專利名稱：博寧霉素在治療銀屑病和脂溢性皮炎中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤抗生素博寧霉素在治療銀屑病和脂溢性皮炎中的新用途。
本實驗室對博寧霉素的前期研究發(fā)現(xiàn)，該抗生素不僅對實驗動物的腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，且毒性較低[發(fā)明專利公報，15(41)公開號CN1231340A]，而且進一步的研究表明，它對銀屑病(牛皮癬)和脂溢性皮炎也有肯定的作用。本發(fā)明所使用的博寧霉素(Z-893)是從爭光霉素復(fù)合物分離得到的一個新化合物。爭光霉素是由輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillusvar.pingyangensis n.sp)產(chǎn)生的一組具抗腫瘤活性的復(fù)合物。博寧霉素可以用輪枝鏈霉菌平陽變種經(jīng)深層發(fā)酵培養(yǎng)，分離提取制備得到。博寧霉素具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式 R＝NH(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCOCH3MW1540(M+1，F(xiàn)AB-MS)C62H98N20O22S2由于博寧霉素毒性低，既可全身用藥，也可局部外用，全身用藥時對自身免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)無損害，對重要器官如心、肝、腎和肺部基本沒有影響，且無局部刺激作用，這是一般抗腫瘤藥所不具備的優(yōu)點。因此將博寧霉素作為一種治療銀屑病(牛皮癬)、脂溢性皮炎等不明病因的疑難疾患專用藥物進行研究開發(fā)具有良好的前景。
本發(fā)明的目的是提供一種抗腫瘤抗生素博寧霉素在制備治療銀屑病、脂溢性皮炎藥物中的新用途。
1)、用藥博寧霉素粉針劑(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供)；甲氨蝶呤(北京醫(yī)科大學(xué)實驗藥廠生產(chǎn)，批號20000502)；博寧霉素藥膏和甲氨蝶呤藥膏均為自制。本發(fā)明使用的外用藥可以是霜劑、軟膏、搽劑、凝膠劑等。
2)、動物昆明種小白鼠(沈陽陸軍總醫(yī)院動物室提供，合格證號10-5113)。
3)、方法A、對小鼠雌激素期陰道上皮有絲分裂的影響取雌性健康小白鼠70只，20-30g。腹腔注射乙烯雌酚0.2mg/只，每日1次，連續(xù)3日，使其處于雌激素期，然后按表1隨機分為7組，每組10只，陽性對照藥(甲氨蝶呤1mg/kg)和博寧霉素腹腔注射，高劑量組(10mg/kg)、低劑量組(5mg/kg)，每日ip1次，連續(xù)3天，外用對照藥(0.1％甲氨蝶呤藥膏)和博寧霉素外用藥膏(0.1％和0.05％)組，每日涂抹陰道一次，連續(xù)3天。末次藥后一小時，腹腔注射秋水仙堿2mg/kg，6h后后處死小鼠，取其陰道組織，用10％福爾馬林固定，石臘包埋，HE染色。光鏡下計數(shù)300個陰道上皮基底細胞的有絲分裂數(shù)，其百分率為有絲分裂指數(shù)(表1)。
表1對小鼠雌激素期陰道上皮細胞有絲分裂的影響(n＝10)組別劑量 給藥方式 有絲分裂指數(shù)模型對照 18.196±2.957甲氨蝶呤1mg/kg 腹腔注射 5.580±2.722***博寧霉素(針劑) 5mg/kg 腹腔注射 15.338±3.129*105mg/kg 腹腔注射 13.723±3.033**甲氨蝶呤藥膏0.1％外用涂抹 5.077±1.154***博寧霉素(膏劑) 0.05％ 外用涂抹 6.634±1.8020.1％外用涂抹 5.763±1.431***與模型對照組比較，-P＜0.05，**P＜0.01，***＜0.001。
B、對小鼠尾部表皮厚度和顆粒層形成的影響取健康小白鼠70只，雌雄各半，按表2隨機分成7組，每組10只，陽性對照藥甲氨蝶呤隔日腹腔注射一次，共計8次，博寧霉素高、低劑量組每日腹腔注射一次，共計15次。外用對照藥甲氨蝶呤藥膏和0.1％及0.05％博寧霉素藥膏，每日涂抹鼠尾一次，連續(xù)15日，末次藥后2h處死全部小鼠，取距鼠尾根部1.8cm處背部皮膚一長條，用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)制片，HE染色，于光鏡下(400X)測量鼠尾表皮厚度和顆粒層形成情況(表2)。
表2對小鼠尾部表皮厚度和顆粒層形成的影響給藥方式組別劑量表皮厚度 顆粒層(次數(shù))對照組 11.28±3.335.8±3.4甲氨蝶呤(針劑) 1mg/kg腹腔注射(8) 10.81±2.0717.2±5.6*博寧霉素(針劑) 5mg/kg腹腔注射(15) 9.54±1.45 20.1±5.6*10mg/kg 腹腔注射(15) 8.35±0.67 25.8±6.6*ΔΔ甲氨蝶呤(膏劑) 0.1％ 外用(15) 13.6±2.21 25.4±7.3*博寧霉素(膏劑) 0.05％外用(15) 14.8±2.38 33.2±8.9*Δ0.1％ 外用(15) 15.30±1.7435.1±8.6*ΔΔ與對照組比較，*P＜0.001；與甲氨蝶呤組比較，ΔP＜0.05 ΔΔP＜0.01C、對小鼠T淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響取NIH健康小鼠無菌操作取脾，用含5％小牛血清的Hank’s液，制成脾細胞懸液，經(jīng)2000r/min離心后，棄上清液，加入RPMI1640培養(yǎng)液離心洗滌3次，調(diào)細胞濃度至7×106/ml，鋪板加樣，設(shè)三復(fù)孔，每孔取脾細胞懸液100μl，再加入ConA及被試藥物，使每孔最終體積為200μl，受試藥物博寧霉素的濃度分別為1000、100、10、1、0.1、0.01、(μg/ml)，甲氨喋呤，濃度分別為100、10、1(μg/ml)，另設(shè)ConA對照組。置37℃孵箱孵育48小時，然后每孔加入噻唑藍10μl(5mg/ml)，繼續(xù)孵育4小時。小心吸去上清，每孔加入二甲基亞砜100μl，震蕩10分鐘后于570nm處測定OD值。以此反映T淋巴細胞的增殖程度(表3)。
上述試驗結(jié)果表明，博寧霉素?zé)o論腹腔注射，還是局部外用，對小鼠雌激素期陰道上皮的有絲分裂均有明顯的抑制作用。其抑制程度與藥物劑量和給藥方式密切相關(guān)，與已知在臨床上對銀屑病有顯著療效的甲氨蝶呤相比，局部外用兩者藥效相近。博寧霉素10mg/kg及5mg/kg腹腔注射連續(xù)15天，對小鼠尾部表皮顆粒層形成具有明顯的促進作用(P＜0.01)，局部用藥作用更強。而且兩種給藥途徑藥效均優(yōu)于甲氨蝶呤。此外，博寧霉素和甲氨蝶呤局部外用均顯示不同程度誘導(dǎo)顆粒細胞和棘細胞增生、使表皮增厚的作用。從表3看出，博寧霉素從1μg/ml～1000μg/ml對T淋巴細胞增殖的抑制作用依次遞增，呈現(xiàn)很好的量效關(guān)系。甲氨蝶呤是臨床上治療銀屑病的常用有效藥物。通過比較發(fā)現(xiàn)在100μg/ml濃度下，博寧霉素對T淋巴細胞增生的抑制作用明顯大于甲氨蝶呤。
表3.博寧霉素對小鼠T淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響組別 濃度(μg/ml) OD值X±SD P博寧霉素 1000 0.210.227±0.021P＜0.0010.220.251000.320.350±0.036P＜0.010.340.3910 0.590.580±0.036P＜0.050.540.611 0.900.770±0.125P＞0.050.760.650.10.550.607±0.055P＞0.050.610.660.01 0.590.637±0.050P＜0.050.690.63甲氨蝶呤 1000.490.503±0.023P＜0.010.490.5310 0.6 0.527±0.064P＜0.050.490.491 0.510.550±0.035P＜0.050.570.57ConA對照0.700.687±0.0150.690.67二、博寧霉素對銀屑病和脂溢性皮炎的療效觀察1、耐受性試驗1)、動物臨床健康雄性成年犬3條，購入后隔離飼養(yǎng)7天，于此間接種犬六聯(lián)疫苗。
2)、藥品博寧霉素注射劑，3mg/支，凍干品(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所研制提供)。
3)、方法博寧霉素注射劑，使用前以注射用水稀釋，作皮下注射，3條犬所用劑量分別為1mg/5kg、1mg/10kg、1mg/15kg體重。于給藥前和給藥后2、6、8小時分別測量犬的體溫和心率，并對受試動物的精神狀態(tài)、飲食欲及皮膚反應(yīng)進行觀察記錄結(jié)果(表4)表4博寧霉素注射劑對健康犬實驗結(jié)果單位T℃； P次/分犬名體重劑量 用藥前用藥后2h 用藥后6h 用藥后8h用藥前 用藥后 風(fēng)團、疹塊(kg)(mg/-kg) 等皮膚反應(yīng)T PT PT P T P食欲 欽欲 食欲 欽欲蘇聯(lián)紅 30.21/5 38.8 38 38.8 46 38.3 50 38.7 48 正常 正常 正常 正常無大白熊 25.81/1037.9 26 37.7 24 38.2 28 38.6 30 正常 正常 正常 正常無狼青31.01/1537.7 27 37.5 30 37.6 30 38.6 26 正常 正常 正常 正常無給藥后3條犬的精神狀態(tài)良好，飲食欲正常，體溫和心率的變化均在正常范圍內(nèi)，經(jīng)給藥后連續(xù)3天觀察，未發(fā)現(xiàn)任何過敏性反應(yīng)。
2、藥效學(xué)試驗1)、動物具有典型臨床癥狀的脂溢性皮炎病犬21條，平均年齡3.8歲(0.5歲-7.5歲)，平均體重6.8kg(2.1-27kg)。其中雄性7條，雌性14條?；加秀y屑病變?nèi)?條，雄性1條，雌性2條。以上21條犬在治療前均行皮膚取樣(于病變與健康皮膚交界處取樣，以刮出血為度)，對所取樣品進行涂片觀察和真菌培養(yǎng)，以排除蠕形螨、疥螨、虱、蚤等體外寄生蟲及皮膚真菌病。
2)、藥品博寧霉素注射劑，3mg/支，凍干品(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所研制提供)。注射前以注射用水稀釋，濃度為1mg/ml。
3)、方法按1mg/5kg體重的劑量給患犬皮下注射，隔日一次，5次為一療程。一療程無明顯改善者間隔3天進行第二療程。
4)、療效患犬臨床癥狀消失，皮損消退為治愈；患犬臨床癥狀明顯減輕，皮損消退50％以上為好轉(zhuǎn)；臨床癥狀及皮損未改變?yōu)闊o效(表5)。
表5博寧霉素注射劑對犬脂溢性皮炎及銀屑病病變的治療效果
以上結(jié)果表明，在第一療程中博寧霉素注射劑對犬脂溢性皮炎的治療效果比較明顯，在所有21個病例中，兩個療程總治愈率為57％(12/21)，總有效率為90.5％(19/21)，無效占9.5％(2/21)。對于銀屑病患犬，3條犬在第一療程后均表現(xiàn)好轉(zhuǎn)，在第二療程中1例痊愈，2例80％以上皮損消退，仍屬好轉(zhuǎn)。這些結(jié)果比以往采用激素療法和二十碳五烯酸治療效果提高20％左右(KralF，Schwartzman R M.Veterinary and comparative dermatology[M].J BLippincott Company，1964)，同時，對銀屑病變也有明顯的治療作用。發(fā)明效果由于博寧霉素毒性低，既可全身用藥，也可局部外用，全身用藥時對自身免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)無損害，對重要器官如心、肝、腎和肺部基本沒有影響，且無局部刺激作用，這是一般抗腫瘤藥所不具備的優(yōu)點。因此開發(fā)出博寧霉素在治療銀屑病(牛皮癬)和脂溢性皮炎等不明病因的疑難疾病中的新用途是可能的，其前景是良好的。
權(quán)利要求
1.博寧霉素在制備治療銀屑病和脂溢性皮炎藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于給藥方式可以是通過針劑注射內(nèi)用，也可以是皮膚患處涂藥外用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤抗生素博寧霉素在治療銀屑病及脂溢性皮炎中的新用途，動物模型試驗表明，該藥對小鼠激素期陰道上皮有絲分裂有明顯抑制作用，又促進小鼠尾表皮顆粒層形成，并對T淋巴細胞增生有明顯抑制作用；進一步的藥效學(xué)研究證明，博寧霉素不僅對銀屑病有效，而且對脂溢性皮炎取得更為滿意的結(jié)果，由于博寧霉素毒性較低，不損害機體免疫和造血功能，無局部刺激，有望開發(fā)出該藥在治療銀屑病、脂溢性皮炎等不明病因的疑難病中的新用途。
文檔編號A61P17/06GK1460519SQ0314137
公開日2003年12月10日 申請日期2003年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月6日
發(fā)明者許鴻章, 陳汝賢, 張瑞, 魯敏 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所