一種復(fù)合天然抗氧化劑的制備方法與流程

本發(fā)明涉及食品添加劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種復(fù)合天然抗氧化劑的制備方法。

背景技術(shù)：

食品添加劑工業(yè)不斷發(fā)展，推動(dòng)了食品抗氧化劑行業(yè)的迅速發(fā)展，一直被人們使用的合成抗氧化劑由于存在安全問(wèn)題逐漸被人們所冷落，如早期應(yīng)用的合成抗氧化劑如BHT(二丁基羥基甲苯)、BHA和TBHQ(叔丁基對(duì)苯二酚)等由于具有產(chǎn)量大、價(jià)格低、抗氧化較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)一直壟斷著食品抗氧化劑的市場(chǎng)。然而，不斷有人對(duì)人工合成的抗氧化劑的安全性提出質(zhì)疑，并對(duì)其可能存在的毒性進(jìn)行了一系列的研究，結(jié)果表明，人工合成的抗氧化劑具有一定的毒性和致癌作用，因此天然抗氧化劑漸漸地出現(xiàn)在人們的生活中。

目前的保健食品中幾乎有一半是天然抗氧化劑，如維生素E、維生素C、維生素A、β-胡蘿卜素，SOD酶等，但是這些天然抗氧化劑的成本太高、抗氧化性能不夠理想，因此研究重點(diǎn)是在抗氧化劑的提取上，但自然來(lái)源的動(dòng)植物萃取物成分復(fù)雜，抗氧化效果是多種物質(zhì)的共同作用，有效的抗氧化成分往往不確定，其抗氧化效果在定量上也不容易比較，給動(dòng)力學(xué)和構(gòu)效關(guān)系研究帶來(lái)困難。一些天然的抗氧化劑逐漸出現(xiàn)在市場(chǎng)上，如迷迭香、茶多酴、原花青素、蜂膠等，但是其存在著抗氧化成分單一，抗氧化性低，提取成本高，價(jià)格昂貴，市場(chǎng)占有率低和使用范圍窄的不足，并且傳統(tǒng)的提取工藝獲得最終產(chǎn)品存在著極易吸濕，不易保存，運(yùn)輸和收藏不便等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出一種復(fù)合天然抗氧化劑的制備方法，其操作簡(jiǎn)單，提取率高、成本低，可獲得具有高效安全、穩(wěn)定性好和運(yùn)用范圍廣特點(diǎn)的復(fù)合天然抗氧化劑。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種復(fù)合天然抗氧化劑的制備方法，包括如下步驟：

(1)粗提?。悍謩e對(duì)陳皮、柚子皮和火龍果皮預(yù)處理后，通過(guò)微波協(xié)同萃取方式分別得到陳皮、柚子皮和火龍果皮的粗提取液；

(2)精制：采用大孔徑樹(shù)脂對(duì)步驟(1)的所述粗提取液進(jìn)行分離純化，分別精制得到陳皮、柚子皮和火龍果皮的提取濃縮液；

(3)復(fù)配：將所述提取濃縮液與輔助劑按照比例進(jìn)行復(fù)配，獲得抗氧化劑復(fù)配液；

(4)干燥：將所述抗氧化劑復(fù)配液通過(guò)噴霧干燥或真空干燥，制得復(fù)合天然抗氧化劑。

進(jìn)一步說(shuō)明，步驟(1)中所述預(yù)處理包括清洗、干燥和粉碎，其中干燥溫度為50～65℃，干燥時(shí)間為4～6h，粉碎細(xì)度為40～60目。

進(jìn)一步說(shuō)明，所述微波協(xié)同萃取包括如下步驟：

(1)分別將預(yù)處理好的陳皮、柚子皮和火龍果皮分別置于三個(gè)提取罐中；

(2)按各設(shè)定的料液比添加不同濃度乙醇溶液：陳皮按照1:4的料液比來(lái)添加73％乙醇溶液；柚子皮按照1:3的料液比來(lái)添加55％乙醇溶液；火龍果皮按照1:3的料液比來(lái)添加60％乙醇溶液；

(3)先向所述提取罐中各加入5ml的乙醇溶液，經(jīng)微波輻照提取后，再各加入25ml的乙醇溶液，在70℃下分別恒溫?cái)嚢?0min，過(guò)濾得到粗提取液。

進(jìn)一步說(shuō)明，所述微波輻照的條件為：所述陳皮在640W微波功率下輻照80s；所述柚子皮在640W微波功率下輻照90s；所述火龍果皮在480W微波功率下輻照80s。

進(jìn)一步說(shuō)明，所述大孔徑樹(shù)脂對(duì)所述粗提取液進(jìn)行分離純化包括如下步驟：

(1)大孔徑樹(shù)脂處理：將大孔徑樹(shù)脂用無(wú)水乙醇充分浸泡，再依次用水、0.1mol/LNaCl和Na₂CO₃溶液沖洗，最后用蒸餾水洗滌；取大孔徑樹(shù)脂濾去水分，采用排水法裝柱，柱直徑1.0cm，填裝的大孔徑樹(shù)脂高度為3.0cm；

(2)將所述粗提取液采用經(jīng)裝柱后的大孔徑樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，吸附時(shí)間為120～150min，采用0.2％HCl-40％乙醇溶液作為洗脫劑，進(jìn)樣速度為1.5mL/min，洗脫速度為1.0mL/min。

進(jìn)一步說(shuō)明，所述輔助劑包括卵磷脂、維生素C和檸檬酸；所述陳皮、柚子皮和火龍果皮的提取濃縮液與卵磷脂、維生素C和檸檬酸的復(fù)配比例為：3:6:6:0.2:0.1:0.2。

進(jìn)一步說(shuō)明，所述噴霧干燥的參數(shù)條件包括乳化液的均質(zhì)壓力為35～40MPa，進(jìn)風(fēng)溫度為170℃，出風(fēng)溫度為60℃，進(jìn)料溫度為50℃。

本發(fā)明的有益效果：(1)選取產(chǎn)量大、易得且成本低廉的陳皮、柚子皮和火龍果皮的原料，復(fù)合多種抗氧化成分，成本低；并通過(guò)微波協(xié)同萃取和大孔徑樹(shù)脂的吸附對(duì)抗氧化成分的有效提取，可經(jīng)過(guò)控制提取條件來(lái)提高抗氧化劑成分的純度和單位產(chǎn)品抗氧化活性，操作簡(jiǎn)單，提取率高；

(2)將提取濃縮液與輔助劑進(jìn)行復(fù)配獲得高效、安全的抗氧化劑復(fù)配液，其抗氧化能力主要是體現(xiàn)在對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基具有較好清除能力及還原能力，并且隨著抗氧化劑復(fù)配液濃度的升高，抗氧化能力增強(qiáng)，更適合作為脂質(zhì)抗氧化劑，并且對(duì)亞油酸、豬油、植物油、油脂和糕點(diǎn)表現(xiàn)很好的抗氧化效果；

(3)通過(guò)噴霧干燥或真空干燥得到包覆效果好的復(fù)合天然抗氧化劑產(chǎn)品，不易吸濕，易于保藏，不存在安全隱患的特點(diǎn)，可拓展其應(yīng)用范圍，廣泛應(yīng)用于食品抗氧化劑、保健品和化妝品等領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的微波功率對(duì)火龍果皮提取的影響曲線圖；

圖2是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的微波提取時(shí)間對(duì)抗氧化劑提取的影響曲線圖；

圖3是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的料液比對(duì)抗氧化劑提取的影響曲線圖；

圖4是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的5種樹(shù)脂的靜態(tài)吸附曲線圖；

圖5是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的不同進(jìn)樣速度下的泄漏曲線圖；

圖6是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的不同酸濃度的洗脫曲線圖；

圖7是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的濃縮液放置7d的可見(jiàn)吸收光譜圖；

圖8是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的復(fù)配液對(duì)DPPH自由基的清除能力曲線圖；

圖9是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的3種復(fù)配液對(duì)0₂^-的清除效果曲線圖；

圖10是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的3種復(fù)配液對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果曲線圖；

圖11是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的3種復(fù)配液的還原能力曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

一種復(fù)合天然抗氧化劑的制備方法，包括如下步驟：

(1)粗提?。悍謩e對(duì)陳皮、柚子皮和火龍果皮預(yù)處理后，通過(guò)微波協(xié)同萃取方式分別得到陳皮、柚子皮和火龍果皮的粗提取液；

(2)精制：采用大孔徑樹(shù)脂對(duì)步驟(1)的所述粗提取液進(jìn)行分離純化，分別精制得到陳皮、柚子皮和火龍果皮的提取濃縮液；

(3)復(fù)配：將所述提取濃縮液與輔助劑按照比例進(jìn)行復(fù)配，獲得抗氧化劑復(fù)配液；

(4)干燥：將所述抗氧化劑復(fù)配液通過(guò)噴霧干燥或真空干燥，制得復(fù)合天然抗氧化劑。

本發(fā)明以陳皮、柚子皮和火龍果皮為主要原料，分別經(jīng)過(guò)預(yù)處理、抗氧化成分的提取和抗氧化成分的精制濃縮后，與輔助劑復(fù)配和進(jìn)行噴霧干燥獲得了一種高效、安全無(wú)毒的復(fù)合天然抗氧化劑；實(shí)現(xiàn)了將微波協(xié)同萃取工藝、大孔徑樹(shù)脂精制工藝以及噴霧干燥工藝的有效結(jié)合，得到更加優(yōu)化的復(fù)合天然抗氧化劑的工藝參數(shù)和分析方法體系，可廣泛運(yùn)用于有技術(shù)在企業(yè)中，以期生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)、健康、環(huán)保的食品抗氧化劑。

本發(fā)明通過(guò)選取產(chǎn)量大、易得且成本低廉的陳皮、柚子皮和火龍果皮的原料，復(fù)合多種抗氧化成分，成本低；并通過(guò)微波協(xié)同萃取和大孔徑樹(shù)脂的吸附對(duì)抗氧化成分的有效提取，可經(jīng)過(guò)控制提取條件來(lái)提高抗氧化劑成分的純度和單位產(chǎn)品抗氧化活性，操作簡(jiǎn)單，提取率高；

采用復(fù)配的方法，將提取濃縮液與輔助劑進(jìn)行復(fù)配獲得高效、安全的抗氧化劑復(fù)配液，通過(guò)對(duì)所述抗氧化劑復(fù)配液進(jìn)行了抗氧化實(shí)驗(yàn)，其抗氧化能力主要是體現(xiàn)在對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基具有較好清除能力及還原能力，并且隨著抗氧化劑復(fù)配液濃度的升高，抗氧化能力增強(qiáng)，更適合作為脂質(zhì)抗氧化劑，并且對(duì)亞油酸、豬油、植物油、油脂和糕點(diǎn)表現(xiàn)很好的抗氧化效果；

針對(duì)對(duì)復(fù)合天然抗氧化劑的不穩(wěn)定性，噴霧干燥或真空干燥來(lái)最終得到包覆效果好的復(fù)合天然抗氧化劑產(chǎn)品，其不僅具有不易吸濕，易于保藏，不存在安全隱患的特點(diǎn)，可大大拓展其應(yīng)用范圍，廣泛應(yīng)用于食品抗氧化劑、保健品和化妝品等領(lǐng)域。

進(jìn)一步說(shuō)明，步驟(1)中所述預(yù)處理包括清洗、干燥和粉碎，其中干燥溫度為50～65℃，干燥時(shí)間為4～6h，粉碎細(xì)度為40～60目。

進(jìn)一步說(shuō)明，所述微波協(xié)同萃取包括如下步驟：

(1)分別將預(yù)處理好的陳皮、柚子皮和火龍果皮分別置于三個(gè)提取罐中；

(2)按各設(shè)定的料液比添加不同濃度乙醇溶液：陳皮按照1:4的料液比來(lái)添加73％乙醇溶液；柚子皮按照1:3的料液比來(lái)添加55％乙醇溶液；火龍果皮按照1:3的料液比來(lái)添加60％乙醇溶液；

(3)先向所述提取罐中各加入5ml的乙醇溶液，經(jīng)微波輻照提取后，再各加入25ml的乙醇溶液，在70℃下分別恒溫?cái)嚢?0min，過(guò)濾得到粗提取液。

通過(guò)采用95％的食用乙醇分別配置成體積分?jǐn)?shù)為55％、60％和73％的三種乙醇水溶液，分別用來(lái)作為柚子皮、火龍果皮和陳皮的提取劑，提取劑可以循環(huán)利用，節(jié)約成本，并且根據(jù)不同的原料的特點(diǎn)來(lái)設(shè)定一定的料液比，從而實(shí)現(xiàn)更好的微波協(xié)同萃取效果，有效保護(hù)植物中的成分，萃取速度快，提高收率及提取物質(zhì)純度，降低提取劑消耗及廢物產(chǎn)生量，符合綠色環(huán)保理念。

進(jìn)一步說(shuō)明，所述微波輻照的條件為：所述陳皮在640W微波功率下輻照80s；所述柚子皮在640W微波功率下輻照90s；所述火龍果皮在480W微波功率下輻照80s。

由于微波功率和輻照(提取)時(shí)間影響著抗氧化劑成分的提取效果，因此針對(duì)不同的原料的微波輻照的條件進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)選，從而分別獲得了陳皮、柚子皮和火龍果皮優(yōu)選的微波輻射條件。

進(jìn)一步說(shuō)明，所述大孔徑樹(shù)脂對(duì)所述粗提取液進(jìn)行分離純化包括如下步驟：

(1)大孔徑樹(shù)脂處理：將大孔徑樹(shù)脂用無(wú)水乙醇充分浸泡，再依次用水、0.1mol/LNaCl和Na₂CO₃溶液沖洗，最后用蒸餾水洗滌；取大孔徑樹(shù)脂濾去水分，采用排水法裝柱，柱直徑1.0cm，填裝的大孔徑樹(shù)脂高度為3.0cm；

(2)將所述粗提取液采用經(jīng)裝柱后的大孔徑樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，吸附時(shí)間為120～150min，采用0.2％HCl-40％乙醇溶液作為洗脫劑，進(jìn)樣速度為1.5mL/min，洗脫速度為1.0mL/min。

通過(guò)大孔徑樹(shù)脂的吸附作用來(lái)對(duì)所述粗提取液的分離純化，并優(yōu)選所述吸附時(shí)間、洗脫劑及洗脫劑的濃度、進(jìn)樣速度和洗脫速度等參數(shù)，從而進(jìn)一步提高抗氧化劑的回收率、濃縮倍數(shù)，不僅可降低能耗，而且同時(shí)避免在濃縮過(guò)程中抗氧化劑的降解與變性。

進(jìn)一步說(shuō)明，所述輔助劑包括卵磷脂、維生素C和檸檬酸；所述陳皮、柚子皮和火龍果皮的提取濃縮液與卵磷脂、維生素C和檸檬酸的復(fù)配比例為：3:6:6:0.2:0.1:0.2。

將所述提取濃縮液與所述卵磷脂、維生素C和檸檬酸進(jìn)行復(fù)配，優(yōu)選其復(fù)配配方，從而最優(yōu)化所述抗氧化劑復(fù)配液的抗氧化能力，其顏色為淺褐色，可采用紙袋包裝和紙筒包裝，抗氧化活性與同劑量的相當(dāng)，安全健康，適用性廣。

進(jìn)一步說(shuō)明，所述噴霧干燥的參數(shù)條件包括乳化液的均質(zhì)壓力為35～40MPa，進(jìn)風(fēng)溫度為170℃，出風(fēng)溫度為60℃，進(jìn)料溫度為50℃。

在進(jìn)行噴霧干燥時(shí)，所述進(jìn)風(fēng)溫度、出風(fēng)溫度、乳化液的均質(zhì)壓力和進(jìn)料溫度對(duì)于噴霧干燥的顆粒大小、干燥速度和水分含量以及產(chǎn)品的穩(wěn)定性都有較大的影響，因此優(yōu)選乳化液的均質(zhì)壓力為35～40MPa，進(jìn)風(fēng)溫度為170℃，出風(fēng)溫度在60℃，進(jìn)料溫度為50℃。

實(shí)施例-一種天然復(fù)合抗氧化劑的制備工藝

1、粗提取

(1)預(yù)處理：

a.陳皮的預(yù)處理：

將陳皮放入烘箱，65℃下干燥4h，粉碎，過(guò)40目蹄，石油醚浸泡脫脂，將脫脂后的物料烘干，放置備用。

b.柚子皮的預(yù)處理：

將柚子去果肉后，將柚子皮洗凈，晾干，剪碎，放入烘箱，40℃下干燥4h，粉碎，過(guò)60目蹄，放置備用。

c.火龍果皮的預(yù)處理：

將火龍果去肉，火龍果皮洗凈，晾干，剪碎，放入烘箱，50℃下干燥6h，粉碎，過(guò)40目蹄，放置備用。

(2)微波協(xié)同萃取

a.操作步驟：

(1)分別將預(yù)處理好的陳皮、柚子皮和火龍果皮各5.0g分別置于三個(gè)提取罐中；

(2)按各設(shè)定的料液比添加不同濃度乙醇溶液：陳皮添加73％乙醇溶液；柚子皮添加55％乙醇溶液；火龍果皮添加60％乙醇溶液；

(3)先向所述提取罐中各加入5ml的乙醇溶液，經(jīng)微波輻照提取后，再各加入25ml的乙醇溶液，在70℃下分別恒溫?cái)嚢?0min，過(guò)濾得到粗提取液。

b.提取工藝的優(yōu)化試驗(yàn)及影響因素研究:

使用分光光度法對(duì)各粗提取液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得陳皮粗提取液的測(cè)量點(diǎn)在632nm，柚子皮粗提取液的測(cè)量點(diǎn)在513nm處，火龍果皮粗提取液的測(cè)量點(diǎn)在535nm處；使用OD₆₃₂，OD₅₁₃和OD₅₃₅分別作為各粗提取液的指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的判定。

主要研究的3個(gè)因素包括微波功率、輻照(提取)時(shí)間和料液比(g:ml)，固定其中兩個(gè)因素進(jìn)行第三個(gè)因素的平行試驗(yàn)，各處理均重復(fù)3次。

①微波功率：精確稱取10.0g切好的火龍果皮多份，分別置于三角瓶中，并向其中按照料液比(g:ml)為1:3加入60％乙醇溶液30ml，微波爐最大功率800W，分別使用其20％，40％，60％，80％，100％最大功率的狀態(tài)下提取80s，測(cè)定最終提取液的總體OD₅₃₅，結(jié)果見(jiàn)圖1，微波功率對(duì)火龍果皮提取的影響表明，隨著微波功率的提高，OD₅₃₅也隨之增加，功率為60％時(shí)達(dá)到最高，因此選擇微波提取功率為60％(480W)。

②輻照(提取)時(shí)間：精確稱取10.0g火龍果皮多份，分別置于三角瓶中，按照1:3的料液比(g:ml)加入一定體積的純凈水，在60％的微波輻射功率(即480W)下，分別提取60、70、80、90、100、110、120和130s，測(cè)定提取液OD535，如圖2所示，微波提取時(shí)間對(duì)抗氧化劑提取的影響，結(jié)果可知，在60-80s之間，火龍果果皮提取液得率隨時(shí)間的增加而顯著增大。當(dāng)微波加熱時(shí)間達(dá)到110s時(shí)，提取效果最好，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，變化不大；考慮到抗氧化劑的熱穩(wěn)定性和能效，80-100s的OD₅₃₅相差無(wú)幾，因此最佳選擇為80s。

③提取體系料液比：精確稱取10.0g火龍果皮多份，分別置于三角瓶中，并向其中分別加入不同體積的60％乙醇，分別在1:2、1:3、1:4、1:5、1:6的料液比、微波功率480W、微波提取時(shí)間80s的條件下提取。料液比對(duì)火龍果果皮抗氧化劑提取的影響見(jiàn)圖3，表明當(dāng)料液比(g:ml)達(dá)到1:3時(shí)，OD₅₃₅最大，之后隨著溶劑量增加，反而下降。陳皮和柚子皮提取液的提取工藝優(yōu)化與火龍果的相同。最終得到最佳的微波協(xié)同萃取條件為：火龍果皮的料液比為1:3，微波功率480W，微波輻照時(shí)間為80s；陳皮的料液比為1:4，微波功率640W，微波輻照時(shí)間為80s；柚子皮的料液比為1:3，微波功率640W，微波輻照時(shí)間為90s。

2、精制：

a.實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)大孔徑樹(shù)脂處理：將大孔徑樹(shù)脂用無(wú)水乙醇充分浸泡，再依次用水、0.1mol/LNaCl和Na₂CO₃溶液沖洗，最后用蒸餾水洗滌；取大孔徑樹(shù)脂濾去水分，采用排水法裝柱，柱直徑1.0cm，填裝的大孔徑樹(shù)脂高度為3.0cm；

(2)將所述粗提取液采用經(jīng)裝柱后的大孔徑樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，吸附時(shí)間為150min，采用0.2％HCl-40％乙醇溶液作為洗脫劑，進(jìn)樣速度為1.5mL/min，洗脫速度為1.0mL/min；精制得到陳皮、柚子皮和火龍果皮的提取濃縮液；

b.火龍果抗氧化劑精制工藝的優(yōu)化試驗(yàn)研究:

陳皮提取液、柚子皮提取液和火龍果果皮提取液含量測(cè)定采用在632nm、513nm和535nm處的光密度值，以各自純化的干品為參比，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算。

①吸附時(shí)間：以水配制成一定濃度的提取液，各取200mL于5個(gè)錐形瓶中，分別加入0.8g經(jīng)預(yù)處理的5種大孔樹(shù)脂：S-8型、AB-8型、NKA-9型、D3520型、X-5型(南開(kāi)大學(xué)化工廠產(chǎn)品)，置于搖床上振蕩，轉(zhuǎn)速為100r/min，每30min分別從上層清液中移取少量液體測(cè)其OD535值，圖4為火龍果抗氧化劑在不同樹(shù)脂上的靜態(tài)吸附曲線，從圖4可見(jiàn)，S-8樹(shù)脂的吸附能力比AB-8、NKA-9、D3520、X-5都強(qiáng)，隨著吸附時(shí)間延長(zhǎng)，上清液抗氧化劑含量呈指數(shù)下降，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)150min，吸附率可達(dá)81.9％，而其它4種樹(shù)脂的吸附力，都很弱,吸附率只有6.7％。

②洗脫劑中乙醇濃度的選擇：分別取0.20g已經(jīng)吸附了火龍果果皮抗氧化劑的濕樹(shù)脂，各加入50mL濃度為20％、40％、60％、80％的乙醇水溶液，其中均含0.2％的鹽酸，在搖床上振蕩10min，轉(zhuǎn)速為100r/min，使抗氧化劑從樹(shù)脂上解吸，將解吸液用0.2％HCl稀釋至乙醇濃度為20％，測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1不同乙醇濃度對(duì)抗氧化劑解吸的影響OD535值

解吸液的光密度值越高，說(shuō)明解吸效果越好。從表1可以看出，當(dāng)乙醇濃度為40％時(shí)，解吸液的OD535值最高，解吸效果最好；乙醇濃度過(guò)高或過(guò)低，都不利于抗氧化劑解吸。

③進(jìn)樣速度：不同進(jìn)樣速度下火龍果果皮抗氧化劑在S-8型大孔吸附柱上的泄漏曲線如圖5，其中線1～4分別為0.4，1.0，1.5和2.0mL/min；結(jié)果表明，吸附流速增大，大孔樹(shù)脂工作吸附量下降，抗氧化劑不能充分吸附就流出樹(shù)脂床，低流速時(shí)抗氧化劑被充分吸收，但進(jìn)樣時(shí)間長(zhǎng)；因此選擇進(jìn)樣速度為1.5mL/min較為合適。

④不同酸濃度：用不同濃度的鹽酸乙醇溶液對(duì)吸附在S-8樹(shù)脂柱上的火龍果皮提取液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為1.0mL/min，結(jié)果如圖6不同酸濃度的洗脫曲線，用0.2％HCl-40％乙醇溶液作為洗脫劑，峰形較窄，峰值較高，抗氧化劑的濃縮效果好。

⑤濃縮倍數(shù)及回收率：合并0.2％HCl-40％乙醇溶液的洗脫的抗氧化劑峰,測(cè)定抗氧化劑濃度為37.81mg/mL,樣品的濃縮倍數(shù)為17.7倍，回收率達(dá)93.4％。

⑥濃縮液中抗氧化劑的穩(wěn)定性：將濃縮后的抗氧化劑液置于4℃冰箱中保存，每隔1d取出1.0mL濃縮液，用蒸餾水稀釋100倍后測(cè)定吸收光譜的變化，觀察抗氧化劑濃縮液的穩(wěn)定性情況。圖7為濃縮液放置7d的可見(jiàn)吸收光譜圖，由圖可看出在1周內(nèi)抗氧化劑最大吸收值變化緩慢，且并無(wú)發(fā)生質(zhì)的變化，可以滿足在噴霧干燥前的保存要求。

從以上實(shí)驗(yàn)可以看出，用大孔徑樹(shù)脂S-8精制濃縮火龍果抗氧化劑，以0.2％HCl-40％乙醇溶液作為洗脫液，抗氧化劑的回收率達(dá)到93.4％，濃縮倍數(shù)達(dá)到17倍以上。

3、復(fù)配及抗氧化實(shí)驗(yàn)：

a.復(fù)配：將所述提取濃縮液與卵磷脂、維生素C和檸檬酸按照3:6:6:0.2:0.1:0.2的比例進(jìn)行復(fù)配，獲得抗氧化劑復(fù)配液；

b.抗氧化實(shí)驗(yàn)：

①對(duì)超氧陰離子自由基O₂^-的清除：濃度為1.5×10^-3mol/L的魯米諾溶液用pH＝10.20的0.05mol/LNa₂CO₃-NaHCO₃緩沖溶液配制，濃度為0.1mol/L的鄰苯三酚儲(chǔ)備液用1×10^-3mol/L的鹽酸配制，使用前用去離子水稀釋至1×10^-4mol/L。以緩沖液作為溶劑，配制不同濃度的樣品溶液。用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀依次測(cè)定從稀到濃的樣品溶液，讀出峰面積。

清除率＝(A₀-A_i)/A₀×100％。其中A₀為空白溶液峰面積；A_i為樣品溶液峰面積。經(jīng)SOD，過(guò)氧化氫酶及甘露醇檢測(cè)，該體系產(chǎn)生的自由基為超氧陰離子O2^-。

②對(duì)羥基自由基·OH的清除：濃度為6.4×10^-4mol/L的魯米諾溶液、0.012mol/LH₂O₂和0.8mg/mL亞鐵氰化鉀溶液用pH＝7.40的0.05mol/L KH2PO4-NaOH緩沖溶液分別配制。以緩沖液作為溶劑，配制成系列不同濃度的樣品溶液。依上述流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析方法測(cè)定并計(jì)算樣品清除羥基自由基的活性。

③對(duì)DPPH自由基的清除：取不同濃度的樣品溶液2.0mL，分別加入在裝有2.0mL的濃度為1×10^-4mol/L DPP無(wú)水乙醇溶液的比色管中，室溫下避光靜置半小時(shí)，在517nm處測(cè)量吸光度A_i。用去離子水代替樣品溶液，得吸光度A₀，無(wú)水乙醇代替DPPH，得吸光度A_j。

清除率＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100％。

④還原能力的測(cè)定：取2.0mL不同濃度的樣品，加入pH＝6.60的0.2mol/L磷酸緩沖液1％鐵氰化鉀溶液各2.5mL混勻。50℃水浴20min后迅速冷卻，加入2.5mL10％三氯乙酸溶液，混勻后在3000r/min下離心10min，取上清液2.0mL，加入2.5mL去離子水和0.5mL0.1％的三氯化鐵溶液，靜置十分鐘后在700nm處測(cè)定吸光度。

⑤抑菌能力的測(cè)定：四種供試菌分別接種于液體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的搖床內(nèi)活化24h，使菌液達(dá)到一定濃度。配制好的培養(yǎng)基，于121℃滅菌15min。當(dāng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45℃左右時(shí)可傾注于平板中并搖勻，厚度為1/2平板深度。待培養(yǎng)基凝固后加入0.1mL菌懸液，用無(wú)菌涂布棒涂布均勻。靜置片刻，在平板中打孔(直徑為6mm)，挑出多余培養(yǎng)基，將0.1mL無(wú)菌溶液注入已打好的孔中，置于37℃下培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈直徑。

⑥最低抑菌濃度的測(cè)定：配制胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌。利用胰蛋白胨大豆肉湯進(jìn)行試管連續(xù)稀釋得茶多酚的濃度分別為0.01％、0.02％、0.03％、0.04％及0.05％；竹醋液濃度分別為0.5％、1.0％、1.5％、2.0％及2.5％。在每一系列培養(yǎng)基中接種一種菌，每個(gè)濃度三管平行，并置于37℃下培養(yǎng)18h，之后觀察生長(zhǎng)情況。將各管利用劃線法接種、培養(yǎng)，觀察各供試菌的生長(zhǎng)情況，以平板中沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低濃度即為最低抑菌濃度MIC。

將陳皮、柚子皮和火龍果皮提取濃縮液和卵磷脂、維生素C、檸檬酸按以下比例進(jìn)行復(fù)配：A3:6:6:0.2:0.1:0.2；B 3:6:3:0.2:0.1:0.2；C 6:3:3:0.2:0.1:0.2；將對(duì)以上3個(gè)配方的抗氧化性能進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

⑦對(duì)DPPH自由基的清除：由圖8中可知，對(duì)DPPH的清除效果隨著復(fù)配液體系中自由基清除劑含量的升高，對(duì)DPPH的清除能力上升，所有自由基清除劑對(duì)DPPH自由基的半清除率IC₅₀幾乎一樣，是236.7mL/L，均大于于單一產(chǎn)品的IC₅₀(208.0m L/L)、(206.7mL/L)和(196.9mL/L)。陳皮提取液和柚子皮提取液中含有抗氧化活性的有機(jī)物質(zhì)成分，有清除DPPH的作用，火龍果皮提取液具有活性氨基，能夠提供還原氫，也具有良好的DPPH清除效果。復(fù)配后有增效作用，而配方A的效果要好于其他2個(gè)配方。

⑧對(duì)超氧陰離子自由基的清除：圖9是3種復(fù)配液對(duì)0₂^-的清除效果。隨著含量的增高，復(fù)配液對(duì)0₂^-的清除能力增強(qiáng)，相對(duì)來(lái)說(shuō)，配方C的效果較好。

⑨對(duì)超氧陰離子自由基的清除：圖10表示3種復(fù)配液對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果。復(fù)配后的效果明顯比單一產(chǎn)品的清除率提高很多，說(shuō)明復(fù)配后有增效作用，尤其是配方A的效果好于其他配方。

⑩還原能力：還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，通過(guò)提供電子，阻斷Fe²⁺向Fe³⁺的轉(zhuǎn)變，從而表現(xiàn)出一定的還原能力。圖11是3種復(fù)配液的還原能力，隨著復(fù)配液濃度的升高，吸光度值逐漸增大，還原能力增強(qiáng)，即抗氧化能力增強(qiáng)。復(fù)配液在還原體系中，當(dāng)吸光度達(dá)0.4時(shí)，對(duì)應(yīng)的復(fù)配液濃度為80mg/mL，而同一體系中茶多酚對(duì)應(yīng)的濃度為65μg/mL。

⑾抑菌效果：

表2復(fù)配液對(duì)對(duì)供試菌的抑制效果(抑菌圈直徑MM)

表2是3種復(fù)配液對(duì)四種供試菌的抑制效果，可知竹醋液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及副溶血性弧菌均有不同程度的抑制作用，其中配方A的效果最好。

針對(duì)復(fù)合天然抗氧化劑在的抗氧化能力及對(duì)供試菌的抑制效果，結(jié)果表明，復(fù)配液的抗氧化能力主要是體現(xiàn)在對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基具有較好清除能力及還原能力。隨著復(fù)配液濃度的升高，抗氧化能力增強(qiáng)，更適合作為脂質(zhì)抗氧化劑。同時(shí)，復(fù)配液對(duì)四種常見(jiàn)的食源性致病菌具有較好的抑制效果，亦是隨復(fù)配液液濃度的升高而增強(qiáng)，稀釋到10％濃度時(shí)，抑菌能力大幅度降低。

4、干燥：

a.實(shí)驗(yàn)步驟：將所述抗氧化劑復(fù)配液通過(guò)噴霧干燥或真空干燥，其中，乳化液的均質(zhì)壓力為35MPa，進(jìn)風(fēng)溫度為170℃，出風(fēng)溫度為60℃，進(jìn)料溫度為50℃，制得復(fù)合天然抗氧化劑。

應(yīng)用研究

1、對(duì)亞油酸的抗氧化作用

評(píng)價(jià)抗氧化劑抗氧化能力的大小，本發(fā)明采用應(yīng)用較廣的硫代巴比妥酸法(TBA法)。由表3可以看出，在實(shí)驗(yàn)中添加了0.02％的復(fù)合天然抗氧化劑和TBHQ的亞油酸溶液，其吸光值上升非常緩慢，而空白的吸光值在培育時(shí)間為12h后即開(kāi)始急速上升。即樣品中添加的復(fù)合天然抗氧化劑和TBHQ一樣對(duì)亞油酸的脂質(zhì)過(guò)氧化具非常強(qiáng)列的阻止作用。本實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合天然抗氧化劑對(duì)亞油酸的脂質(zhì)過(guò)氧化的阻止作用略強(qiáng)于TBHQ的作用。

表3對(duì)亞油酸的抗氧化作用

2、對(duì)豬油脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

空白豬油樣品在60℃恒溫培養(yǎng)箱中放置18天以后，其532nm下的吸光值飛速升高，表明此時(shí)豬油自動(dòng)氧化快，樣品中產(chǎn)生的丙二醛(MDA)含量進(jìn)入迅速增長(zhǎng)期；加入了抗氧化劑的各處理中的吸光值一直處于較低水平，表明其氧化速度慢，其樣品中產(chǎn)生的丙二醛(MDA)含量很少，抗氧化劑復(fù)合天然抗氧化劑和TBHQ在豬油中發(fā)揮了抗氧化作用，阻緩了豬油的氧化腐敗。

表4不同純度的樣品對(duì)豬油的抗氧化效果(吸光度值)

注：樣品1，2，3分別為純度為60％、80％和90％的復(fù)合天然抗氧化劑

由表4可以看出，不同純度的復(fù)合天然抗氧化劑其抗氧化能力有一定區(qū)別，純度越高，抗氧化效果越好；在相等加入量的情況下，純度為60％、80％、90％的復(fù)合天然抗氧化劑處理的豬油樣品在不同檢測(cè)時(shí)期其吸光值即丙二醛含量均較TBHQ低，表明復(fù)合天然抗氧化劑延緩豬油氧化的作用大于TBHQ，各處理的抗氧化效果依次為90％α-HT>80％α-HT>60％α-HT>TBHQ。

表5對(duì)豬油過(guò)氧化的抑制率(％)

由表5也可以看出，抗氧化作用釋放速度比TBHQ快，在處理30天內(nèi)抗氧能力比TBHQ大。在10天時(shí)，TBHQ對(duì)豬油過(guò)氧化的抑制率僅25％時(shí)，不同純度的復(fù)合天然抗氧化劑的抑制率即分別達(dá)到了32.14％、35.71％和57.14％，到30天時(shí)，其抗氧抑制率仍然保持在95％以上。

同時(shí)還可以看出，抗氧化抑制率與純度呈正依賴關(guān)系，其抑制率大小順序?yàn)椋?0％>α-HT>80％α-HT>60％復(fù)合天然抗氧化劑>TBHQ。

3、對(duì)植物油脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

表6不同純度的樣品對(duì)植物油的抗氧化效果(吸光度值)

由表6看出，對(duì)照植物油樣品從第14天開(kāi)始其吸光值即進(jìn)入急劇上升階段，至第31天時(shí)其吸光值已達(dá)很高；各處理的吸光值在整個(gè)過(guò)程中均明顯低于對(duì)照。在20天之前，純度為90％的復(fù)合天然抗氧化劑的吸光值最低，純度為60％和80％、TBHQ的吸光值相接近。20天之后，TBHQ的吸光值卻在四個(gè)處理中屬最低，其次為90％、80％、60％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)植物油而言，復(fù)合天然抗氧化劑在前期的抗氧化效果優(yōu)于TBHQ，后期效果較TBHQ稍差；但其抗氧化效果與在豬油中的抗氧化效果一樣，即在同等添加量的情況下，抗氧化效果隨純度升高而增強(qiáng)。

表7各樣品對(duì)植物油氧化的抑制率

由表7可知：各樣品對(duì)植物油的過(guò)氧化抑制率都較高，但其抑制植物油過(guò)氧化的情況較豬油復(fù)雜。在第10天和第20天時(shí)，純度為90％的復(fù)合天然抗氧化劑處理的抑制率最高，分別達(dá)56.82％、94.49％；而到30天時(shí)，以TBHQ的抑制率最高，為92.7％。實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)合天然抗氧化劑對(duì)豬油的抗氧化效果優(yōu)于植物油。

4、在糕點(diǎn)產(chǎn)品中的應(yīng)用

在進(jìn)行復(fù)合天然抗氧化劑對(duì)油脂，糕點(diǎn)的抗氧化實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合天然抗氧化劑表現(xiàn)了很好的抗氧化效果。結(jié)果如表8，當(dāng)復(fù)合天然抗氧化劑添加量為0.04％時(shí)，菜油、豬油、月餅、核桃酥中過(guò)氧化值達(dá)標(biāo)的時(shí)間分別為空白的2、2.4、3.2和5.5倍；當(dāng)復(fù)合天然抗氧化劑添加量為0.06％時(shí)，菜油、豬油、月餅、核桃酥中過(guò)氧化值達(dá)標(biāo)的時(shí)間分別為空白的2.3、3.4、4、7.2倍。顯示了復(fù)合天然抗氧化劑很好的抗氧化應(yīng)用效果。

表8復(fù)合天然抗氧化劑的抗氧化的應(yīng)用效果

以上結(jié)合具體實(shí)施例描述了本發(fā)明的技術(shù)原理。這些描述只是為了解釋本發(fā)明的原理，而不能以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制?；诖颂幍慕忉?，本領(lǐng)域的技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性的勞動(dòng)即可聯(lián)想到本發(fā)明的其它具體實(shí)施方式，這些方式都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。