5,869,451中所述的，如由聚乙二醇和聚丙二醇例示的聚烷基醚、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧烯(polyoxyalkenes)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素和纖維素衍生物、葡聚糖和葡聚糖衍生物等，所述專利的整體內(nèi)容在此引入作為參考。
本文描述的肽化合物可用于預(yù)防和治療由TPO介導(dǎo)的疾病，且特別是用于治療血液學(xué)病癥，包括但不限于，起因于化學(xué)療法、放射療法、或骨髓輸血的血小板減少癥。因此，本發(fā)明還提供了用于治療的方法，其中患有對(duì)TPO激動(dòng)劑治療易感病癥的患者接受，或被施用治療有效劑量或量的本發(fā)明的肽化合物。
本發(fā)明還提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含本文描述的一種或多種肽化合物和生理學(xué)可接受的載體。這些藥物組合物可以為多種形式，包括經(jīng)口劑型、以及可吸入粉末和溶液以及可注射和可輸注溶液。
附圖簡述
圖1顯示且比較了第1號(hào)TPO化合物與現(xiàn)有技術(shù)肽化合物(本文自始至終稱為“現(xiàn)有技術(shù)肽化合物”)的活性。第1號(hào)TPO化合物與現(xiàn)有技術(shù)肽化合物之間的差異在于現(xiàn)有技術(shù)肽化合物具有β-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)，其中(2-Nal)在第1號(hào)TPO化合物上。
圖2顯示且比較了聚乙二醇化的(PEGylated)第1號(hào)TPO化合物與聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物的活性。
圖3顯示且比較了在大鼠血小板計(jì)數(shù)中的體內(nèi)變化，顯示了聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物與聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物的相對(duì)效力。
圖4和5顯示且比較了分別使用聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物和使用聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物后，以劑量依賴性方式的循環(huán)血小板數(shù)目和體積。
圖6顯示單次靜脈內(nèi)劑量的聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物(30、100或300μg/kg)，導(dǎo)致正常雄性Wistar大鼠的外周血小板計(jì)數(shù)增加。
圖7顯示在健康男性志愿者中聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的PK，濃度-時(shí)間曲線圖實(shí)心正方形-聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物，0.75μg/kg靜脈內(nèi)(i.v.)；空心菱形-聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物，1.5μg/kg靜脈內(nèi)；實(shí)心正三角形-聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物，2.25μg/kg靜脈內(nèi)；空心倒三角形-聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物，3μg/kg靜脈內(nèi)。
圖8顯示在聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物施用后，在健康男性志愿者中血小板計(jì)數(shù)劑量依賴性地增加。
圖9顯示在聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物施用后，在健康男性志愿者中內(nèi)源TPO水平劑量依賴性地增加。
具體實(shí)施方案描述 I.定義和一般參數(shù) 提出下列定義以舉例說明和限定本文用于描述本發(fā)明的各種術(shù)語的含義和范圍。
“激動(dòng)劑”指生物學(xué)活性配體，所述配體與其互補(bǔ)生物學(xué)活性受體結(jié)合且激活后者，以引起受體中的生物學(xué)應(yīng)答或增強(qiáng)受體預(yù)先存在的生物活性。
“肽化合物”指水解成氨基酸和/或氨基酸衍生物和/或氨基酸取代物的分子。
“藥學(xué)可接受的鹽”指藥物工業(yè)中常用的無毒堿金屬、堿土金屬、和銨鹽，包括通過本領(lǐng)域眾所周知的方法制備的鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋇、銨、和魚精蛋白鋅鹽。該術(shù)語還包括無毒酸加成鹽，這一般通過使本發(fā)明的化合物與合適的有機(jī)或無機(jī)酸反應(yīng)來制備。代表性鹽包括氫氯化物、氫溴化物、硫酸鹽、硫酸氫鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、月硅酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘磺酸鹽等。
“藥學(xué)可接受的酸加成鹽”指保留游離堿的生物學(xué)有效性和特性，并且非生物學(xué)或其他方面不希望的那些鹽，由無機(jī)酸和有機(jī)酸形成，所述無機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有機(jī)酸例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、薄荷烷磺酸(menthanesulfonic acid)、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、水楊酸等。關(guān)于作為前體藥物的藥學(xué)可接受的酸加成鹽的描述，參見，Bundgaard，H.，同上。
“藥學(xué)可接受的酯”指在酯鍵水解后，保留羧酸或醇的生物學(xué)有效性和特性，且并非生物學(xué)或其他方面不希望的那些酯。關(guān)于作為前體藥物的藥學(xué)可接受的酯的描述，參見Bundgaard，H.，編輯，Design of Prodrugs，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)。這些酯一般由相應(yīng)的羧酸和醇形成。一般地，酯形成可以經(jīng)由常規(guī)合成技術(shù)來完成。(參見，例如，March，Advanced Organic Chemistry，第4版，John Wiley & Sons，New York(1992)，393-396和其中引用的參考文獻(xiàn)，以及Mark等人，Encyclopedia of Chemical Technology，John Wiley & Sons，New York(1980)。)酯的醇組分一般將包含(i)可以包含或不含一個(gè)或多個(gè)雙鍵且可以包含或不含分支碳的C2-C12脂族醇，或(ii)C7-C12芳族或雜芳族醇。本發(fā)明還預(yù)期了既是本文描述的酯同時(shí)也是其藥學(xué)可接受的酸加成鹽的那些組合物的用途。
“藥學(xué)可接受的酰胺”指在酰胺鍵水解后，保留羧酸或胺的生物學(xué)有效性和特性，且并非生物學(xué)或其他方面不希望的那些酰胺。關(guān)于作為前體藥物的藥學(xué)可接受的酰胺的描述，參見Bundgaard，H.，編輯，Designof Prodrugs，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)。這些酰胺一般由相應(yīng)的羧酸和胺形成。一般地，酰胺形成可以經(jīng)由常規(guī)合成技術(shù)來完成。(參見，例如，March，Advanced Organic Chemistry，第4版，John Wiley & Sons，New York(1992)，第393頁和Mark等人，Encyclopedia of Chemical Technology，John Wiley & Sons，New York(1980)。)本發(fā)明還預(yù)期了既是本文描述的酰胺同時(shí)也是其藥學(xué)可接受的酸加成鹽的那些組合物的用途。
“藥學(xué)或治療可接受的載體”指不干擾活性成分的生物活性效力并且對(duì)宿主或患者無毒的載體介質(zhì)。
“立體異構(gòu)體”指具有與另一種相同的分子量、化學(xué)組成和構(gòu)造，但原子不同地聚合的化合物。即，某些相同化學(xué)部分在空間上處于不同方向，且因此當(dāng)為純的時(shí)，具有使偏振光平面旋轉(zhuǎn)的能力。然而，一些純立體異構(gòu)體可能具有如此輕微的旋光性，以致于使得用目前的儀器操作不可檢測。本發(fā)明的化合物可能具有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱碳原子，且因此包括各種立體異構(gòu)體。所有立體異構(gòu)體都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
“治療或藥學(xué)有效量”當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明的組合物時(shí)，指足以誘導(dǎo)所需生物學(xué)結(jié)果的組合物量。那種結(jié)果可以是疾病病征、癥狀、或原因緩和，或生物學(xué)系統(tǒng)的任何其他所需的改變。在本發(fā)明中，該結(jié)果一般將涉及針對(duì)感染或組織損害的免疫和/或炎癥應(yīng)答減少。
肽中的氨基酸殘基縮寫如下苯丙氨酸是Phe或F；亮氨酸是Leu或L；異亮氨酸是Ile或I；甲硫氨酸是Met或M；纈氨酸是Val或V；絲氨酸是Ser或S；脯氨酸是Pro或P；蘇氨酸是Thr或T；丙氨酸是Ala或A；酪氨酸是Tyr或Y；組氨酸是His或H；谷氨酰胺是Gln或Q；天冬酰胺是Asn或N；賴氨酸是Lys或K；天冬氨酸是Asp或D；谷氨酸是Glu或E；半胱氨酸是Cys或C；色氨酸是Trp或W；精氨酸是Arg或R；且甘氨酸是Gly或G。此外，t-Buo是叔丁氧基(bulyloxy)，Bzl是苯甲基，CHA是環(huán)己胺，Ac是乙?；?，Me是甲基，Pen是青霉胺，Aib是氨基異丁酸，Nva是正纈氨酸，Abu是氨基丁酸，Thi是噻吩丙氨酸，OBn是O-苯甲基，且hyp是羥脯氨酸。
肽類似物在藥物工業(yè)中常用作為非肽藥物，具有類似于模板肽那些的性質(zhì)。這些類型的非肽化合物被稱為“擬肽(peptidemimetics)”或“肽模擬物”或“模擬肽(peptidomimetics)”(Luthman等人，A Textbook ofDrug Design and Development，14386-406，第2版，Harwood AcademicPublishers(1996)；Joachim Grante，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，331699-1720(1994)；Fauchere，J.，Adv.Drug Res.，1529(1986)；Veber和Freidinger TINS，第392頁(1985)；和Evans等人，J.Med.Chem.301229(1987)，所述參考文獻(xiàn)引入本文作為參考)。在結(jié)構(gòu)上類似于治療有用肽的肽模擬物可以用于產(chǎn)生等價(jià)或增強(qiáng)的治療或預(yù)防作用。一般地，模擬肽在結(jié)構(gòu)上類似于范例多肽(即，具有生物學(xué)或藥理學(xué)活性的多肽)，例如非天然存在的受體結(jié)合多肽，但具有通過本領(lǐng)域已知且在下述參考文獻(xiàn)中進(jìn)一步描述的方法任選用可替代的鍵替換的一個(gè)或多個(gè)肽鍵，所述可替代的鍵例如--CH2NH--、--CH2S --等，所述文獻(xiàn)為Spatola，A.F.in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，B.Weinstein，編輯，Marcel Dekker，New York，第267頁(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(March 1983)，第1卷，Issue 3，Peptide Backbone Modifications(一般綜述)；Morley，TrendsPharm.Sci.第463-468頁(1980)，(一般綜述)；Hudson等人，Int.J.Pept.Prot.Res.，14177-185(1979)；Spatola等人，Life Sci.，381243-1249(1986)；Hann，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，307-314(1982)；Almquist等人，J.Med.Chem.，231392-1398，(1980)；Jennings-White等人，Tetrahedron Lett.232533(1982)；Szelke等人，European Appln.EP 45665(1982)；Holladay等人，Tetrahedron Lett.，244401-4404(1983)；和Hruby，Life Sci.，31189-199(1982)；所述參考文獻(xiàn)各自引入本文作為參考。特別優(yōu)選的非肽鍵是-CH2NH--。此類肽模擬物可能具有超過多肽實(shí)施方案的顯著優(yōu)點(diǎn)，包括例如更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)、更大的化學(xué)穩(wěn)定性、增強(qiáng)的藥理學(xué)性質(zhì)(半衰期、吸收、效力、功效等)，改變的特異性(例如，廣譜生物學(xué)活性)，減少的抗原性等。模擬肽的標(biāo)記通常涉及一種或多種標(biāo)記直接或通過間隔基(例如，酰胺基)，與模擬肽上的一個(gè)或多個(gè)非干擾位置共價(jià)附著，所述非干擾位置通過定量結(jié)構(gòu)活性數(shù)據(jù)和/或分子建模來預(yù)測。此類非干擾位置一般是不與一種或多種大分子(例如免疫球蛋白超家族分子)形成直接接觸的位置，模擬肽與所述大分子結(jié)合以產(chǎn)生療效。模擬肽衍生化(例如，標(biāo)記)應(yīng)基本上不干擾模擬肽的所需生物學(xué)或藥理學(xué)活性。一般地，受體結(jié)合肽的模擬肽以高親和力與受體結(jié)合，且具有可檢測的生物學(xué)活性(即，對(duì)一種或多種受體介導(dǎo)的表型變化激動(dòng)或拮抗)。
用相同類型的D-氨基酸系統(tǒng)置換共有序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，D-賴氨酸代替L-賴氨酸)可以用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列變異的約束肽(constrained peptide)可以通過本領(lǐng)域已知的方法來產(chǎn)生(Rizo等人，Ann.Rev.Biochem.，61387(1992)，引入本文作為參考)；例如，通過添加能夠形成分子內(nèi)二硫鍵的內(nèi)部半胱氨酸殘基，所述分子內(nèi)二硫鍵使肽環(huán)化。
“可檢測的標(biāo)記”指當(dāng)與本發(fā)明的肽化合物共價(jià)附著時(shí)，允許在肽化合物已對(duì)其施用的患者體內(nèi)檢測肽化合物的材料。合適的可檢測的標(biāo)記是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括例如放射性同位素、熒光標(biāo)記(例如，熒光素)等。使用的具體可檢測的標(biāo)記不是關(guān)鍵的，且相對(duì)于使用的標(biāo)記量以及在使用的標(biāo)記量時(shí)標(biāo)記的毒性進(jìn)行選擇。相對(duì)于此類因素的標(biāo)記選擇完全在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)。
可檢測的標(biāo)記與肽化合物的共價(jià)附著通過本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法來完成。例如，當(dāng)125I放射性同位素用作可檢測的標(biāo)記時(shí)，125I與肽化合物的共價(jià)附著可以通過下述方法來完成將氨基酸酪氨酸摻入肽化合物內(nèi)，且隨后使肽化合物碘化(參見，例如，Weaner等人，Synthesisand Applications of Isotopically Labelled Compounds，第137-140頁(1994))。酪氨酸摻入肽化合物的N或C末端可以通過眾所周知的化學(xué)作用來完成。同樣地，32P可以使用常規(guī)化學(xué)作用通過例如肽化合物上的羥基，作為磷酸鹽部分摻入肽化合物上。
II.概述 本發(fā)明提供了與TPO-R結(jié)合并激活TPO-R，或以其他方式起TPO激動(dòng)劑作用的肽化合物。這些肽化合物包括“引導(dǎo)(lead)”肽化合物和“衍生”肽化合物，所述衍生肽化合物如此構(gòu)建，以便具有與引導(dǎo)肽化合物相同或相似的分子結(jié)構(gòu)或形狀，但就對(duì)水解或蛋白酶解易感性而言，和/或就其他生物學(xué)性質(zhì)例如對(duì)受體的親和力增加而言，不同于引導(dǎo)肽化合物。本發(fā)明還提供了組合物，所述組合物包含有效量的肽化合物，且更具體而言用于治療血液學(xué)病癥且特別是與化學(xué)療法、放射療法、或骨髓輸血相關(guān)的血小板減少癥的肽化合物。
發(fā)現(xiàn)核心肽化合物可以包含氨基酸序列(SEQ ID NO2)X9 X8G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7，其中X6可以是β-(2-萘基)丙氨酸，且其中X9是A、C、E、G、I、L、M、P、R、Q、S、T、或V；且X8是A、C、D、E、K、L、Q、R、S、T、或V。更優(yōu)選地，X9是A或I；且X8是D、E、或K。進(jìn)一步地X1是C、L、M、P、Q、V；X2是F、K、L、N、Q、R、S、T或V；X3是C、F、I、L、M、R、S、V或W；X4是20種遺傳編碼的L-氨基酸中的任何一種；X5是A、D、E、G、K、M、Q、R、S、T、V或Y；且X7是C、G、I、K、L、M、N、R或V。
然而，如本文進(jìn)一步描述的，已發(fā)現(xiàn)通過用β-(2-萘基)丙氨酸替換X6，該化合物提供了超過包含β-(1-萘基)丙氨酸的化合物的不同性質(zhì)。因此，特別優(yōu)選的肽化合物包括氨基酸序列(SEQ ID NO7)I EG P T L R Q(2-Nal)L A A R(Sar)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽化合物優(yōu)選是二聚或寡聚的，以增加化合物的親和力和/或活性。優(yōu)選二聚的肽化合物的例子包括但不限于，下述；
其中X10是肌氨酸或β-丙氨酸殘基(SEQ ID NO7)。應(yīng)當(dāng)指出一個(gè)X10殘基可以是肌氨酸，且另一個(gè)殘基可以是β-丙氨酸。上文結(jié)構(gòu)也可以由下述表示(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)2K-NH2。
優(yōu)選的肽化合物如下
其中(2-Nal)是β-(2-萘基)丙氨酸且(Sar)是肌氨酸(SEQ ID NO7)。這種肽化合物在本文中稱為“第1號(hào)TPO化合物”。
具有超過約100mM的IC50的肽化合物缺乏足夠的結(jié)合，以允許在本發(fā)明的診斷或治療方面使用。優(yōu)選地，對(duì)于診斷目的，肽化合物具有約2mM或更小的IC50，且對(duì)于藥學(xué)目的，肽化合物具有約100μM或更小的IC50。
圖1使用標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)發(fā)光單位測定技術(shù)，比較了3個(gè)不同批次的第1號(hào)TPO化合物與1批現(xiàn)有技術(shù)肽化合物的活性。該測定使用被工程改造以穩(wěn)定表達(dá)由fos啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人TPO受體和螢光素酶報(bào)道分子構(gòu)建體的鼠細(xì)胞。第1號(hào)TPO化合物與現(xiàn)有技術(shù)肽化合物之間的差異在于現(xiàn)有技術(shù)肽化合物具有β-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)，其中(2-Nal)在第1號(hào)TPO化合物上。在圖1中第1號(hào)TPO化合物被稱為2-Nal，且現(xiàn)有技術(shù)肽化合物被稱為1-Nal(現(xiàn)有技術(shù))。如由圖1中所示，活性對(duì)于每種化合物是類似的。
圖2比較了幾個(gè)不同批次的聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物(本發(fā)明的化合物的聚乙二醇化在下文更詳細(xì)地描述)的活性。2批聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物都顯示了與未聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物的活性水平基本上相同的高活性。剩余的線舉例說明了不同批聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的活性。如由圖2所示，在這個(gè)模型中，相對(duì)于聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物，后者具有較少的活性，在圖2中聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物被稱為PEG-2-Nal，且聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物被稱為PEG-1-Nal(現(xiàn)有技術(shù))。
圖3顯示了聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物與聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的相對(duì)效力。通過大鼠模型，圖3顯示在聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物和聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物施用后，血小板計(jì)數(shù)中的體內(nèi)變化。如圖3所示，最高劑量的聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物具有與最低劑量的聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物相同的活性。較不有效的化合物可以提供對(duì)靶細(xì)胞較不激烈的刺激，這可以減少由靶細(xì)胞過度刺激(overstimulation)引起的副作用危險(xiǎn)，例如在后續(xù)化學(xué)療法循環(huán)后加劇的血小板減少癥。在圖3中聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物被稱為PEG-2-Nal，且聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物被稱為PEG-1-Nal(現(xiàn)有技術(shù))。
圖4和5顯示了在正常小鼠中，聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物和聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物不相上下的劑量應(yīng)答研究。在圖4和5中聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物被稱為PEG-2-Nal，且聚乙二醇化的現(xiàn)有技術(shù)肽化合物被稱為PEG-1-Nal(現(xiàn)有技術(shù))。圖4顯示了血小板水平中的增加，且圖5顯示了治療后六(6)天的平均血小板體積。劑量范圍為10-3000ug/kg。2種肽化合物以劑量依賴性方式增加循環(huán)血小板的數(shù)目，其中對(duì)于2種化合物在低至30ug/kg的劑量時(shí)，觀察到相對(duì)于對(duì)照組的增加。在最大應(yīng)答時(shí)，這些肽化合物使血小板計(jì)數(shù)升高至為對(duì)照值的最高4倍的水平。關(guān)于這些肽化合物的劑量應(yīng)答曲線是非常相似的，從而指出在這種模型中基于這些終點(diǎn)在2種測試物品之間基本上不存在差異。
IV.肽化合物的制備 A.固相合成 本發(fā)明的肽化合物可以通過本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法進(jìn)行制備，例如通過使用標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)方法包括全部固相合成、部分固相合成法、片段縮合、傳統(tǒng)溶液合成、和甚至通過重組DNA技術(shù)。參見，例如，引入本文作為參考的Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149(1963)。在固相上，合成一般使用α-氨基保護(hù)的樹脂從肽的C末端開始。合適的原材料可以例如，通過使所需α-氨基酸與氯甲基化樹脂、羥甲基樹脂、或二苯甲基胺樹脂附著來制備。一種此類氯甲基化樹脂在商品名BIO-BEADS SX-1下由Bio Rad Laboratories，Richmond，CA銷售，并且羥甲基樹脂的制備由Bodonszky等人，Chem.Ind.(London)，381597(1966)描述。二苯甲基胺(BHA)樹脂已由Pietta和Marshall，Chem.Commn.，650(1970)描述，且從Beckman Instruments，Inc.，Palo Alto，Calif.以氫氯化物形式商購可得。
因此，本發(fā)明的肽化合物可以根據(jù)由Gisin，Helv.Chim.Acta.，561467(1973)描述的方法，借助于例如碳酸氫銫催化劑，通過使α-氨基保護(hù)的氨基酸與氯甲基化樹脂偶聯(lián)來制備。最初偶聯(lián)后，α-氨基保護(hù)基團(tuán)通過在室溫下選擇試劑去除，所述試劑包括溶于有機(jī)溶劑的三氟乙酸(TFA)或鹽酸(HCl)溶液。
α-氨基保護(hù)基團(tuán)是肽分步合成領(lǐng)域中已知有用的那些。包括的是?；愋偷谋Ｗo(hù)基團(tuán)(例如，甲?；⑷阴；?、乙?；?，芳族氨基甲酸乙酯類型保護(hù)基團(tuán)(例如，芐氧羰基(benzyloxycarboyl)(Cbz)和取代的Cbz)，脂族氨基甲酸乙酯保護(hù)基團(tuán)(例如，叔丁氧羰基(Boc)、異丙氧羰基(isopropyloxycarbonyl)、環(huán)己氧羰基(cyclohexyloxycarbonyl))和烷基類型保護(hù)基團(tuán)(例如，苯甲基、三苯甲基)。Boc和Fmoc是優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在偶聯(lián)期間保持完整，且在氨基末端保護(hù)基團(tuán)脫保護(hù)期間或偶聯(lián)期間不分裂。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)必須是在最終肽合成完成后且在將不改變靶肽的反應(yīng)條件下可去除的。
用于Tyr的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括四氫吡喃基、叔丁基、三苯甲基、苯甲基、Cbz、Z--Br--Cbz、和2，5-二氯苯甲基。用于Asp的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括苯甲基、2，6-二氯苯甲基、甲基、乙基、和環(huán)己基。用于Thr和Ser的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括乙?；?、苯甲?；?、三苯甲基、四氫吡喃基、苯甲基、2，6-二氯苯甲基、和Cbz。用于Thr和Ser的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是苯甲基。用于Arg的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括硝基、甲苯磺?；?Tos)、Cbz、金剛烷氧羰基
?；酋；?adamantyloxycarbonyl mesitoylsulfonyl)(Mts)、或Boc。用于Lys的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括Cbz、2-氯芐氧羰基(2-Cl--Cbz)、2-溴芐氧羰基(2-BrCbz)、Tos、或Boc。
去除α-氨基保護(hù)基團(tuán)后，剩余保護(hù)的氨基酸以所需順序逐步偶聯(lián)。過量的每種保護(hù)的氨基酸一般與合適的羰基活化劑例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)一起在溶液中使用，例如在二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基甲酰胺(DMF)混合物中。
所需氨基酸序列已完成后，所需肽通過用試劑例如三氟乙酸或氟化氫(HF)處理與樹脂支持體去偶聯(lián)，所述試劑不僅切開肽與樹脂，還切割所有剩余側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。當(dāng)使用氯甲基化樹脂時(shí)，氟化氫處理導(dǎo)致形成游離肽酸。當(dāng)使用二苯甲基胺樹脂時(shí)，氟化氫處理直接導(dǎo)致游離肽酰胺?？商娲?，當(dāng)使用氯甲基化樹脂時(shí)，側(cè)鏈保護(hù)的肽可以通過用氨處理肽樹脂去偶聯(lián)以產(chǎn)生所需側(cè)鏈保護(hù)的酰胺，或用烷基胺處理以產(chǎn)生側(cè)鏈保護(hù)的烷基酰胺或二烷基酰胺。側(cè)鏈保護(hù)隨后以通常方式通過用氟化氫處理來去除，以產(chǎn)生游離酰胺、烷基酰胺、或二烷基酰胺。
這些固相肽合成程序是本領(lǐng)域眾所周知的，且由John MorrowStewart和Janis Dillaha Young，Solid Phase Peptide Syntheses(第2版，Pierce Chemical Company，1984)進(jìn)一步描述。
B.合成氨基酸 這些程序也可以用于合成其中除20種天然存在的、遺傳編碼的氨基酸外的氨基酸在任何本發(fā)明的化合物的1、2或更多位置上被取代的肽。
人們可將20種遺傳編碼的氨基酸(或D氨基酸)的天然存在的側(cè)鏈替換為其他側(cè)鏈，例如基團(tuán)，例如烷基，低級(jí)烷基，環(huán)4-、5-、6-至7-員烷基，酰胺，酰胺低級(jí)烷基，酰胺二(低級(jí)烷基)，低級(jí)烷氧基，羥基，羧基及其低級(jí)酯衍生物，以及4-、5-、6-至7-員雜環(huán)。具體地，可以使用其中脯氨酸殘基的環(huán)大小從5員變成4、6、或7員的脯氨酸類似物。環(huán)狀基團(tuán)可以是飽和或不飽和的，并且如果是不飽和的，則可以是芳族或非芳族的。雜環(huán)基團(tuán)優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)氮、氧、和/或硫雜原子。此類基團(tuán)的例子包括呋吖基(furazanyl)、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、異噻唑基、異噁唑基、嗎啉基(例如嗎啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如1-哌嗪基)、哌啶基(例如1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代嗎啉基(例如硫代嗎啉代)、和三唑基。這些雜環(huán)基團(tuán)可以是取代或未取代的。當(dāng)基團(tuán)是取代的時(shí)，取代基可以是烷基、烷氧基、鹵素、氧、或取代或未取代的苯基。
通過磷酸化(參見，例如，W.Bannwarth等人，Biorganic andMedicinal Chemistry Letters，6(17)2141-2146(1996))可以容易地修飾本發(fā)明的肽，并且用于制備本發(fā)明化合物的肽衍生物的其他方法在Hruby等人，Biochem.J.，268(2)249-262(1990)中描述。因此，本發(fā)明的肽化合物也可用作基礎(chǔ)以制備具有類似生物學(xué)活性的肽模擬物。
C.末端修飾 本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到多種技術(shù)可用于構(gòu)建具有與相應(yīng)的肽化合物相同或相似所需生物學(xué)活性，但就溶解性、穩(wěn)定性、以及對(duì)水解和蛋白酶解的易感性而言，具有比肽化合物更有利的活性的肽化合物。參見，例如，Morgan等人，Ann.Rep.Med.Chem.，24243-252(1989)。下文描述了用于制備在N末端氨基、C末端羧基上修飾的肽化合物，和/或使肽中的一個(gè)或多個(gè)酰氨鍵變成非酰氨鍵的方法。應(yīng)當(dāng)理解2個(gè)或更多此類修飾可以在1種肽化合物結(jié)構(gòu)中偶聯(lián)(例如，在C末端羧基上的修飾以及包括在肽化合物中的2個(gè)氨基酸之間的-CH2-氨基甲酸酯鍵)。
1.N末端修飾 肽化合物一般合成為游離酸，但如上所述，可以容易地制備為酰胺或酯。還可以修飾本發(fā)明的肽化合物的氨基和/或羧基末端，以產(chǎn)生本發(fā)明的其他化合物。氨基末端修飾包括甲基化、乙?；?、添加芐氧羰基、或用包含由RCOO--限定的羧化物功能性的任何封閉基團(tuán)來封閉氨基末端，其中R選自萘基、吖啶基、類固醇基(steroidyl)和類似基團(tuán)。羧基末端修飾包括用氨甲酰基團(tuán)替換游離酸，或在羧基末端上形成環(huán)狀內(nèi)酰胺以引入結(jié)構(gòu)約束。
氨基末端修飾如上所述，且包括烷基化、乙?；?、添加羧苯甲酰(carbobenzoyl)、形成琥珀酰亞胺基等。(參見，例如，Murray等人，Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery，第5版，第1卷，Manfred E.Wolf，編輯，John Wiley and Sons，Inc.(1995)。)具體而言，N末端氨基隨后可以如下反應(yīng) (a)通過與酸性鹵化物或?qū)ΨQ酐反應(yīng)以形成式RC(O)NH--的酰胺基，其中R如上定義。一般地，該反應(yīng)可以通過使約等摩爾或過量(例如，約5當(dāng)量)酸性鹵化物與肽在惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中接觸來進(jìn)行，所述惰性稀釋劑優(yōu)選包含過量(例如，約10當(dāng)量)叔胺，例如二異丙基乙胺，以清除反應(yīng)期間產(chǎn)生的酸。反應(yīng)條件在其他方面是常規(guī)的(例如，室溫30分鐘)。使末端氨基烷基化以提供低級(jí)烷基N-取代隨后如上所述與酸性鹵化物反應(yīng)，將提供式RC(O)NR--的N-烷基酰胺基； (b)通過與琥珀酐反應(yīng)以形成琥珀酰亞胺基。如先前一樣，可以使用約等摩爾量或過量琥珀酐(例如，約5當(dāng)量)，且通過本領(lǐng)域眾所周知的方法使氨基轉(zhuǎn)變成琥珀酰亞胺，所述方法包括使用在合適的惰性溶劑(例如，二氯甲烷)中的過量(例如，10當(dāng)量)叔胺，例如二異丙基乙胺。參見，例如，整體引入本文作為參考的Wollenberg等人，美國專利號(hào)4,612,132。應(yīng)當(dāng)理解琥珀酸基團(tuán)可以用例如烷基或--SR取代基來取代，所述--SR取代基以常規(guī)方式進(jìn)行制備，以提供在肽的N末端上的取代的琥珀酰亞胺。此類烷基取代基通過使低級(jí)烯烴與馬來酐以Wollenberg等人同上描述的方式反應(yīng)來制備，且--SR取代基通過使RSH與馬來酐反應(yīng)來制備，其中R如上定義； (c)通過與約等量或過量CBZ--Cl(即，芐氧羰基氯)或取代的CBZ--Cl在合適的惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中反應(yīng)，以形成芐氧羰基-NH--或取代的芐氧羰基-NH--基團(tuán)，所述惰性稀釋劑優(yōu)選包含叔胺，以清除反應(yīng)期間產(chǎn)生的酸； (d)通過與等量或過量(例如，5當(dāng)量)R--S(O)2 Cl在合適的惰性稀釋劑(二氯甲烷)中反應(yīng)，使末端胺轉(zhuǎn)變成氨磺酰，以形成氨磺?；鶊F(tuán)，其中R如上定義。優(yōu)選地，惰性稀釋劑包含過量叔胺(例如，10當(dāng)量)，例如二異丙基乙胺，以清除反應(yīng)期間產(chǎn)生的酸。反應(yīng)條件在其他方面是常規(guī)的(例如，室溫30分鐘)； (e)通過與等量或過量(例如，5當(dāng)量)R--OC(O)Cl或R--OC(O)OC6H4-p-NO2在合適的惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中反應(yīng)，使末端胺轉(zhuǎn)變成氨基甲酸酯，以形成氨基甲酸酯基團(tuán)，其中R如上定義。優(yōu)選地，惰性稀釋劑包含過量(例如，約10當(dāng)量)叔胺，例如二異丙基乙胺，以清除反應(yīng)期間產(chǎn)生的任何酸。反應(yīng)條件在其他方面是常規(guī)的(例如，室溫30分鐘)；和 (f)通過與等量或過量(例如，5當(dāng)量)R-N＝C＝O在合適的惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中反應(yīng)，使末端胺轉(zhuǎn)變成尿素(即，RNHC(O)NH--)基團(tuán)，以形成尿素基團(tuán)，其中R如上定義。優(yōu)選地，惰性稀釋劑包含過量(例如，約10當(dāng)量)叔胺，例如二異丙基乙胺。反應(yīng)條件在其他方面是常規(guī)的(例如，室溫約30分鐘)。
2.C末端修飾 在其中C末端羧基替換為酯(即--C(O)OR，其中R如上定義)的肽化合物制備中，使用用于制備肽酸的樹脂，且側(cè)鏈保護(hù)的肽用堿和合適的醇例如甲醇進(jìn)行切割。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)隨后以通常方式通過用氟化氫處理來去除，以獲得所需酯。
在其中C末端羧基替換為酰胺--C(O)NR3 R4的肽化合物制備中，使用二苯甲基胺樹脂作為用于肽合成的固體支持體。合成完成后，氟化氫處理從支持體釋放肽直接導(dǎo)致游離肽酰胺(即，C末端是--C(O)NH2)?？商娲?，使用在肽合成期間偶聯(lián)有與氨的反應(yīng)的氯甲基化樹脂以從支持體切割側(cè)鏈保護(hù)的肽產(chǎn)生游離肽酰胺，且與烷基胺或二烷基胺的反應(yīng)產(chǎn)生側(cè)鏈保護(hù)的烷基酰胺或二烷基酰胺(即，C末端是--C(O)NRR1，其中R和R1如上定義)。側(cè)鏈保護(hù)隨后以通常方式通過用氟化氫處理來去除，以產(chǎn)生游離酰胺、烷基酰胺、或二烷基酰胺。
還可以使本發(fā)明的肽化合物環(huán)化，或在肽化合物末端上摻入脫氨或脫羧(descarboxy)殘基，從而使得不存在末端氨基或羧基，以減少對(duì)蛋白酶的易感性或限制肽化合物的構(gòu)象。本發(fā)明的肽化合物的C末端官能團(tuán)包括酰胺、酰胺低級(jí)烷基、酰胺二(低級(jí)烷基)、低級(jí)烷氧基、羥基、和羧基，及其低級(jí)酯衍生物，以及其藥學(xué)可接受的鹽。
除了前述N末端和C末端修飾外，本發(fā)明的肽化合物包括模擬肽，可以有利地用多種親水聚合物中的一種或多種進(jìn)行修飾，或與多種親水聚合物中的一種或多種共價(jià)偶聯(lián)。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)肽化合物用親水聚合物衍生化時(shí)，它們的溶解性和循環(huán)半衰期增加并且它們的免疫原性被掩蓋。前述可以在其結(jié)合活性中的少許減少(若有的話)的同時(shí)完成。適合于依照本發(fā)明使用的非蛋白質(zhì)聚合物包括但不限于，如由聚乙二醇和聚丙二醇例示的聚烷基醚、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素和纖維素衍生物、葡聚糖和葡聚糖衍生物等。一般地，此類親水聚合物具有約500-約100,000道爾頓的平均分子量，更優(yōu)選約2,000-約40,000道爾頓，且甚至更加優(yōu)選約5,000-約20,000道爾頓。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此類親水聚合物具有約5,000道爾頓、10,000道爾頓和20,000道爾頓的平均分子量。
本發(fā)明的肽化合物可以使用下述參考文獻(xiàn)中所述的任何方法用此類聚合物衍生化或與其偶聯(lián)Zallipsky，S.，Bioconjugate Chem.，6150-165(1995)；Monfardini，C等人，Bioconjugate Chem.，662-69(1995)；美國專利號(hào)4,640,835；美國專利號(hào)4,496,689；美國專利號(hào)4,301,144；美國專利號(hào)4,670,417；美國專利號(hào)4,791,192；美國專利號(hào)4,1 79,337或WO 95/34326，所有這些參考文獻(xiàn)整體引入本文作為參考。
在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽化合物用聚乙二醇(PEG)衍生化。PEG是環(huán)氧乙烷重復(fù)單位的線形、水溶性聚合物，具有2個(gè)末端羥基。PEGs通過其分子量進(jìn)行分類，所述分子量一般為約500道爾頓-約40,000道爾頓。在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的PEGs具有5,000道爾頓-約20,000道爾頓的分子量。與本發(fā)明的肽化合物偶聯(lián)的PEGs可以是分支或未分支的。(參見，例如，Monfardini，C.等人，Bioconjugate Chem.，662-69(1995))。PEGs從Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，Ala.)(現(xiàn)在是Nektar Therapeutics(San Carlo，CA)，Sigma Chemical Co.的部分及其他公司商購可得。此類PEGs包括但不限于，單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(tresylate)(MePEG-TRES)、和單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
簡言之，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用的親水聚合物例如PEG優(yōu)選在一個(gè)末端上由非活性基團(tuán)例如甲氧基或乙氧基進(jìn)行加帽。其后，聚合物在另一個(gè)末端上通過與合適的活化劑反應(yīng)來活化，所述活化劑例如氰尿酰鹵(例如，氰尿酰氯、溴或氟)、diimadozle、酐試劑(例如，二鹵琥珀酐、例如二溴琥珀酐)、酰疊氮、對(duì)重氮苯甲基醚(p-diazoiumbenzylether)、3-(對(duì)重氮苯氧基)-2-羥丙基醚)等。活化的聚合物隨后與本發(fā)明的肽化合物反應(yīng)以產(chǎn)生用聚合物衍生的肽化合物。可替代地，本發(fā)明的肽化合物中的官能團(tuán)可以進(jìn)行活化以與聚合物反應(yīng)，或2個(gè)基團(tuán)可以使用已知的偶聯(lián)方法在協(xié)同的偶聯(lián)反應(yīng)中進(jìn)行連接。將容易理解本發(fā)明的肽化合物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且使用的眾多其他反應(yīng)方案用PEG衍生化。
當(dāng)肽化合物用親水聚合物衍生化時(shí)，它們的溶解性和循環(huán)半衰期增加并且它們的免疫原性減少。前述可以在結(jié)合活性中的少許損失(若有的話)的同時(shí)完成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，衍生的肽具有未修飾肽那種的0.1-0.01倍的活性。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，衍生的肽具有未修飾肽那種的0.1-1倍的活性。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，衍生的肽具有大于未修飾肽的活性。
D.主鏈修飾 用于制備本發(fā)明化合物的肽衍生物的其他方法在Hruby等人，Biochem J.，268(2)249-262(1990)中描述，所述參考文獻(xiàn)引入本文作為參考。因此，本發(fā)明的肽化合物也充當(dāng)關(guān)于具有類似生物學(xué)活性的非肽化合物的結(jié)構(gòu)模型。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到多種技術(shù)可用于構(gòu)建具有與引導(dǎo)肽化合物相同或相似所需生物學(xué)活性，但就溶解性、穩(wěn)定性、以及對(duì)水解和蛋白酶解的易感性而言，具有比引導(dǎo)更有利的活性的化合物。參見，引入本文作為參考的Morgan等人，Ann.Rep.Med.Chem.，24243-252(1989)。這些技術(shù)包括用由下述物質(zhì)組成的主鏈替換肽主鏈膦酸酯、酰胺化物、氨基甲酸酯、氨磺酰、仲胺、和N-甲基氨基酸。
合適的試劑包括例如，其中氨基酸的羧基已用適合于形成上述鍵之一的部分替換的氨基酸類似物。
類似地，用膦酸酯鍵替換肽中的酰胺鍵可以以美國專利號(hào)5,359,115和5,420,328中所述方式來完成，所述專利的公開內(nèi)容整體引入本文作為參考。
E.二硫鍵形成 本發(fā)明的化合物可以以環(huán)化形式存在，在摻入的半胱氨酸(若存在的話)的巰基之間具有分子內(nèi)二硫鍵?？商娲兀梢援a(chǎn)生半胱氨酸巰基之間的分子間二硫鍵，以產(chǎn)生二聚(或更高的寡聚)化合物。一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基也可以用高半胱氨酸置換。
V.效用 本發(fā)明的肽化合物在體外可用作用于理解TPO生物學(xué)作用的獨(dú)特工具，包括被認(rèn)為影響TPO生產(chǎn)和受體結(jié)合過程，或受TPO生產(chǎn)和受體結(jié)合過程影響的許多因素的評(píng)估。本發(fā)明的肽化合物也可用于開發(fā)與TPO-R結(jié)合且激活TPO-R的其他化合物，因?yàn)楸景l(fā)明的肽化合物提供了應(yīng)促進(jìn)此類開發(fā)的關(guān)于結(jié)構(gòu)和活性之間關(guān)系的重要信息。
肽化合物也可在篩選新TPO受體激動(dòng)劑的測定中用作競爭結(jié)合劑。在此類測定實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽化合物可以不含修飾而使用，或可以以多種方式進(jìn)行修飾；例如通過標(biāo)記，例如共價(jià)或非共價(jià)連接直接或間接提供可檢測信號(hào)的部分。在這些測定的任何一種中，材料另外可以直接或間接進(jìn)行標(biāo)記。關(guān)于直接標(biāo)記的可能性包括標(biāo)記基團(tuán)例如放射性標(biāo)記例如125 I，酶(美國專利號(hào)3,645,090)例如過氧化物酶和堿性磷酸酶，以及能夠監(jiān)控?zé)晒鈴?qiáng)度、波長移動(dòng)或熒光偏振中的變化的熒光標(biāo)記(美國專利號(hào)3,940,475)。關(guān)于間接標(biāo)記的可能性包括使一個(gè)組成成分生物素化，隨后結(jié)合與上述標(biāo)記基團(tuán)之一偶聯(lián)的抗生物素蛋白。在其中肽化合物將與固體支持體附著的情況下，肽化合物還可以包括間隔基或接頭。
此外，基于其與TPO受體結(jié)合的能力，本發(fā)明的肽化合物可以用作試劑用于檢測活細(xì)胞、固定細(xì)胞上、生物學(xué)流體、組織勻漿、純化的天然生物材料等中的TPO受體。例如，通過標(biāo)記此類肽化合物，人們可以鑒定在其表面上具有TPO-R的細(xì)胞。此外，基于其結(jié)合TPO受體的能力，本發(fā)明的肽化合物可以用于原位染色、FACS(熒光激活細(xì)胞分選)、蛋白質(zhì)印跡、ELISA等。此外，基于其與TPO受體結(jié)合的能力，本發(fā)明的肽化合物可以用于受體純化、或在細(xì)胞表面上(或透化的細(xì)胞內(nèi))表達(dá)TPO受體的細(xì)胞純化。
本發(fā)明的肽化合物也可以用作商業(yè)試劑用于各種醫(yī)學(xué)研究和診斷用途。此類用途包括但不限于(1)作為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)用于在多種功能測定中定量候選TPO激動(dòng)劑的活性的用途；(2)維持TPO依賴性細(xì)胞系增殖和生長的用途；(3)通過共結(jié)晶在TPO受體結(jié)構(gòu)分析中的用途；(4)研究TPO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/受體活化機(jī)制的用途；和(5)其中TPO受體優(yōu)選活化，或此類活化針對(duì)已知量TPO激動(dòng)劑方便地校準(zhǔn)的其他研究和診斷應(yīng)用，等。
本發(fā)明的肽化合物可以與另外的細(xì)胞因子結(jié)合或獨(dú)立地用于體外擴(kuò)張巨核細(xì)胞及其定型祖先。參見，例如，引入本文作為參考的DiGiusto等人，PCT公開號(hào)95/05843?；瘜W(xué)療法和放射療法通過殺死快速分裂、更成熟的巨核細(xì)胞群體引起血小板減少癥。然而，這些治療處理也可以減少未成熟的、較低有絲分裂活性的巨核細(xì)胞前體細(xì)胞的數(shù)目和生存力。因此，通過TPO或本發(fā)明的肽化合物改善血小板減少癥可以通過在化學(xué)療法或放射療法后給患者輸注患者自身細(xì)胞群體得到加速，所述患者自身細(xì)胞通過體外培養(yǎng)富含巨核細(xì)胞和未成熟的前體。
本發(fā)明的肽化合物也可以施用于溫血?jiǎng)游锇ㄈ耍曰罨w內(nèi)的TPO-R。因此，本發(fā)明包含了用于TPO相關(guān)病癥的治療處理方法，所述方法包括施用本發(fā)明的肽化合物，其量足以模擬TPO在體內(nèi)對(duì)TPO-R的作用。例如，可以施用本發(fā)明的肽化合物以治療多種血液學(xué)病癥，包括但不限于，血小板病癥和血小板減少癥，特別是當(dāng)與骨髓輸血、放射療法、和化學(xué)療法相關(guān)時(shí)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，優(yōu)選首先給經(jīng)歷化學(xué)療法或放射療法的患者施用TPO拮抗劑，隨后施用本發(fā)明的TPO激動(dòng)劑。
本發(fā)明的肽化合物的活性可以在體外或體內(nèi)，在McDonald，Am.J.ofPediatric Hematology/Oncology，148-21(1992)描述的眾多模型之一中進(jìn)行評(píng)估，所述參考文獻(xiàn)引入本文作為參考。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物用于治療與骨髓輸血、放射療法、或化學(xué)療法相關(guān)的血小板減少癥。肽化合物一般將在化學(xué)療法、放射療法、或骨髓移植前或在此類暴露后預(yù)防地施用。
因此，本發(fā)明還提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含與藥學(xué)載體或稀釋劑結(jié)合的，作為活性成分的至少一種本發(fā)明的肽化合物。本發(fā)明的肽化合物可以經(jīng)口、肺、腸胃外(parental)(肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)(IV)或皮下注射)、吸入(經(jīng)由細(xì)粉制劑)、經(jīng)皮、鼻、陰道、直腸、或舌下施用途徑進(jìn)行施用，且可以配制為適合于每種施用途徑的劑型。參見，例如，Bernstein等人，PCT專利公開號(hào)WO 93/25221；Pitt等人，PCT專利公開號(hào)WO 94/17784；和Pitt等人，歐洲專利申請(qǐng)613,683，所述專利各自引入本文作為參考。
用于經(jīng)口施用的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、粉末、和顆粒。在此種固體劑型中，活性肽化合物與至少一種惰性藥學(xué)可接受的載體例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。如在通常實(shí)踐中一樣，此種劑型還可以包含除惰性稀釋劑外的其他物質(zhì)，例如潤滑劑例如硬脂酸鎂。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，劑型還可以包含緩沖劑。片劑和丸劑可以另外用腸溶衣制備。
用于經(jīng)口施用的液體劑型包括藥學(xué)可接受的乳劑、溶液、懸浮液、糖漿、與包含本領(lǐng)域中常用的惰性稀釋劑例如水的酏劑。除了此類惰性稀釋劑之外，組合物還可以包括佐劑，例如濕潤劑、乳化劑和懸浮劑、以及甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑。
根據(jù)本發(fā)明用于腸胃外(parental)施用的制劑包括無菌含水或非含水溶液、懸浮液或乳劑。非含水溶劑或載體的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油和玉米油、明膠、和可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯。此類劑型還可以包含佐劑例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑、和分散劑。它們可以通過下述方法進(jìn)行滅菌例如經(jīng)由細(xì)菌保留濾器過濾、將滅菌劑摻入組合物內(nèi)、照射組合物、或加熱組合物。它們還可以緊在使用前使用無菌水，或一些無菌可注射介質(zhì)進(jìn)行制備。
用于直腸或陰道施用的組合物優(yōu)選是栓劑，所述栓劑除了活性物質(zhì)外還可以包含賦形劑，例如可可脂或栓劑蠟。用于鼻或舌下施用的組合物也可以用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)賦形劑進(jìn)行制備。
可以施用包含肽化合物的組合物用于預(yù)防和/或治療處理。在治療應(yīng)用中，組合物如上所述給已患有疾病的患者施用，其量足以治愈或至少部分阻止疾病及其并發(fā)癥的癥狀。足以達(dá)到這點(diǎn)的量被定義為“治療有效劑量”。對(duì)于這種用途有效的量將取決于疾病的嚴(yán)重性以及患者的重量和一般狀態(tài)。
本發(fā)明的組合物也可以通過例如Tice和Bibi(在Treatise onControlled Drug Delivery中，編輯A.Kydonieus，Marcel Dekker，New York(1992)，第315-339頁)的方法微囊化。
在預(yù)防應(yīng)用中，包含本發(fā)明的肽化合物的組合物施用于對(duì)特定疾病易感，或在其他方面處于特定疾病危險(xiǎn)中的患者。此種量被定義為“預(yù)防有效劑量”。在這種用途中，精確量再次取決于患者的健康狀態(tài)和重量。
對(duì)于有效治療所需的肽化合物量將取決于許多不同因素，包括施用方式、靶位點(diǎn)、患者的生理學(xué)狀態(tài)、以及施用的其他藥物(medicant)。因此，治療劑量應(yīng)當(dāng)被滴定(titrate)以使安全性和功效最優(yōu)化。一般地，體外使用的劑量可以在這些試劑原位施用中有用的量方面提供有用的指導(dǎo)。關(guān)于治療具體病癥的有效劑量的動(dòng)物試驗(yàn)將提供人劑量的進(jìn)一步推測性指標(biāo)。各種考慮在下述參考文獻(xiàn)中描述，例如Gilman等人，(編輯)，Goodman和Gilman′sThe Pharmacological Basis ofTherapeutics，第8版，Pergamon Press(1990)；以及Remington′sPharmaceutical Sciences，第7版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1985)；所述參考文獻(xiàn)各自在此引入作為參考。
當(dāng)以約0.001mg-約10mg/kg體重/天的劑量范圍施用時(shí)，本發(fā)明的肽化合物在TPO介導(dǎo)的狀況治療中有效。采用的具體劑量由待治療的具體狀況、施用途徑以及由主治臨床醫(yī)生取決于下述因素的判斷來調(diào)節(jié)例如病狀嚴(yán)重性、患者的年齡和一般狀況等。
實(shí)施例1 固相肽化合物合成 本發(fā)明的肽化合物可以例如，使用Merrifield固相合成技術(shù)(參見Steward和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical，Rockford，Ill.(1984)以及Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149(1963))或Applied Biosystems Inc.Model 431A或433A肽合成儀進(jìn)行合成。肽化合物可以使用Applied Biosystems Inc.Synth AssistTM 1.0.0或SynthAssistTM 2.0.2的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行裝配。每種偶聯(lián)可以進(jìn)行2x30分鐘，使用HBTU(2-(1H-苯并三唑(benzatriazol)-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯)和HOBt(1-羥基苯并三唑)。
使用的樹脂可以是HMP樹脂(對(duì)羥甲基苯氧甲基)聚苯乙烯樹脂或PAL(Milligen/Biosearch)，所述PAL是用5-(4′-Fmoc-氨基甲基-3，5′-二甲氧基苯氧基)戊酸作為接頭的交聯(lián)聚苯乙烯樹脂。PAL樹脂的使用在肽與樹脂切開后導(dǎo)致羧基末端酰胺功能性。切割后，HMP樹脂產(chǎn)生在終產(chǎn)物C末端上的羧酸部分。大多數(shù)試劑、樹脂、和保護(hù)的氨基酸(游離或在樹脂上)可以購自Millipore或Applied Biosystems Inc.。
在偶聯(lián)程序期間Fmoc基團(tuán)可以用于氨基保護(hù)。氨基酸上的伯胺保護(hù)可以用Fmoc來完成，并且可以使用側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，例如用于絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸、和蘇氨酸的叔丁基；用于谷氨酰胺的三苯甲基；用于精氨酸的Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰)；用于色氨酸的N-叔丁氧羥基；用于組氨酸的N-三苯甲基和用于半胱氨酸的S-三苯甲基。
從樹脂中取出肽化合物和同時(shí)使側(cè)鏈功能脫保護(hù)可以通過用試劑K處理或其輕微修飾來完成?？商娲?，在具有酰胺化羧基末端的那些肽的合成中，完全裝配的肽可以用90％三氟乙酸、5％乙二硫醇(ethanedithiol)、和5％水的混合物進(jìn)行切割，起初于4℃，并逐漸增至室溫。脫保護(hù)的肽化合物可以用二乙醚進(jìn)行沉淀。純化可以是通過制備型、反相、高效液相層析在C18鍵合硅膠柱上，使用溶于0.1％三氟乙酸的乙腈/水梯度。均質(zhì)肽化合物可以通過可應(yīng)用時(shí)的快原子轟擊質(zhì)譜法，或電霧化質(zhì)譜法和氨基酸分析來表征。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽化合物使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且使用的標(biāo)準(zhǔn)合成程序進(jìn)行二聚化。根據(jù)這些合成方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地制備依照本發(fā)明的二聚物肽化合物。此外，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，二聚亞單位可以使用已知方法和接頭容易地進(jìn)行連接。
實(shí)施例2 肽化合物的聚乙二醇化 本發(fā)明的肽化合物的聚乙二醇化可以通過眾所周知的技術(shù)來進(jìn)行。例如，本發(fā)明的肽化合物可以以10mg/ml的濃度溶解于100mM N-二(羥乙基)甘氨酸pH 8.0中，加入1.25倍摩爾過量的粉末狀PEG2(從Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，Ala.，現(xiàn)在的Nektar Therapeutics(San Carlo，CA)商購可得)中，且于室溫?cái)噭?dòng)直至反應(yīng)完全，一般為1-2小時(shí)。反應(yīng)通過反相HPLC來監(jiān)控，使用40-65％乙腈梯度使用YMC ODS AQ柱。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，將溶液加入第二份1.25摩爾過量的粉末狀PEG2中，且使過程重復(fù)4次，對(duì)于每摩爾多肽使用總共5摩爾PEG2。溶液用PBS稀釋2倍以減少粘度，且裝載到先前進(jìn)行平衡的superdex 200柱(Pharmacia)上，并且用PBS進(jìn)行洗脫。來自大小排阻柱的級(jí)分可以通過反相HPLC進(jìn)行分析。在任何單-PEG肽化合物之前洗脫、包含二-PEG-多肽的級(jí)分可以進(jìn)行合并，且貯存于5℃或凍干。
實(shí)施例3 關(guān)于TPO聚乙二醇化的第1號(hào)化合物的血小板生成活性的臨床前動(dòng)物研究 第1號(hào)TPO化合物與內(nèi)源TPO沒有共享任何序列同源性，從而減輕了形成與內(nèi)源TPO交叉反應(yīng)的抗體的危險(xiǎn)。第1號(hào)TPO化合物進(jìn)行聚乙二醇化，以減少清除率且進(jìn)一步減少抗原性。這個(gè)實(shí)施例描述了關(guān)于聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物在動(dòng)物中的血小板生成活性的臨床前研究。
正常雄性Wistar大鼠(來源)用于該研究。其他動(dòng)物例如狗、小鼠、猴等也可以用于臨床前研究。所有涉及動(dòng)物的程序都在由美國實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理評(píng)估和授權(quán)管理協(xié)會(huì)(American Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care)(AAALAC)完全授權(quán)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，且依照The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH)來進(jìn)行。
正常雄性Wistar大鼠(在給藥時(shí)年齡10周，體重范圍230-367克)用單次靜脈內(nèi)劑量的第1號(hào)TPO化合物以30、100或300ug/kg進(jìn)行處理(40只大鼠/組)。在給藥前，給藥后96、144、192、240、288和312小時(shí)時(shí)，通過穿刺未麻醉的大鼠(5只大鼠/時(shí)間點(diǎn)，EDTA作為抗凝劑)頸靜脈收集約0.5mL血液，且使用自動(dòng)化血液學(xué)分析系統(tǒng)評(píng)估血小板計(jì)數(shù)。在每次樣品收集前動(dòng)物禁食過夜，可獲得水。
通過在第4天時(shí)的最早給藥后評(píng)估，單次靜脈內(nèi)劑量的聚乙二醇化第1號(hào)TPO化合物(30、100或300μg/kg)導(dǎo)致正常雄性Wistar大鼠中的外周血小板計(jì)數(shù)增加(圖6)。在2周隨訪期間，血小板計(jì)數(shù)每2天進(jìn)行評(píng)估且與給藥前計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。300μg/kg劑量誘導(dǎo)血小板計(jì)數(shù)最大的增加，這在第14天時(shí)回到基線。
實(shí)施例4 關(guān)于聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的血小板生成活性的I期臨床研究 進(jìn)行I期研究以研究聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的耐受性、藥物動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)。這個(gè)實(shí)施例描述了在健康男性志愿者中單次靜脈內(nèi)注射后對(duì)聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的I期研究。在多次靜脈內(nèi)注射或其他施用方式和/或給需要治療的患者后，關(guān)于聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物以及根據(jù)本發(fā)明的其他化合物的I期研究，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的規(guī)程來進(jìn)行。
40名志愿者以6∶2的比率隨機(jī)接受作為靜脈內(nèi)快速灌注(single i.v.bolus)的聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物或安慰劑。8名受試者以6∶2的比率隨機(jī)接受單次注射的聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物或安慰劑，其劑量范圍為0.375、0.75、1.5、2.25或3μg/kg。聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的藥物動(dòng)力學(xué)應(yīng)答測量為血小板計(jì)數(shù)中的升高。聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物水平在缺乏血小板的血漿中使用驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫吸附測定進(jìn)行測定。內(nèi)源TPO、EPO、IL-6和IL-11水平在指定時(shí)間點(diǎn)使用標(biāo)準(zhǔn)免疫測定進(jìn)行測量。生物傳感器免疫測定(BiaCoretechnology)用于測量針對(duì)聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的肽部分的抗體形成。在聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物施用后4小時(shí)和12天時(shí)，對(duì)血小板功能的作用通過監(jiān)控膠原誘導(dǎo)的血小板聚集進(jìn)行測量。
PK分析指出聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的劑量相關(guān)動(dòng)力學(xué)，盡管在0.75μg/kg或更低劑量時(shí)，聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的血漿濃度一般低于6.25ng/mL的定量極限(圖7)。0.375μg/kg劑量組中的4名受試者和3.0μg/kg聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物劑量組中的1名受試者沒有可以定量的血漿水平。平均Cmax值為0.75μg/kg聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物時(shí)的10.9ng/mL至3.0μg/kg聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物時(shí)的61.7ng/mL(表1)。在0.375μg/kg靜脈內(nèi)的第1號(hào)TPO化合物時(shí)不可測量到PK數(shù)據(jù)。聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的平均最終半衰期為約18-36小時(shí)。中值tmax為0.09-2小時(shí)。Cmax伴隨漸增劑量的增加是近似與劑量成比例的，但在用漸增劑量的標(biāo)準(zhǔn)化AUC0-24值中存在明顯增加，從而暗示高于與劑量成比例的增加。
表1.PK分析概括
針對(duì)聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物施用的血小板應(yīng)答類似于關(guān)于rhTPO和AMG531的公開結(jié)果。血小板計(jì)數(shù)劑量依賴性增加，在第10-12天時(shí)達(dá)到峰水平，并且計(jì)數(shù)在3-4周內(nèi)回到基線(圖8)。平均峰血小板計(jì)數(shù)為0.375μg/kg靜脈內(nèi)時(shí)315x109/L至3μg/kg靜脈內(nèi)時(shí)685x109/L，且從基線增加的平均最大血小板計(jì)數(shù)為0.375μg/kg時(shí)的1.4倍至3.0μg/kg時(shí)的3.2倍(表2)。在接受0.75ug/kg劑量的聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的6名受試者中的4名中，觀察到血小板至少50％的增加，而在接受1.5ug/kg劑量的6名受試者中的3名中觀察到血小板計(jì)數(shù)至少2倍的增加，等。0.75ug/kg靜脈內(nèi)劑量已選擇為用于II期臨床研究的起始劑量。
除血小板計(jì)數(shù)中的變化外，其他成熟的循環(huán)血細(xì)胞不受影響(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，在施用時(shí)、給藥后12天時(shí)、新產(chǎn)生的血小板出現(xiàn)時(shí)，聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的施用都不影響血小板功能。
表2.血小板計(jì)數(shù)分析概括 評(píng)估了聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物施用對(duì)已知具有血小板生成活性的生長因子的作用。內(nèi)源TPO水平劑量依賴性地增加，在給藥后3天時(shí)達(dá)到峰水平(圖9)。在IL-6、IL-11和EPO水平的血液水平中沒有觀察到顯著變化。
作為全血中膠原誘導(dǎo)的血小板聚集評(píng)估的血小板功能在處理之間沒有不同。沒有一名受試者經(jīng)歷嚴(yán)重的不利事件或劑量限制毒性。最常觀察到的不利事件包括輕微頭痛和疲勞，且在積極治療和安慰劑后都出現(xiàn)。沒有檢測到針對(duì)聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物的抗體。這些結(jié)果指出聚乙二醇化的第1號(hào)TPO化合物在測試的劑量范圍時(shí)是良好耐受的。
盡管上文只具體描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但將理解在不背離本發(fā)明的精神和預(yù)期范圍的情況下，本發(fā)明的修飾和變化是可能的。
權(quán)利要求
1.一種用于治療患有對(duì)血小板生成素激動(dòng)劑療法易感的病癥的患者的方法，其包括給所述患者施用治療有效劑量或量的肽化合物，所述肽化合物包括下述序列(H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)-K(NH2)-(X10RAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H，(SEQ ID NO7)，其中X10是肌氨酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物以約0.1-約5mg/kg的劑量范圍施用。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物分別以約0.375、0.75、1.5、2.25或3mg/kg的劑量范圍施用。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用在約0.75μg/kg肽化合物時(shí)導(dǎo)致約10ng/mL的平均Cmax值。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用在約3.0μg/kg肽化合物時(shí)導(dǎo)致約60ng/mL的平均Cmax值。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用導(dǎo)致約18小時(shí)-約36小時(shí)的所述肽化合物平均最終半衰期。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用導(dǎo)致約0.09小時(shí)-約2小時(shí)的中值tmax。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用在約0.75ug/kg劑量時(shí)導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)約50％的增加。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用在大于約0.75ug/kg劑量時(shí)導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)約2倍的增加。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物的施用導(dǎo)致內(nèi)源TPO水平增加。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物與親水聚合物共價(jià)附著。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述親水聚合物具有約500-約40,000道爾頓的平均分子量。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述親水聚合物具有約5,000-約20,000道爾頓的平均分子量。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述親水聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸和聚乙醇酸。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述親水聚合物是聚乙二醇。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物是二聚的。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述肽化合物的每個(gè)所述二聚亞單位與親水聚合物共價(jià)附著。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述親水聚合物是聚乙二醇。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、和單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述肽化合物具有下式
其中(2-Nal)是β-(2-萘基)丙氨酸且(Sar)是肌氨酸。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述肽化合物與親水聚合物共價(jià)附著。
22.權(quán)利要求21的肽化合物，其中所述親水聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸和聚乙醇酸。
23.權(quán)利要求22的肽化合物，其中所述親水聚合物是聚乙二醇。
24.權(quán)利要求23的肽化合物，其中所述聚乙二醇具有約5,000-約20,000道爾頓的平均分子量。
25.權(quán)利要求23的肽化合物，其中所述聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、和單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
26.權(quán)利要求21的肽化合物，其中所述肽化合物的每個(gè)所述二聚亞單位與親水聚合物共價(jià)附著。
27.權(quán)利要求26的肽化合物，其中所述親水聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸和聚乙醇酸。
28.權(quán)利要求27的肽化合物，其中所述親水聚合物是聚乙二醇。
29.權(quán)利要求28的肽化合物，其中所述聚乙二醇具有約5,000-約20,000道爾頓的平均分子量。
30.權(quán)利要求28的肽化合物，其中所述聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、和單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
全文摘要
公開了與血小板生成素受體(c-mpl或TPO-R)結(jié)合并激活血小板生成素受體，或以其他方式充當(dāng)TPO激動(dòng)劑的肽化合物。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101287749SQ200680037610
公開日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2006年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月9日
發(fā)明者B·R·麥唐納, J·K·維斯, E·J·于爾科夫 申請(qǐng)人:奧索-麥克尼爾藥品公司