專利名稱：一種凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗及其制備方法。
麻疹是兒童最常見的急性傳染病。世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道全球每年麻疹發(fā)病3000-4000萬例，死亡70多萬。上海生物制品研究所自上世紀(jì)60年代研究成功滬191株麻疹活疫苗以來，對(duì)預(yù)防和控制麻疹的發(fā)病和流行發(fā)揮了十分有效的作用。WHO也將麻疹疫苗列為全球六種EPI(全球兒童擴(kuò)大計(jì)劃免疫)制品之一。我國目前仍以使用單價(jià)麻疹疫苗為主。
流行性腮腺炎(簡稱腮腺炎)是小兒最常見的疾病之一，近幾年的發(fā)病呈上升趨勢。上海生物制品研究所自上世紀(jì)80年代初研究成功S79株腮腺炎活疫苗，90年代中開始推廣使用以來，對(duì)預(yù)防和控制腮腺炎的發(fā)病作用明顯。
WHO倡導(dǎo)“全球兒童疫苗計(jì)劃”，將開發(fā)聯(lián)合疫苗作為其中一項(xiàng)內(nèi)容。聯(lián)合疫苗的優(yōu)越性在于將多種單價(jià)疫苗的功能集于一個(gè)制品，發(fā)揮出一針防多病，減少針次，便于臨床上推廣使用，進(jìn)一步提高計(jì)劃免疫工作的實(shí)施，還可節(jié)約預(yù)防工作的間接成本。國際上早已制備出麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹三聯(lián)活疫苗，國內(nèi)近幾年才開始研究病毒類聯(lián)合疫苗。
本發(fā)明的目的是提供一種國產(chǎn)化、價(jià)格低、減少針次、一針防二病，用于兒童預(yù)防麻疹和腮腺炎的活疫苗及其制備方法。
本發(fā)明用10日齡的無特定病原體(SPF)雞胚制成原代雞胚細(xì)胞，采用10L瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)成單層細(xì)胞，分別接種滬191株麻疹病毒和S79株腮腺炎病毒，經(jīng)培養(yǎng)收集麻疹病毒液和腮腺炎病毒液，再經(jīng)外源因子等檢定合格，通過澄清過濾合并成單價(jià)病毒原液。將合格的麻疹和腮腺炎單價(jià)病毒原液按一定比例配制，加入凍干保護(hù)劑制成半成品，最后分裝凍干制成最終成品。
本發(fā)明所采用的滬191株麻疹病毒和S79株腮腺炎病毒，分別是用于生產(chǎn)滬191株麻疹活疫苗和S79株腮腺炎活疫苗的病毒毒株，以上兩種疫苗已分別通過國家食品藥品監(jiān)督管理局的新藥審評(píng)，獲得新藥證書和生產(chǎn)文號(hào)。
為制備高滴度的麻疹疫苗病毒原液，本發(fā)明采用10L瓶細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)取代靜止培養(yǎng)的方法，增加單層細(xì)胞貼壁面積，以細(xì)胞數(shù)量的增加提高病毒滴度；并改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的pH和營養(yǎng)成分等條件，以改善細(xì)胞質(zhì)量提高病毒滴度；同時(shí)減少病毒培養(yǎng)的最終加液量，以增加單位體積中的病毒量提高病毒滴度。
為制備高滴度的腮腺炎疫苗病毒原液，本發(fā)明采用3L瓶細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)取代10L瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，進(jìn)一步控制瓶內(nèi)空間和pH變化，以改善細(xì)胞質(zhì)量提高病毒滴度；嚴(yán)格控制腮腺炎病毒繁殖的收獲時(shí)間，掌握細(xì)胞病變的最佳程度(細(xì)胞病變達(dá)80-90％)，以獲得高滴度病毒原液；減少病毒培養(yǎng)的最終加液量，以增加單位體積中的病毒量提高病毒滴度。
本發(fā)明進(jìn)一步研究了兩種疫苗病毒原液聯(lián)合配制的最佳比例。根據(jù)WHO規(guī)程要求聯(lián)合疫苗中腮腺炎病毒量至少比麻疹病毒高5倍，并兼顧二者相互的稀釋作用，最后確定二聯(lián)疫苗適宜的配比為1份麻疹病毒原液+2～3份腮腺炎病毒原液+0.5～1份保護(hù)劑。
在本發(fā)明的實(shí)施過程中，疫苗的凍干保護(hù)劑由蔗糖、乳糖、山梨醇、味精、明膠、尿素、人白蛋白等成分，按不同種類和濃度配制而成。當(dāng)凍干保護(hù)劑中含有3-8％蔗糖、0.5-1.5％明膠、0.5-1.5％谷氨酸鈉、0.3-0.8％尿素、0.3-0.8％人白蛋白時(shí)，效果最好。
本發(fā)明所提供的凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗，產(chǎn)品質(zhì)量超過兩種單價(jià)疫苗的國家標(biāo)準(zhǔn)，并達(dá)到世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹聯(lián)合疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明所提供的凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗，與國外麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹聯(lián)合疫苗同步進(jìn)行的臨床安全性和有效性比較觀察安全性均無明顯的局部反應(yīng)和全身反應(yīng)；觀察有效性的免疫后抗體陽轉(zhuǎn)率，麻疹100％(進(jìn)口疫苗88.9％)，腮腺炎87.8％(進(jìn)口疫苗86.7％)；觀察3年的免疫持久性的抗體陽性率，麻疹100％(進(jìn)口疫苗100％)，腮腺炎77.8％(進(jìn)口疫苗75.0％)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均無顯著性差異，說明該產(chǎn)品達(dá)到國際同類產(chǎn)品的質(zhì)量。
本發(fā)明所述之凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗及其制備方法，所采用的病毒毒株為國內(nèi)所特有，其他原料和試劑亦為國產(chǎn)，生產(chǎn)成本低，一針疫苗可以同時(shí)預(yù)防麻疹和腮腺炎二種傳染病，可廣泛應(yīng)用于兒童免疫接種。
以下結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。這些實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明做說明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1高滴度麻疹疫苗病毒原液的生產(chǎn)采用10L瓶細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)取代靜止培養(yǎng)的方法，增加單層細(xì)胞貼壁面積，以細(xì)胞數(shù)量的增加提高病毒滴度；改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的pH和營養(yǎng)成分等條件，以改善細(xì)胞質(zhì)量提高病毒滴度；減少病毒培養(yǎng)的最終加液量，以增加單位體積中的病毒量提高病毒滴度。
具體參數(shù)和比較結(jié)果列表如下
實(shí)施例2高滴度腮腺炎疫苗病毒原液的生產(chǎn)采用3L瓶細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)取代10L瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，進(jìn)一步控制瓶內(nèi)空間和pH變化，以改善細(xì)胞質(zhì)量提高病毒滴度；嚴(yán)格控制腮腺炎病毒繁殖的收獲時(shí)間，掌握細(xì)胞病變的最佳程度(細(xì)胞病變達(dá)80-90％)，以獲得高滴度病毒原液；減少病毒培養(yǎng)的最終加液量，以增加單位體積中的病毒量提高病毒滴度。
具體參數(shù)和比較結(jié)果列表如下
以3L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)觀察不同細(xì)胞病變程度時(shí)收獲的病毒原液滴度(lgCCID50/ml)
實(shí)施例3麻疹、腮腺炎疫苗病毒原液聯(lián)合配制的最佳比例和避免兩種病毒的相互干擾作用根據(jù)稀釋倍數(shù)確定單價(jià)病毒原液的最低病毒滴度將單價(jià)麻疹、腮腺炎兩種病毒原液分別用不同體積的M199維持液做配制比例試驗(yàn)，并進(jìn)行病毒滴度測定，以了解病毒滴度下降幅度，確定兩種病毒原液的最低滴度。結(jié)果如下
可見兩種疫苗原液1∶1配比病毒滴度下降0.4-0.61gCCID50/ml，1∶2配比病毒滴度下降0.7-0.91gCCID50/ml，1∶3配比病毒滴度下降0.9-1.11gCCID50/ml，1∶4配比病毒滴度下降1.4-1.61gCCID50/ml?？紤]二聯(lián)疫苗最低免疫的病毒含量(麻疹3.31gCCID50/ml，腮腺炎4.01gCCID50/ml)，以及加凍干保護(hù)劑的稀釋和熱穩(wěn)定性的病毒損失等因素，確定兩種疫苗原液的最低病毒滴度為麻疹≥5.21gCCID50/ml，腮腺炎≥5.71gCCID50/ml。
觀察兩種病毒之間的干擾現(xiàn)象及確定兩種病毒原液的配比麻疹、腮腺炎兩種病毒混合前后的滴度比較(lgCCID50/ml)
可見兩種疫苗原液配比后相互之間稀釋倍數(shù)的病毒滴度下降，1.3-4倍稀釋分別為0.31g-1.01g，而相應(yīng)稀釋倍數(shù)的對(duì)照病毒滴度下降與二聯(lián)疫苗配比時(shí)基本一致，說明滴度下降由相互稀釋造成，兩種病毒之間無明顯干擾現(xiàn)象。
根據(jù)WHO規(guī)程要求聯(lián)合疫苗中腮腺炎病毒量至少比麻疹病毒高5倍，并兼顧二者相互的稀釋作用，最后確定二聯(lián)疫苗適宜的配比為1份麻疹原液+2～3份腮腺炎原液+0.5～1份保護(hù)劑二聯(lián)活疫苗與同批單價(jià)疫苗凍干后的病毒干擾比較用配制二聯(lián)苗的同一批麻疹和腮腺炎原液，以M199液稀釋，即麻疹原液1份+2.5份M199液，腮腺炎原液2.5份+1份M199液，然后加同樣比例的保護(hù)劑平行凍干。檢定結(jié)果顯示，二聯(lián)疫苗的麻疹和腮腺炎與單價(jià)麻疹和腮腺炎疫苗的滴度、熱穩(wěn)定性差異無顯著意義(麻疹t＝0.443，P＞0.05，腮腺炎t＝0.168，P＞0.05)，說明兩種病毒混合相互間無明顯干擾作用。
3批麻腮二聯(lián)疫苗與單價(jià)疫苗的比較
實(shí)施例4凍干保護(hù)劑及冷凍干燥技術(shù)疫苗的凍干保護(hù)劑及凍干工藝是在兩種單價(jià)疫苗的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，調(diào)整凍結(jié)、抽真空和保溫時(shí)間等的凍干工藝曲線，獲得較滿意的結(jié)果。
保護(hù)劑的優(yōu)選采用蔗糖、乳糖、山梨醇、味精、明膠、尿素、人白蛋白等成分，按不同種類和濃度配制成20組進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果第5號(hào)保護(hù)劑(由蔗糖、明膠、味精、尿素、人白蛋白組成)較優(yōu)越。以后經(jīng)過調(diào)整凍干工藝進(jìn)一步證實(shí)了該保護(hù)劑的適宜性，并推廣應(yīng)用于二聯(lián)活疫苗的凍干工藝，尤其在37℃7天的熱穩(wěn)定性中具有明顯的優(yōu)越性。
實(shí)施例5凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗穩(wěn)定性及質(zhì)量檢定6批二聯(lián)疫苗與2批單價(jià)麻疹和腮腺炎疫苗，放2～8℃不同時(shí)間觀察其病毒滴度變化，結(jié)果保存18個(gè)月病毒滴度下降均1≤1.0LgCCID50/ml，二聯(lián)疫苗與單價(jià)疫苗的穩(wěn)定性基本一致。
6批麻腮二聯(lián)疫苗與單價(jià)麻疹和腮腺炎疫苗的2～8℃穩(wěn)定性
按上述工藝制備9批凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗，以單價(jià)麻疹、腮腺炎疫苗的制檢規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)檢定全部合格。其中的7批由中國藥品生物制品檢定所檢定，結(jié)果也全部達(dá)到規(guī)程要求。
7批凍干麻腮二聯(lián)活疫苗國家的檢定結(jié)果
*規(guī)程改為測殘余牛血清蛋白含量，單位ng/ml
權(quán)利要求
1.一種凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗，其特征在于同時(shí)含有麻疹病毒和腮腺炎病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗，其特征在于其所含的麻疹病毒為滬191株麻疹病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗，其特征在于其所含的腮腺炎病毒為S79株腮腺炎病毒。
4.一種凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗的制備方法，其特征在于采用無特定病原體(SPF)雞胚制成原代雞胚細(xì)胞，分別接種滬191株麻疹病毒和S79株腮腺炎病毒，經(jīng)培養(yǎng)收集麻疹病毒液和腮腺炎病毒液，檢定合格后通過澄清過濾合并成單價(jià)病毒原液，再將合格的麻疹和腮腺炎單價(jià)病毒原液按一定比例配制，加入凍干保護(hù)劑制成半成品，最后分裝凍干制成最終成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗制備方法，其特征在于麻疹病毒原液、腮腺炎病毒原液和凍干保護(hù)劑的配比比例為1份麻疹病毒原液+2～3份腮腺炎病毒原液+0.5～1份凍干保護(hù)劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗制備方法，其特征在于凍干保護(hù)劑中含有3-8％蔗糖、0.5-1.5％明膠、0.5-1.5％谷氨酸鈉、0.3-0.8％尿素、0.3-0.8％人白蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗制備方法，其特征在于在制備高滴度的麻疹疫苗病毒原液過程中，采用10L瓶細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)取代靜止培養(yǎng)的方法，并改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的pH和營養(yǎng)成分等條件，同時(shí)減少病毒培養(yǎng)的最終加液量。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗制備方法，其特征在于在制備高滴度的腮腺炎疫苗病毒原液過程中，采用3L瓶細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)取代10L瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，控制瓶內(nèi)空間和pH變化，嚴(yán)格控制腮腺炎病毒繁殖的收獲時(shí)間，掌握細(xì)胞病變的最佳程度(細(xì)胞病變達(dá)80-90％)，并減少病毒培養(yǎng)的最終加液量。
全文摘要
本發(fā)明提供一種國產(chǎn)化、價(jià)格低、減少針次、一針防二病，用于兒童預(yù)防麻疹和腮腺炎的凍干麻疹、腮腺炎二聯(lián)活疫苗及其制備方法。采用10日齡的無特定病原體(SPF)雞胚制成原代雞胚細(xì)胞，10L瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)成單層細(xì)胞，分別接種滬191株麻疹病毒和S79株腮腺炎病毒，經(jīng)培養(yǎng)收集麻疹病毒液和腮腺炎病毒液，再經(jīng)外源因子等檢定合格，通過澄清過濾合并成單價(jià)病毒原液，將合格的麻疹和腮腺炎單價(jià)病毒原液按一定比例配制，加入凍干保護(hù)劑制成半成品，最后分裝凍干制成最終成品。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1772294SQ20041006810
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者徐聞青, 王兵, 陳志慧 申請(qǐng)人:上海生物制品研究所