專利名稱：丙酮酸酯組合物和其在缺血和灌流后復(fù)蘇中的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景本發(fā)明涉及幾種新的丙酮酸酯類化合物，以及哺乳動(dòng)物，特別是人類在下述情況發(fā)生時(shí)、發(fā)生之前、或之后，用其復(fù)蘇及再生的方法(1)膜局部缺血、膜梗塞、或膜靜脈閉塞；(2)動(dòng)脈瘤修復(fù)、冠狀動(dòng)脈旁路、肢體動(dòng)脈閉塞手術(shù)；(3)出血性休克、穿透型和鈍器造成的外傷；(4)保存和移植器官。此處所定義的“局部缺血”是指通過血液供應(yīng)給器官或者器官部分的氧被阻斷。局部缺血的實(shí)例有(1)伴隨著冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈或者膜動(dòng)脈的某一分支被阻斷發(fā)生心肌缺血、腦缺血或者內(nèi)部梗塞；(2)移植前，器官的切除和保存。當(dāng)心肌梗塞時(shí)，及時(shí)恢復(fù)血流到缺血的心肌，也就是冠狀動(dòng)脈灌流是醫(yī)療處理的關(guān)鍵部分。這是因?yàn)椋劳雎手苯优c梗塞部位的大小(尸檢組織)相關(guān)，梗塞部位的大小直接與缺血的嚴(yán)重性和持續(xù)時(shí)間相關(guān)。雖然造成事情的原因是大量出血，導(dǎo)致喪失氧的供應(yīng)，不是防礙血液流動(dòng)，出血性休克的后果與這些局部缺血相同。
盡管需要給從正常血液供氧分離出的器官供給，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在恢復(fù)血流時(shí)可能發(fā)生灌流損害。這一后果源于產(chǎn)生活性的氧類(ROS)，如過氧化氫，氫氧根和過氧化物根，這些物質(zhì)即從細(xì)胞外也從細(xì)胞內(nèi)的資源產(chǎn)生。它們(ROS)是高度活性物質(zhì)，在正常條件下，通過內(nèi)生的防御機(jī)制被清除掉。但是，在局部缺血之后，氧化是重點(diǎn)的情況下，ROS和多種細(xì)胞成分反應(yīng)，產(chǎn)生酯類過氧化物，變性蛋白，組織間的基質(zhì)損害，其結(jié)果是增加了膜的滲透性并且釋放組織酶。
力圖在對局部缺血和休克的醫(yī)療處理中，盡量使不希望有的副作用減至最小，研究表明，在灌流過程中使用各種抗氧化劑。Banda等人(1996)和Kurose等人(1997)提出，使用產(chǎn)生ROS的抑制劑保護(hù)灌流心肌，使用藥劑和抑制劑減少ROS的水平。在類似的文獻(xiàn)里，希望提供更有效復(fù)蘇，研究表明，在灌流養(yǎng)生的過程，添加使用合并在一起的抗氧化劑和有利的代謝燃料。Salahudeen等人(1991)使用丙酮酸鹽溶液，一種ROS清除劑和一種對產(chǎn)生葡萄糖代謝重要的先兆燃料，去防止過氧化氫導(dǎo)致的急性腎衰竭。Cicalese等人(1996)發(fā)現(xiàn)，用內(nèi)魯米那丙酮酸鹽預(yù)處理改善了缺血后小腸的損傷。同時(shí)，Crestanello等人(1998)，Deboer等人(1993)，以及O’Donnell-Tormey等人(1987)實(shí)踐了這一發(fā)現(xiàn)，他們研究了經(jīng)歷局部缺血和模仿休克，灌流過程中內(nèi)源代謝分泌的丙酮酸鹽和外源代謝加入的材料兩者的改善效果，其后的器官功能以及組織標(biāo)本。Varma等人(1998)同樣證明，在一個(gè)培養(yǎng)鏡系統(tǒng)，培養(yǎng)鏡暴露到游離根氧化性中之后，丙酮酸鹽和其酯具有一定的細(xì)胞保護(hù)和復(fù)蘇效果。
在進(jìn)一步保護(hù)灌流的心臟組織方面，U.S.專利5075210并于此處作為文獻(xiàn)，其公開了對移植心臟的再灌流方法。該專利公開了一種心臟麻痹性溶液，溶液含有氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、氯化鎂、EDTA的鈉鹽、丙酮酸鈉和蛋白質(zhì)。
U.S.專利5294641并于此處作為文獻(xiàn)，該專利涉及使用丙酮酸鹽防止局部缺血的有害效果。丙酮酸鹽是在外科手術(shù)前給藥，提高病人心臟輸出和心臟跳動(dòng)的容積。丙酮酸鹽是以鈣鹽或者鈉鹽給藥。丙酮酸鹽可以成丙酮酸的一種胺，例如丙酮酸乙胺。類似的U.S.專利5508308也并于此處作為文獻(xiàn)，該專利公開了心肌梗塞之后，用丙酮酰甘氨酸治療灌流損傷。
U.S.專利4988515和5705210并于此處作為文獻(xiàn)，其在心臟麻痹性溶液和移植前心臟保護(hù)溶液中使用丙酮酸鹽。U.S.專利4970143并于此處作為文獻(xiàn)，該專利公開使用乙酰乙酸鹽保護(hù)活組織，包括在保護(hù)溶液中添加丙酮酸鹽。
U.S.專利5100677并于此處作為文獻(xiàn)，該專利公開多種非腸道溶液的組合物。其中有意義的是建議在靜脈注射溶液中包括丙酮酸根陰離子(顯然是從金屬鹽來的)。
U.S.專利5798388并于此處作為文獻(xiàn)，其進(jìn)一步敘述丙酮酸鹽和其多種復(fù)合衍生物的使用，例如多種酰氨用于處理空中感染的上下文中的ROS。該專利公開，一種共價(jià)鍵型連接的丙酮酰氨酸型丙酮酸鹽的化合物。通過使用這種形式的丙酮酸鹽釋放體系，避免了丙酮酸鹽的負(fù)面影響。但是，大量給予丙酮酸鹽的氨酸可以導(dǎo)致氮超負(fù)荷，病理上傷害病人的肝臟和/或腎臟。
在相同的上下文中，對丙酮酸鹽釋放基于同樣的合理性，U.S.專利5876916涉及使用丙酮酸硫羥酸酯和多羥基酯，治療和預(yù)防局部缺血后的灌流損傷，糖尿效應(yīng)，膽固醇高，器官損傷，乙醇中毒，或者作為食物。另外，U.S.專利5633285；5648380；5652274；和5658957都并于此處作為文獻(xiàn)，這些專利公開了多種組合物，鹽類，藥材和丙酮酸鹽衍生物，所述丙酮酸鹽衍生物與其它抗氧化劑、脂肪酸混合成作為抗感染和免疫促進(jìn)傷害愈合組合物。但是，大量使用復(fù)合丙酮酸根氨酸和其它藥品的衍生物，就需要在其釋放出抗氧化作用之前酶促水解，這可導(dǎo)致氮和/或其它異生物性超負(fù)荷，其可能導(dǎo)致直接傷害患者，破壞正常的解毒過程，或者通過生命本身限定副產(chǎn)物引起中毒。
盡管作為灌流溶液的有效成分或者其它多種應(yīng)用，丙酮酸是可接受的，但是，丙酮酸是強(qiáng)酸而且不穩(wěn)定，它不能以自身的形式直接輸液。眾所周知，丙酮酸和其鹽在生理上可接受范圍內(nèi)、各種PH值的溶液中，形成兩種形式，水合物和二聚物(para-pyruvate)，二者中沒有一種能作為抗氧化劑和ROS反應(yīng)；并且這兩者在丙酮酸的應(yīng)用中都是著名、作為代謝燃料的抑制劑，由此，按照上述現(xiàn)有技術(shù)從使用丙酮酸，自然可以得到的任何有利效果都不存在。
另外，已經(jīng)公認(rèn)，傳統(tǒng)藥理的丙酮酸化合物，例如丙酮酸的鹽，生理上并不適合；例如，這些化合物導(dǎo)致患者的體液大量積累高濃度的陽離子(鈣離子患或鈉離子)。同樣，包含丙酮酸根的氨酸類化合物能夠?qū)е碌?fù)荷。有人建議注射丙酮酸甘氨酸，其中的氨官能團(tuán)有可能在血漿和/組織中水解，然后釋放出丙酮酸。
但是，要使血漿中丙酮酸的濃度達(dá)到1MM就需要注射高濃度丙酮酸甘氨酸，這樣的甘氨酸可以導(dǎo)致患者受損，病理上損傷肝臟和/或腎臟。另外，帶甘氨酸的血漿流可能干擾輸送某些氨酸穿過血腦屏障。因此，這些適合保護(hù)器官的丙酮酸化合物，并不太適合治療活生生的器官；并且已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，需要提供在生理上更合適的丙酮酸釋放化合物。
也已經(jīng)公認(rèn)，需要提供價(jià)值有效、簡單易行、沒有污染機(jī)會(huì)的丙酮酸釋放系統(tǒng)，其條件因素有(1)生命本身的限制；(2)配方的復(fù)雜性；(3)反應(yīng)性、以及與賦型劑和其它配方原料的共反應(yīng)性；(4)在運(yùn)輸、改變位置、以及吸收到組織的期間內(nèi)不利的生化反應(yīng)性；(5)對利用酰氨酶和/或肽酶經(jīng)歷酶促水解的代謝活性的要求。因此，希望能夠提供出另一種生理上合適的藥用丙酮酸化合物。
本發(fā)明的概述本發(fā)明提供一種新穎的、改進(jìn)的、易接受的、為前文所述目的使用的組合物。一方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其中含有2-酮鏈烷酸的烷基、芳烷基、烷氧烷基、或羧烷基酯；以及在生理PH值條件下，誘導(dǎo)和穩(wěn)定所述酯的烯醇中介形式的組分。本發(fā)明的組合物還含有藥用可接受的載體，且在該載體中，在生理PH值條件下所述酯的烯醇中介形式是穩(wěn)定的。
可取的、本發(fā)明組合物中的酯是2-酮丙酸(丙酮酸)烷基酯，更可取的是其乙酯；穩(wěn)定組分是陽離子原料，可取的是二價(jià)陽離子，更可取的是鈣或者鎂離子。本發(fā)明的組合物中藥用可接受的載體是公認(rèn)對哺乳動(dòng)物安全的、便于給藥的治療劑的任何載體；例如注射緩沖溶液，口服片劑或膠囊，便于現(xiàn)場釋放的微膠囊或脂質(zhì)體。可取的緩沖溶液是等滲或高滲生理鹽水；或者碳酸氫鈉、磷酸鹽、血漿擴(kuò)展劑、微膠體或微晶體溶液。具體可取的是補(bǔ)充鉀離子的等滲生理鹽水，林格(Ringer)溶液。具體可取的、本發(fā)明的組合物含有丙酮酸乙酯，其與PH值7～8的林格溶液中的鈣離子混合。
在另一方面，本發(fā)明組合物中2-酮鏈烷酸酯化合物中酯的部分選自乙基、丙基、丁基、羧甲基、乙酰氧基甲基、乙酯基甲基和乙氧基甲基酯。2-酮鏈烷酸部分選自2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮-3-甲基丁酸、2-酮-4-甲基戊酸和2-酮己酸。
另一方面，本發(fā)明涉及對受傷者、與局部缺血或多次灌流相關(guān)紊亂或者狀態(tài)醫(yī)療處理的方法。含有本發(fā)明新組合物的配方許可成功地使用2-酮鏈烷酸酯，如丙酮酸酯，醫(yī)療處理局部缺血；休克；器官復(fù)活；復(fù)蘇；以及其它被認(rèn)為丙酮酸治療有效，且能給予充足高負(fù)荷的丙酮酸，不會(huì)中毒的情況。使用本發(fā)明的組合物可以直接替代傳統(tǒng)的乳酸林格溶液，只需簡單地添加共活性成分或者復(fù)合賦型劑，例如這些包含多種化合物或者丙酮酸本身的分子衍生物的成分。本發(fā)明的組合物也適用于保護(hù)從活哺乳動(dòng)物分離的器官部分、器官或肢體的過程，其需要保存后，移植到器官受體。這一過程為本技術(shù)領(lǐng)域公知，如U.S.專利5066578中所述，該專利并于此處作為文獻(xiàn)。
實(shí)施本發(fā)明的方法另一好處是，配方中的活性2-酮鏈烷酸組分是生化上安全、容易水解的酯，它通過擴(kuò)散過程穿過膜能夠被組織和細(xì)胞吸收，這是因?yàn)樗鲺ケ认鄳?yīng)的鹽有較大的親脂性，同時(shí)又保留了細(xì)胞內(nèi)被水解的能力，其水解是通過非特定酯酶，和/或非特定的、有機(jī)酸或堿催化的邊界堿性溶劑解，例如生理PH值條件下的氨基酸剩余物催化。
更重要的是，本發(fā)明方法提供的2-酮鏈烷酸，就是丙酮酸以穩(wěn)定的酯的形式存在，其不活潑地、通過多于一種的反應(yīng)機(jī)制與氧反應(yīng)，并且其反應(yīng)產(chǎn)物與活潑的、高氧化性氧，如過氧化氫反應(yīng)，提供可降解產(chǎn)物，該可降解產(chǎn)物自己就是代謝燃料，頂替了有害的排泄產(chǎn)物或者代謝產(chǎn)物。
本發(fā)明附圖的簡要說明結(jié)合附圖，從下述實(shí)施方案的詳細(xì)說明和權(quán)利要求書中，會(huì)明顯看到本發(fā)明的其它特征和先進(jìn)之處。附圖中
圖1表明本發(fā)明組合物中可取的2-酮鏈烷酸酯的結(jié)構(gòu)。
圖2表明本發(fā)明組合物中某可取酯的結(jié)構(gòu)、其烯醇中介結(jié)構(gòu)和某先有技術(shù)化合物結(jié)構(gòu)。
圖3表明按本發(fā)明的方法用于計(jì)量粘膜-到-血漿腸內(nèi)部滲透性的系統(tǒng)和數(shù)據(jù)。
圖4表明本發(fā)明的組合物相對對照組合物得到的腸內(nèi)部滲透性。
圖5表明本發(fā)明的組合物對粘膜創(chuàng)傷記錄得到的結(jié)果。
本發(fā)明的詳細(xì)敘述本發(fā)明的主要目的是提供新穎的、改進(jìn)的、含有2-酮鏈烷酸酯的組合物和使用該組合物醫(yī)療處理上述情況的方法。
為達(dá)到上述目的并且根據(jù)本發(fā)明的目的，如本文具體和廣泛所述，本發(fā)明的一種新穎組合物含有與附圖1所表示的分子結(jié)構(gòu)相一致的2-酮鏈烷酸酯，其與足夠濃度、生理安全的有機(jī)或無機(jī)陽離子混合，所述陽離子在生理PH值條件下能夠引導(dǎo)所述酯中的2-酮官能度烯醇化。在一可取的實(shí)施方案中，組合物含有2-酮丙酸(丙酮酸)的烷基酯，該酯是乙酯的類似物，陽離子是二價(jià)陽離子，具體上講不是鈣離子就是鎂離子。在一更可取的、本發(fā)明組合物的配方中，酯是丙酮酸乙酯，它PH值約在7～8的林格溶液中與鈣離子混合。
本發(fā)明的醫(yī)療組合物的給藥方式可以是口服、局部給藥或者非腸道給藥，例如鼻內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈、腔內(nèi)、動(dòng)脈、陰道、尿道或者直腸給藥，在藥用可接受的惰性載體中通過常規(guī)方法給藥。舉例來說，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以在持續(xù)釋放的配方中給藥，這樣的配方可使用可生物降解、生物學(xué)上匹配的聚合物；或者通過使用微胞、微膠囊、脂質(zhì)微?，F(xiàn)場釋放；或者使用緩沖溶液。本發(fā)明的組合物中的活性物質(zhì)-酯，可以作為注射液給藥，例如，在本文所述的緩沖溶液中，濃度范圍在20～200MM，藥用比率為每小時(shí)每千克體重10～100毫克。在大藥丸的形式，活性物質(zhì)-酯可以按每千克體重10～200毫克的量、每天1～4次給藥。本發(fā)明組合物中的陽離子是在適當(dāng)?shù)臐舛?，該濃度?dǎo)致藥用組合物中活性物質(zhì)-酯數(shù)量的2-酮的官能度烯醇化。合適的給藥劑量及模式很容易按照常規(guī)的手冊確定。
可以相信，當(dāng)從輸送的酯中，例如通過復(fù)蘇灌流輸送，丙酮酸和其它2-酮鏈烷酸釋放出來，其所起的作用類似NADH俘獲井，和對灌流產(chǎn)生的ROS俘獲井。在第一時(shí)間，2-酮鏈烷酸反應(yīng)，提供乳酸根，氧化過剩的NADH，由此防止了由于缺氧引起生理上受損期間產(chǎn)生的“還原壓力”。在其后的時(shí)間，如先有技術(shù)所證明，2-酮鏈烷酸與高價(jià)氧反應(yīng)，生成很快分解的過渡性過酸，最后成乙酸根和二氧化碳。得到的乙酸根是無用產(chǎn)物，通過再進(jìn)入到乙酰COA庫，通過三羧酸(Krebs)循環(huán)或糖異生作用，其被生化收獲而獲救。
對本發(fā)明的目的更有意義的是，由于機(jī)制不同，也就是，通過烯醇亞甲基的形式與高價(jià)氧反應(yīng)，2-酮鏈烷酸酯本身的作用就是抗氧化劑。聯(lián)系到整個(gè)過程，ROS是一層薄膜，這是因?yàn)楦邇r(jià)氧是在通過微顆體或者線狀微粒中的色素細(xì)胞介導(dǎo)的氧化還原串中產(chǎn)生的。它也是細(xì)胞內(nèi)的過程，只發(fā)生在親脂環(huán)境中且不在胞液中，而2-酮鏈烷酸酯的熱力學(xué)性質(zhì)是在親脂相反應(yīng)活性趨向氧化還原反應(yīng)，且通過陽離子介導(dǎo)酮-烯醇平衡是公認(rèn)的有利因素。對丙酮酸乙酯，從開始起的半經(jīng)驗(yàn)的熱力學(xué)分析，作為代表性的鈣離子存在條件下烯醇化分子，在下述實(shí)例1的部分詳細(xì)討論。
例如，使用丙酮酸作為示范性的2-酮鏈烷酸，形成瞬間存在的環(huán)氧化物，其隨后重排成相應(yīng)的3-碳原子水合的丙酮酸酯，其機(jī)理相同于在中介代謝中形成3-羥基-丙酮酸的機(jī)理，以及碳加到磷酸烯醇丙酮酸同類物上的機(jī)理。水合到酮基的alpha位上同樣也被認(rèn)為是類固醇代謝中以及藥物的微粒體水合中色素細(xì)胞介導(dǎo)的過程。產(chǎn)生的羥基-丙酮酸按照進(jìn)程，當(dāng)被溶劑解成羧酸陰離子時(shí)，能夠再次和高價(jià)氧反應(yīng)提供羥基乙酸(乙醇酸)，凈結(jié)果是丙酮酸酯能夠最終消滅二個(gè)摩爾當(dāng)量的ROS，而丙酮酸受熱力學(xué)限制只能消滅一個(gè)。如上文所述，不是丙酮酸酯的2-酮鏈烷酸酯也適合本發(fā)明組合物使用，只要是活性化合物，如上文對丙酮酸酯所述，可新陳代謝。
提供下述實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的先進(jìn)性，幫助普通技術(shù)人員制備和使用本發(fā)明。這些實(shí)例對公開的范圍并不構(gòu)成限制。
實(shí)例1丙酮酸酯的熱力學(xué)模型半經(jīng)驗(yàn)的量子化學(xué)允許比較式地估價(jià)各種丙酮酸類似物的性質(zhì)，該性質(zhì)決定了每個(gè)分子的反應(yīng)活性。由于人能夠注意到丙酮酸乙酯和丙酮酸鈉之間，作為抗氧化劑時(shí)生化效果的明顯差別，所以想到，這兩種分子在熱力學(xué)上不同，且能夠驗(yàn)證，驗(yàn)證通過Huckel分子軌跡分析(HMO)，再通過全忽略差別重疊分析(CNDO)，使用分子模型(Pro/MOPAC)軟件(ChemS W，Inc.Fairfield，CA)。對附圖2表示的結(jié)構(gòu)得到下述結(jié)果，在其一致性確定之后，選定的一致構(gòu)型能量最低。
表1熱力學(xué)性質(zhì)比較
盡管其差別都落在一個(gè)數(shù)量級內(nèi)，由于傾向能量最低，能量越低，越穩(wěn)定的構(gòu)型是涉及丙酮酸酯的構(gòu)型。在另一方面，酯表現(xiàn)出明顯較低的偶極矩，反應(yīng)出其相對較弱的離子化和離解的傾向，這一事實(shí)進(jìn)一步得到其有較高的Log P值的支持，LogP值代表相對親脂性。另外，所述的酯是較弱的氫鍵受體，較好的氫鍵供體，這與它的偶極矩和親脂性相一致。
這樣，在初始的熱力學(xué)基礎(chǔ)上，能夠預(yù)言，丙酮酸乙酯和其公認(rèn)的烯醇互變異構(gòu)體更容易在有極性的水相和酯相之間分離，同時(shí)保持與丙酮酸鈉鹽的秩序相同的一致穩(wěn)定性。還要注意到，與丙酮酸本身相比，帶二價(jià)陽離子(如鈣離子)的等同丙酮酸的烯醇化酯的復(fù)合物，如附圖2結(jié)構(gòu)6所示，在性質(zhì)上起了最顯著的改變，由此證實(shí)，使用這些陽離子-烯醇化-酯能夠作為丙酮酸碳骨架構(gòu)造的、還沒有開發(fā)利用的反應(yīng)活性的促進(jìn)劑。
實(shí)例2丙酮酸酯的反應(yīng)活性模型檢索化學(xué)文摘(Chemical Abstract)和ISIS資料(NDLInformation Systems，Inc.)，得到關(guān)于丙酮酸和其烯醇化物反應(yīng)活性的實(shí)例。在有機(jī)和生物化學(xué)的文獻(xiàn)中，記錄著很多丙酮酸鹽的反應(yīng)實(shí)例，但是，沒有丙酮酸酯和高價(jià)氧之間的分子相互反應(yīng)的實(shí)例報(bào)道。在生理PH值條件下，丙酮酸的主要反應(yīng)是形成水合物(附圖2中結(jié)構(gòu)2)和二聚合成對-丙酮酸(附圖2中結(jié)構(gòu)7)。
如(Margolis)等人于1986年報(bào)道，濃度1摩爾/升或者低于此濃度的丙酮酸鈉形成不同數(shù)量的水合物和線形二聚物，4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸。水合物能夠達(dá)到6～10％，二聚物達(dá)到20～25％，保持48小時(shí)。在評價(jià)含有丙酮酸鈉的注射液和灌流液時(shí)，這一反應(yīng)活性模式是要重點(diǎn)考慮，這是因?yàn)椋衔锱c高價(jià)氧不反應(yīng)，二聚物是2-酮戊二酸脫氫酶、線粒體呼吸酶的抑制劑，同樣也是谷氨酸轉(zhuǎn)胺酶和乳酸脫氫酶的抑制劑。與之相應(yīng)，在化學(xué)文獻(xiàn)中，即沒有丙酮酸酯形成水合物，也沒有其二聚合的報(bào)道。
熱力學(xué)原理上，丙酮酸的烯醇形式是穩(wěn)定的，但是在水性介質(zhì)中對其存在不利，測量其烯醇化的半衰期只有3～5秒(Kuoet al.1979)。為了降低溶劑的極性，作為例證，使用二甲基亞砜或二甲基甲酰氨提供溶劑環(huán)境，所述烯醇化物的半衰期至少增加兩個(gè)數(shù)量級(Chiang et al.1993；Peliska et al 1991；Sawyer et al.1983)。
關(guān)于對高價(jià)氧的反應(yīng)活性，丙酮酸鹽和丙酮酸酯兩者都反應(yīng)，在羰基的位置形成過氧化氫中介體，接著不按比例地重排成乙酸和二氧化碳，或者帶乙氧基的有機(jī)酸，其再經(jīng)歷水溶劑解成二氧化碳和乙醇(Constantopoulos et al.1984；Sawyer etal.1983；Starostin et al.1980)。
但是，通過另一種機(jī)理，烯醇化的丙酮酸也能夠反應(yīng)，這要涉及添加額外的亞甲基，類似烯醇化丙酮酸在3-碳上碳溴化的情況(Sekine et al.1980)；螯合作用控制對烯丙基化合物的添加(Muderawan et al.1998)；并且，生化添加二氧化碳，通過磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，形成草酰乙酸或丁酮二酸(Ausenhuset al.1992)?？偟膩碚f，如已經(jīng)通過D-環(huán)乙酰類固醇所證實(shí)，生化酮的烯醇通過細(xì)胞色素P-450氧化酶體系與活性氧反應(yīng)，通過瞬時(shí)的外亞甲基環(huán)氧中介物得到羥基酮(Yamazaki et al.1997)。
在根據(jù)熱力學(xué)可能性和化學(xué)先例的理由評估時(shí)，通過REACCS軟件數(shù)據(jù)庫相關(guān)系統(tǒng)，可以預(yù)言，丙酮酸鹽與高價(jià)氧反應(yīng)只能提供脫羧作用，生成乙酸根和二氧化碳。與之對映，對丙酮酸酯可望提供的不僅是脫羧產(chǎn)物-乙酸根和乙醇，而是還有3-碳上的羥基化加成物，最可能的是3-羥基丙酮酸。其能夠繼續(xù)和高價(jià)氧反應(yīng)產(chǎn)生羥基乙酸和二氧化碳(Perera et al.1997)，由此消耗二個(gè)摩爾當(dāng)量的氧化劑。
實(shí)例3溶液中丙酮酸酯的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性基于上述模型的訓(xùn)練，下述猜想促使實(shí)驗(yàn)提供化學(xué)和生物體系中的證據(jù)，進(jìn)一步區(qū)別本發(fā)明的方法和現(xiàn)有技術(shù)。
在鈣鹽存在(林格溶液)的條件下，丙酮酸酯比丙酮酸鹽能提供更穩(wěn)定水基溶液，這一現(xiàn)象可以推廣到附圖1所示的其它丙酮酸類似物的研究中，對每摩爾當(dāng)量的丙酮酸類似物，至少含有0.2摩爾當(dāng)量鈣的林格溶液中溶解所述類似物，再用氫氧化鈉或者其它適用的無機(jī)堿滴定到PH值在生理允許范圍。這樣的丙酮酸化的林格溶液的實(shí)施方案用于NMR，穩(wěn)定性和其后的生物研究，示于表2。可以理解，即時(shí)實(shí)例中的丙酮酸類似物，可以被任何附圖1所示的類似物、在任何濃度替代，只有能提供均勻的溶液，或者為了比較，被對照物替代，例如丙酮酸，乳酸(就象乳酸林格溶液)以及其它參照物和惰性酮酸類似物。鈣離子也可以被替代，如用鎂離子或者任何其它生理安全的陽離子替代，只有它能夠替代鈣離子而且在水溶液中與烯醇化的丙酮酸酯穩(wěn)定形成過渡性的等同復(fù)合物。
表2丙酮酸化的林格溶液的成分
下述程序建議用于分析(Margolis et al.1986)，涉及到掃描時(shí)機(jī)和400MHz的頻率，光譜儀在脈沖(Fourier)輸送的模式操作；在可烯醇化的碳原子處，對每個(gè)碳和質(zhì)子串，碳和質(zhì)子兩者在特征性諧振上的改變進(jìn)行監(jiān)視作為時(shí)間的函數(shù)，由此說明，在林格溶液中較大比例丙酮酸酯表現(xiàn)出傾向烯醇化，特別是其中含有鈣離子或者鎂離子；與此同時(shí)，在相同條件下，丙酮酸陰離子表現(xiàn)出傾向水合和二聚合。另外，還周期計(jì)量了這些溶液對紫外光吸收，頻率范圍在230～260nm和300～340nm，其在烯醇形成中的改變是明顯的，由此提供肯定性的證據(jù)，去區(qū)分丙酮酸酯類似物與各種現(xiàn)有技術(shù)的方法使用的丙酮酸鹽相比在溶劑化性質(zhì)上的差別。
為確立本發(fā)明中的丙酮酸衍生物被更好使用，實(shí)驗(yàn)序列沿著與上述比較光譜實(shí)驗(yàn)相同的線索進(jìn)行。用于說明烯醇化和相應(yīng)現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的相同溶液，也用于基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的比較，數(shù)據(jù)源于，在特征性的丙酮酸諧振消失時(shí)，以及初始實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的乙酸根和其它降解物出現(xiàn)時(shí)，每個(gè)入選丙酮酸對氧化劑的作用，作為暴露給這些氧化劑的函數(shù)。
例如，1毫摩爾的丙酮酸溶液和丙酮酸酯溶液表現(xiàn)出平均吸收值，經(jīng)過空白修正，在沒有鈣離子存在和PH值7.2時(shí)，對230～260nm的光分別是0.15和0.2；添加進(jìn)鈣離子對丙酮酸幾乎沒有作用，其吸收值僅增加到0.16，與之對映，丙酮酸乙酯的增加到二倍，達(dá)0.41，在三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，其變動(dòng)系數(shù)小于15％。當(dāng)按相同方法在300～340nm實(shí)驗(yàn)濃度為28毫摩爾的溶液時(shí)，值為0,03的鈣離子添加之前和之后，丙酮酸的吸收都保持不變，與之對應(yīng)的丙酮酸乙酯溶液對肉眼變成明顯的稻草色，吸收值從0.07上升到0.85。變成黃色和在紫外區(qū)分光光度計(jì)吸收的增加證實(shí)形成1，3-共軛酮系統(tǒng)，正是在該條件下從丙酮酸乙酯烯醇化會(huì)得到的結(jié)果，這樣的條件不會(huì)使丙酮酸烯醇化。
使用已知氧化還原電位是ROS的模型的高價(jià)氧模擬物，例如過氧化氫、Fenton試劑和間位氯過苯甲酸，分配到濃度范圍1～50毫摩爾的實(shí)驗(yàn)溶液中，然后監(jiān)視其降解的效果。結(jié)果證明，丙酮酸酯與其同種的游離酸類似物相比，每摩爾當(dāng)量更大比例的氧化劑。
實(shí)例4組織培養(yǎng)中丙酮酸酯的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性丙酮酸酯，特別是丙酮酸乙酯，在鈣離子存在條件下是足夠親脂的，在為細(xì)胞預(yù)備的灌流液中其被細(xì)胞吸收的速度比等摩爾量的丙酮酸快得多。另外，本發(fā)明的化合物作為胞內(nèi)輸送丙酮酸的潛藥，部分用作抗氧化劑，胞內(nèi)輸送的丙酮酸部分被直接脫羧，非特定酯被羧酸酯酶溶劑解之后，成為生化可利用的。胞內(nèi)水解之前，這些丙酮酸酯也進(jìn)行有利的反應(yīng)，經(jīng)過中間烯醇化、高價(jià)氧和相關(guān)有毒氧化劑造成的瞬時(shí)環(huán)氧化，形成3-羥基丙酮酸。
特別是附圖1所示的丙酮酸乙酯和其類似物的情況下，得到的羥基丙酮酸酯接著被吸收，通過回補(bǔ)摻入作為代謝燃料，溶劑解之后，或者利用另一當(dāng)量反應(yīng)性氧進(jìn)一步經(jīng)歷脫羧氧化反應(yīng)之后，形成相應(yīng)的羥基乙酸。由此，可以理解，與對映的、沒有酯化、沒有烯醇化的酮酸陰離子消耗反應(yīng)性氧的量相比，丙酮酸酯能夠消耗其兩倍的反應(yīng)性氧；就是，第一倍，通過形成3-羥基丙酮酸酯，然后，通過其后的脫羧降解，成為較小的可代謝物，其類似乙酸很容易摻入中間代謝過程。在這些生物化學(xué)產(chǎn)出物中，可證明本發(fā)明的化合物在暴露給ROS之后，是更有效的抗氧化劑，同樣也是代謝燃料；這些生物化學(xué)產(chǎn)出物是通過下述手段論證，聯(lián)合使用NMR和光譜(UV)分析程序，例如，在各種實(shí)驗(yàn)條件下，跟蹤穩(wěn)定同位素標(biāo)記的丙酮酸中3-位碳原子(3-13C)的歷程。
另外，細(xì)胞和組織培養(yǎng)提出有效的手段，用于比較分配到培養(yǎng)基或灌流介質(zhì)中的丙酮酸類似物的吸收和其后分布的相對速率，通過適合質(zhì)子和碳原子及時(shí)磁共振分析的穩(wěn)定同位素示蹤法，或者質(zhì)譜分析經(jīng)過適期培養(yǎng)或灌流后、實(shí)驗(yàn)生物體抽提液的方法，監(jiān)視其摻入細(xì)胞。
特別是，腸缺血是較重的危害狀態(tài)之一，都知道提供丙酮酸使其復(fù)蘇、挽救，使用進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)基提供了適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?。該模式包括，在?jīng)歷缺氧和過氧的各種條件的基本周期后，進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)基暴露給含有林格溶液的灌流液，為了對比，其中補(bǔ)充了鈣；然后，暴露給包括丙酮酸鈉的各種實(shí)驗(yàn)丙酮酸組合物，所有的3-位碳原子用13C標(biāo)記。為進(jìn)行碳原子的MR實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞接種在有蓋培養(yǎng)皿中的聚苯乙烯微載體表面，收獲進(jìn)行光譜分析之前，生長3天容其布滿，然后，按照(Artemov)等人1998年的方法，(Yu)等人1997年和(Vogt)等人1997年的模型成例。為了從獲得的(Krebs循環(huán))碳共振特征減去背景作用，在研究過程中也要監(jiān)視實(shí)驗(yàn)灌流液。
這樣，就能夠在直到其轉(zhuǎn)變成檸檬酸和酮二戊酸/谷氨酸的整個(gè)過程，跟蹤外加到丙酮酸上的碳原子的流動(dòng)速率。預(yù)期，丙酮酸的3-位碳原子和從其衍生出的乙酸的2-位碳原子，在檸檬酸和酮二戊酸的2-位對4-位處有不同的富集。丙酮酸碳骨架直接摻入到檸檬酸和酮二戊酸應(yīng)表現(xiàn)為，標(biāo)記碳原子在2-位處比4-位處較快增加，這是因?yàn)楹笠惶幐菀妆惠^大量的乙酸-乙酰-CoA庫稀釋。
如果在反應(yīng)中形成羥基丙酮酸，不但能夠直接檢測出甲基基團(tuán)共振，而且也能夠追蹤出，之后的羥基丙酮酸經(jīng)歷脫羧成二羥乙酸再均化成蘋果酸而得到利用，這都使用同一方案分別標(biāo)記分析法。這些本質(zhì)性的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，就碳資源而論，丙酮酸酯與丙酮酸鹽進(jìn)行不同的反應(yīng)。另外，這些實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，乳酸、乙酰乙酸和其相應(yīng)的酯替代丙酮酸酯時(shí)，不烯醇化、不摻入細(xì)胞，但是其經(jīng)歷氧化性代謝的方式與本發(fā)明方法所使用的丙酮酸酯及擴(kuò)展物相同。
實(shí)例5在局部缺血挽救中本發(fā)明的應(yīng)用在本說明性實(shí)驗(yàn)中使用高位腸系膜動(dòng)脈閉塞的模型鼠，用其說明，含有丙酮酸乙酯的林格溶液，在局部缺血、多次灌流粘膜損傷和閉塞性紊亂中，作為復(fù)蘇流體的效果。模型序列和計(jì)算數(shù)據(jù)在附圖3中說明。
使用腹腔內(nèi)開他敏和戊巴比妥導(dǎo)致全麻醉后，雄性(Sprague-Dawley)250～350克的鼠經(jīng)歷60分鐘高位腸膜動(dòng)脈閉塞，接著60分鐘灌流。通過右頸動(dòng)脈導(dǎo)管測量心率和平均動(dòng)脈血壓。左側(cè)內(nèi)頸靜脈插導(dǎo)管靜脈內(nèi)注射。
對照鼠(n＝6)接受乳酸林格溶液(乳酸28mM，111.5ml/kg/hr注射液，局部缺血前1.5ml/kg大丸劑，多次灌流前3.0ml/kg大丸劑)。實(shí)驗(yàn)群(每組n＝6)接受相同體積(3ml)丙酮酸鈉鹽(28mM)，或者丙酮酸乙酯(28mM)，都是按本發(fā)明的方法配制，如表2所示，劑量都相當(dāng)于10mg/kg/hr。使用外翻腸液囊技術(shù)，如前文提到(Wattanasirichaigoon)等人1999年文獻(xiàn)中所述，評價(jià)小腸內(nèi)粘膜-到-血漿之間FITC-代血漿(mw＝4KDA)的滲透性(CMS，nl/min/cm2)。在初始基準(zhǔn)，30分鐘和60分鐘局部缺血后(I30和I60)，和多次灌流的30分鐘和60分鐘后(R30和R60)分別測量滲透性。為了絨毛狀的高度(VH，微米)和粘膜厚度(MT，微米)，對初始基準(zhǔn)、I60和R60的試樣進(jìn)行評價(jià)。粘膜損傷的程度按照(Chiu)等人1970年文獻(xiàn)中所述的方法確定，結(jié)果如下表3所示
表3粘膜損傷等級
按照平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差的方式綜合數(shù)據(jù)。使用學(xué)生實(shí)驗(yàn)的方法確定差別的意義。當(dāng)P小于0.05時(shí)，差別才有意義。
使用本發(fā)明的方法的這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，丙酮酸的游離酸和丙酮酸乙酯的組合物兩者都有效地降低了多次灌流期間粘膜的滲透性，如附圖4所示。酯的組合物顯示出有實(shí)際意義的較早地和較大地起細(xì)胞保護(hù)作用，由滲透范圍增加判斷出來，其是不可逆轉(zhuǎn)的組織損傷的信號(hào)，有意義地減小了粘膜損傷的后果，該項(xiàng)圖示于附圖5。另外，丙酮酸乙酯在局部缺血和多次灌流期間，還有效保持了絨毛的高度和粘膜的厚度(P小于0.01)，如表4所示。
表4丙酮酸林格溶液有利效果中組織學(xué)的發(fā)現(xiàn)
注意乳酸對丙酮酸和丙酮酸對丙酮酸酯P小于0.05和P小于0.01總體看來，這些發(fā)現(xiàn)確認(rèn)，在組合物中本發(fā)明方法中的丙酮酸酯的功效，所述組合物用于處理局部缺血和由于缺氧引起的相關(guān)狀態(tài)，以及其后多次灌流所伴隨的反應(yīng)性氧的危害。上述模型系統(tǒng)，高位腸系膜動(dòng)脈閉塞的鼠模型，是一般技術(shù)人員所熟悉的標(biāo)準(zhǔn)模型系統(tǒng)，技術(shù)人員也希望對上述種類情況提供醫(yī)療處理，以上報(bào)告中的結(jié)果很容易推廣到人類使用。
顯然，根據(jù)本發(fā)明此處提供出，新穎的2-酮鏈烷酸酯類化合物和其組合物，以及處理缺氧損傷后多次灌流導(dǎo)致高價(jià)氧化劑的有害影響的方法，其充分滿足前文所述的對象、目的和利益。
雖然結(jié)合具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但根據(jù)在前述文字，很多替換、修整和變化對本領(lǐng)域的技術(shù)人員都是顯而易見的。因此，本發(fā)明涉及所有這些替換、修正和變化，都落入所附權(quán)利要求書的精神和形式范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種組合物包含，藥用可接受載體中的2-酮鏈烷酸的烷基、芳烷基、烷氧烷基、或羧烷基酯，所述載體包含在生理PH值下誘導(dǎo)和穩(wěn)定所述酯的2-酮官能度烯醇化的生物學(xué)安全成分，其中在所述載體中，所述酯的2-酮官能度的烯醇形式在生理PH值下是穩(wěn)定的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其中所述誘導(dǎo)和穩(wěn)定所述酯的2-酮官能度烯醇化的成分是無機(jī)二價(jià)陽離子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述組合物，其中所述二價(jià)陽離子是鈣離子或者鎂離子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其中所述酯的2-酮鏈烷酸部分是2-酮丙酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其中所述2-酮鏈烷酸酯是乙酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述組合物，其中所述2-酮鏈烷酸酯是丙酮酸乙酯，所述二價(jià)陽離子是鈣離子，所述藥用可接受載體是PH值7～8的林格溶液。
7.一種給哺乳動(dòng)物服用治療上有效的化合物的方法，該方法包括腔內(nèi)或靜脈內(nèi)給所述哺乳動(dòng)物服用治療上有效劑量的組合物，該組合物包含藥用可接受載體中的2-酮鏈烷酸的烷基、芳烷基、烷氧烷基、或羧烷基酯，所述載體包含生物學(xué)安全、在生理PH值下誘導(dǎo)和穩(wěn)定所述酯的2-酮官能度烯醇化的成分，其中所述酯對所述哺乳動(dòng)物是醫(yī)療學(xué)的抗氧化劑和細(xì)胞內(nèi)的燃料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其中所述藥用可接受載體是補(bǔ)充鉀離子的等張鹽水林格溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其中所述2-酮鏈烷酸酯選自丙酮酸乙酯、丙酮酸丙酯、丙酮酸丁酯、丙酮酸羧甲酯、丙酮酸乙酰氧基甲酯、丙酮酸乙酯基甲酯和丙酮酸乙氧基甲基酯。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其中所述2-酮鏈烷酸酯選自2-酮丁酸乙酯、2-酮戊酸乙酯、2-酮-3-甲基丁酸乙酯、2-酮-4-甲基戊酸乙酯和2-酮己酸乙酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其中所述2-酮鏈烷酸酯是摻合在鹽水溶液中，所述溶液含有鈣離子或者鎂離子。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其中所述2-酮鏈烷酸酯是摻合在鹽水溶液中，所述溶液含有鈣離子或者鎂離子。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其中所述組合物服用用來治療腸系腸系膜缺血、腸系腸系膜血栓、膜靜脈閉塞、主動(dòng)脈瘤修復(fù)、冠狀動(dòng)脈搭橋、或者肢體動(dòng)脈閉塞的手術(shù)的事件。
14.一種保護(hù)從活哺乳動(dòng)物分離的器官部分、器官、或者肢體的方法，該方法包括用含有效量組合物的溶液浸灌所述器官部分、器官或者肢體，所述組合物包含，藥用可接受載體中的2-酮鏈烷酸的烷基、芳烷基、烷氧烷基、或羧烷基酯，所述載體包含生物學(xué)安全、在生理PH值下誘導(dǎo)和穩(wěn)定所述酯的2-酮官能度烯醇化的成分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述方法，其中所述2-酮鏈烷酸酯選自丙酮酸乙酯、丙酮酸丙酯、丙酮酸丁酯、丙酮酸羧甲酯、丙酮酸乙酰氧基甲酯、丙酮酸乙酯基甲酯和丙酮酸乙氧基甲基酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述方法，其中所述2-酮鏈烷酸酯選自2-酮丁酸乙酯、2-酮戊酸乙酯、2-酮-3-甲基丁酸乙酯、2-酮-4-甲基戊酸乙酯和2-酮己酸乙酯。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述方法，其中所述2-酮鏈烷酸酯是摻合在鹽水溶液中，所述溶液含有鈣離子或者鎂離子。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述方法，其中所述2-酮鏈烷酸酯是摻合在鹽水溶液中，所述溶液含有鈣離子或者鎂離子。
全文摘要
本發(fā)明公開一種藥用組合物包含,藥用可接受載體中的2－酮鏈烷酸的烷基、芳烷基、烷氧烷基、或羧烷基酯,所述載體包含生物學(xué)安全、在生理pH值誘導(dǎo)和穩(wěn)定所述酯的2－酮官能度烯醇化的成分,其中在所述載體中,所述酯的2－酮官能度的烯醇形式在生理pH值是穩(wěn)定的。所述組合物用于醫(yī)療處理膜局部缺血、腸系膜血栓、膜靜脈閉塞、主動(dòng)脈瘤修復(fù)、冠狀動(dòng)脈搭橋、或者肢體動(dòng)脈閉塞的手術(shù)的事件。以及保護(hù)從活哺乳動(dòng)物分離的器官部分、器官、或者肢體。上式中R
文檔編號(hào)A61K47/02GK1377266SQ00813879
公開日2002年10月30日 申請日期2000年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月7日
發(fā)明者阿爾弗雷德·M·阿加米, 卡里·A·西姻斯, 米切爾·P·芬克 申請人:安瑟斯生命科學(xué)公司, 貝斯以色列護(hù)理醫(yī)療中心公司