一種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，并涉及制備得到的該飲品，屬于食品飲料【技術(shù)領(lǐng)域】。所述制備方法，包括將以羅漢果提取物、低聚木糖、大豆多糖、大豆蛋白胨、脫脂牛乳、乳酸鈣3、復(fù)合枸杞濃縮汁等為主要原料的發(fā)酵培養(yǎng)液，按照特定條件滅菌后，依次接種植物乳桿菌菌液和長(zhǎng)雙歧桿菌菌液，在厭氧發(fā)酵罐中保持一定罐壓發(fā)酵得到發(fā)酵乳基料，灌裝或調(diào)配灌裝，得到含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品。具有活菌含量高、發(fā)酵時(shí)間短、活菌存活率高，其中長(zhǎng)雙歧桿菌的發(fā)酵性、耐酸性和耐胃酸性良好，益生效果顯著的特點(diǎn)。
CGMCC NO.9405
20140702
【專利說(shuō)明】一種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品及其制 備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，并涉 及制備得到的該飲品，屬于食品飲料【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002] 羅漢果形似雞卵，成熟鮮果外皮呈綠色，經(jīng)炭火烘干后成褐紅色，有光澤，可鮮吃， 但常烘干保存，是一種風(fēng)味獨(dú)特的干果。羅漢果營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，干果含糖30%左右，蛋白質(zhì) 10%左右，每100克果實(shí)中含有維生素 ClOO毫克。其果仁含油量高達(dá)40%，而且其中主要是 油酸和亞油酸，約占70%左右。中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為，羅漢果甘、酸，性涼，有清熱涼血、生津止咳、 滑腸排毒、嫩膚益顏、潤(rùn)肺化痰等功效，可用于益壽延年、駐顏悅色及治療痰熱咳嗽、咽喉腫 痛、大便秘結(jié)、消渴煩躁諸癥，又有防治呼吸道感染和抗癌的功效?，F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研宄發(fā)現(xiàn)，羅 漢果苷V的甜度為蔗糖的250-350倍，VI的甜度為蔗糖的125倍，可添加于各類食品中，對(duì) 糖尿病、高血壓、慢性支氣管炎等患者是一種極為理想的保健品。傳統(tǒng)常沸水沖泡飲用，長(zhǎng) 期飲用有祛斑、潤(rùn)燥、明目、排毒、養(yǎng)顏、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功效。
[0003] 雙歧桿菌（bifidobacterium Iongum)是健康人群消化道內(nèi)具有益生作用的優(yōu)勢(shì) 菌群，其具有的生理功能包括：調(diào)整腸道菌群，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，防止便秘，治療潰瘍性結(jié)腸 炎，產(chǎn)生抗生素，提高蛋白質(zhì)和維生素的代謝，抗衰老，治療肝損傷，抗腫瘤，降低膽固醇等。 隨著年齡的增長(zhǎng)，腸道中雙歧桿菌的數(shù)量逐漸減少，而產(chǎn)氣莢膜梭狀茵、大腸桿菌等有害腐 敗細(xì)菌逐漸增加。同時(shí)一些負(fù)面因素，如服用抗生素、放療、化療、情緒壓抑、身體衰弱、缺乏 免疫力等，也會(huì)導(dǎo)致雙歧桿菌大量消亡，有害細(xì)菌大量繁殖，造成人體健康狀態(tài)不佳，對(duì)疾 病的抵抗力降低，醫(yī)學(xué)專家建議，要健康長(zhǎng)壽，在其他條件得到保證的前提下，設(shè)法增加腸 道中雙歧桿菌的數(shù)量也是促進(jìn)健康長(zhǎng)壽的一種捷徑。目前對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌的研宄日益受到人 們的重視，如何提高其在發(fā)酵性、耐酸性、耐胃酸性等方面的性能，是本行業(yè)人員面臨的較 大挑戰(zhàn)。
[0004] 申請(qǐng)?zhí)枺?01410257294. 6的中國(guó)發(fā)明《一種喉癌患者食用的微生態(tài)特殊膳食》公 開(kāi)了以L-谷氨酰胺為主要原料，配伍石斛、胖大海、百合、蒲公英、羅漢果、金銀花、胖大海、 牛蒡子、桔梗、夏枯草、魚(yú)腥草、桑葉等藥食兩用中草藥提取物，再添加多種抗炎益生菌、維 生素和礦物質(zhì)制成的特殊膳食。可以輔助提高機(jī)體免疫力，起到抑癌、抗癌作用。
[0005] 申請(qǐng)公布號(hào)CN 103462093 A《一種排毒養(yǎng)顏者食用的特殊膳食》公開(kāi)了一種將羅 漢果、郁李仁、枸杞、紅棗、桂圓、火麻仁等多種藥食同源食材烘炒、粉碎后，配以膳食纖維、 阿膠、蕎麥花粉、共軛亞油酸、水蘇糖、螺旋藻、玉米花粉、紫云英花粉、鹽藻提取物、抗性糊 精、人參等，再混合并干燥l〇〇°C滅菌4小時(shí)，然后與嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜 熱鏈球菌等多種益生菌混勻制成的特殊膳食。具有食療、預(yù)防、調(diào)理三重功效。
[0006] 上述發(fā)明成分過(guò)于復(fù)雜，易引起過(guò)敏反應(yīng)的因素較多，不適用人群較廣，且僅是將 各種成分簡(jiǎn)單地混合在一起制成，益生菌活菌含量低，不能充分發(fā)揮各成分的營(yíng)養(yǎng)保健功 效，不適合作為保健食品長(zhǎng)期食用。
[0007] 申請(qǐng)公布號(hào)CN 102919956 A的發(fā)明《調(diào)理人體消化系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)液及其制備方法》 公開(kāi)了種調(diào)理人體消化系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)液，其制備方法為把米糠、螺旋藻、羅漢果、葛根去雜質(zhì)， 分別粉碎，過(guò)篩后按照一定比例放入發(fā)酵罐中，加入按照比例的天然礦泉水，加入紅糖攪拌 至完全溶解，按照比例加入益生菌群，攪拌均勾，在35?37°C下全封閉發(fā)酵5天，過(guò)濾，制得 具有調(diào)理凈化人體消化道和血液的營(yíng)養(yǎng)液，主要解決傳統(tǒng)治療消化道的西藥或中藥服藥后 要控制病情的同時(shí)對(duì)人體細(xì)胞和組織及器官造成一定的損傷產(chǎn)生副作用等，并容易出現(xiàn)依 賴現(xiàn)象的問(wèn)題。
[0008] 上述發(fā)明存在營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成不夠合理，不能滿足益生菌大量增殖的需求，造成益生菌 活菌含量較低，且發(fā)酵周期過(guò)長(zhǎng)的缺點(diǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品 的制備方法，通過(guò)選擇合適的菌種，混合發(fā)酵，優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，制備一種營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成 合理、活菌含量高、保健效果好的保健飲品。所述制備方法發(fā)酵周期短，適于推廣應(yīng)用。同 時(shí)提供上述方法制備得到的含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品。
[0010] 一種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，包括如下步驟：
[0011] (1)按以下配方稱取原料：以質(zhì)量計(jì)，羅漢果提取物1-10%，低聚木糖0.5-1%， 大豆多糖0.05-0. 2%，大豆蛋白胨0· 1-0. 2%，脫脂牛乳10-30%，NaclO. 2-0. 5%，乳酸鈣 〇. 5-1%，復(fù)合枸杞濃縮汁1-2%，其余為軟化水；
[0012] 將脫脂牛乳95°C，5分鐘單獨(dú)加熱滅菌，備用；同時(shí)，將軟化水加熱至50-60°C，依 次加入剩余原料溶解并混合均勻后，90-100°C滅菌5-20分鐘，趁熱加入已滅菌的脫脂牛 乳，混勻，入?yún)捬醢l(fā)酵罐冷卻，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；
[0013] (2)向步驟⑴發(fā)酵培養(yǎng)液中接種植物乳桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量 為1-3% ;培養(yǎng)溫度32-37°C，罐壓0. 02-0. 03MPa，培養(yǎng)時(shí)間2-3小時(shí)；
[0014] (3)接種長(zhǎng)雙歧桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為4-6%，并補(bǔ)加復(fù)合枸 杞濃縮汁1-2%、羅漢果提取物0. 5-1% ;培養(yǎng)溫度35-37°C，罐壓0. 04-0. 06MPa，培養(yǎng)時(shí)間 6-10小時(shí)，得到發(fā)酵乳基料，直接灌裝或調(diào)配后灌裝得到含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿 菌的保健飲品；
[0015] 所述調(diào)配為：將發(fā)酵乳基料與甜味劑、增稠劑、食用香精和水中的一種或多種，按 照保健飲品相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求混合。
[0016] 較佳地，所述調(diào)配，是將發(fā)酵乳基料與其它原料按以下配方混合均勻，以質(zhì)量計(jì)： 2-3%。的大豆多糖、維生素 CO. 12-0. 24%。、羅漢果提取物0. 5-1%、低聚木糖1-3%、葡萄糖 5-10%、發(fā)酵乳基料補(bǔ)足至100%。
[0017] 優(yōu)選的，所述羅漢果提取物制備方法如下：
[0018] 取干羅漢果在100-120°C，烘烤40-100min，破碎，加入羅漢果重量8-10倍的水混 勻，之后加入羅漢果重量0. 4-0. 6%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5. 5-6. 0， 溫度55-60°C，酶解2-4h，將酶解液置于配料缸中，邊緩慢攪拌邊用探頭式超聲提取儀在電 流強(qiáng)度0. 6A/25W-1. 5A/275W條件下進(jìn)行超聲提取20-30min，過(guò)濾，4-6°C放置10_12h，再過(guò) 濾一次，真空濃縮得到羅漢果提取物。
[0019] 所述混合酶制劑為纖維素酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果膠酶按質(zhì)量比4:3:2:1均勻 混合。
[0020] 優(yōu)選的，所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)tlj_2014,保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 9405 ;
[0021] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌CICC6068購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0022] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌在種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)三次，以種子培養(yǎng)基質(zhì)量計(jì)：第一次，接 種量3%，37°C厭氧培養(yǎng)36h，第二次按4%接種量進(jìn)行接種，37°C厭氧養(yǎng)24h，第三次按5% 接種量進(jìn)行接種，37°C厭氧培養(yǎng)12h，得到長(zhǎng)雙歧桿菌菌液；
[0023] 所述種子培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨5. 0g，胰蛋白胨5. 0g，脫脂牛乳40mL，葡萄糖 10. 〇g，低聚木糖10. 〇g，羅漢果提取物5. 0g，復(fù)合枸杞濃縮汁2. 0g，乳酸媽0· 5g, NaclO. 2g， 軟化水補(bǔ)足IOOOmL, ρΗ6· 8。
[0024] 所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) tl j-2014,于 2014 年 7 月 2 日保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào).中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所.郵編：100101)，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 9405， 分類命名為：植物乳桿菌Lactobacillus plantarum。
[0025] 所述植物乳桿菌菌株特點(diǎn)如下：在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈 陽(yáng)性，無(wú)鞭毛，不產(chǎn)芽孢；在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形， 邊緣較整齊。
[0026] 理化特征為：過(guò)氧化氫酶（_)，明膠液化（_)，吲哚實(shí)驗(yàn)（+)，運(yùn)動(dòng)性（_)，發(fā)酵產(chǎn)氣 (-)，亞硝酸鹽還原（-)，發(fā)酵產(chǎn)氣（-)，產(chǎn)硫化氫氣體（-)，pH4. OMRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)（+)。
[0027] 所述植物乳桿菌采用下述流程進(jìn)行選育：
[0028] 原始出發(fā)菌種一試管活化一硫酸二乙酯（DES)誘變一亞硝基胍（NTG)誘變一等離 子體誘變一平板初篩一搖瓶復(fù)篩一傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)。
[0029] 所述出發(fā)菌株在MRS葡萄糖培養(yǎng)基中，其乳酸的生產(chǎn)速率為1.5g/L/d，當(dāng)培養(yǎng)基 pH為3. 5時(shí)幾乎停止生長(zhǎng)，對(duì)亞硝酸鈉的分解速率為0. 34mg/h/kg白菜。出發(fā)菌株為李政 采集于寧夏鹽池縣育肥羊場(chǎng)的青儲(chǔ)飼料，采集時(shí)間2013年9月15日。
[0030] 為了提高其乳酸生產(chǎn)速率、耐酸能力和亞硝酸鹽的分解速率，依次采用DES和NTG 技術(shù)對(duì)該菌種進(jìn)行誘變，誘變后菌株采用MRS碳酸鈣平板進(jìn)行初篩，然后采用500mL搖瓶發(fā) 酵，生物傳感器分析儀對(duì)高產(chǎn)菌進(jìn)行復(fù)篩，選育優(yōu)良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實(shí)驗(yàn)， 評(píng)價(jià)其遺傳穩(wěn)定性。
[0031] 植物乳桿菌tlj-2014遺傳穩(wěn)定性結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代十次，各項(xiàng)性能指標(biāo)都 比較穩(wěn)定，遺傳性較好，性狀沒(méi)有回復(fù)，因此把植物乳桿菌tlj-2014作為選育得到的目的 菌株。
[0032] 經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)：該誘變菌株的乳酸生產(chǎn)速率可以達(dá)到35g/L/d，該菌株經(jīng)過(guò)71小時(shí) 發(fā)酵后乳酸濃度達(dá)到95g/L ;能夠在pH為1. 80的條件下存活。降解亞硝酸鹽速度快，分解 能力達(dá)到9. 8mg/h/kg (自然發(fā)酵過(guò)程亞硝酸鹽積累的速率大約為I. lmg/h/kg)，能夠耐1 % 膽鹽。
[0033] 所述植物乳桿菌菌液的制備：
[0034] (1) 一級(jí)種子培養(yǎng)：將植物乳桿菌CGMCC NO. 9405斜面菌種1-2環(huán)接入500毫升 搖瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100 _升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
[0035] (2)二級(jí)種子培養(yǎng)：將一級(jí)種子按照5%的接種量接入500暈升二級(jí)種子搖瓶中， 種子培養(yǎng)基裝量100暈升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間20小時(shí)；
[0036] (3)三級(jí)種子培養(yǎng)：將二級(jí)種子以8%接種量接入5000暈升三級(jí)種子搖瓶中，種子 培養(yǎng)基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間18小時(shí)；
[0037] (4) 一級(jí)種子罐培養(yǎng)：將三級(jí)種子以10 %接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子 罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度37°C，罐壓0. 05MPa，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)；
[0038] 所述種子培養(yǎng)基組成為：酪蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0. 5%，葡 萄糖〇. 5 %，脫脂牛乳20mL，乳酸鈣1 %，羅漢果提取物1 %，復(fù)合枸杞濃縮汁2 %，余量為 水，ρΗ6· 8 ;
[0039] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨5. 0g，胰蛋白胨5. 0g，脫脂牛乳40mL，葡萄 糖10. 〇g，羅漢果提取物5. 0g，復(fù)合枸杞濃縮汁2. 0g，乳酸鈣0. 5g，NaclO. 2g，軟化水補(bǔ)足 IOOOmL, pH6. 8。
[0040] 所述復(fù)合枸杞濃縮汁可以由以下方法制備：
[0041] 枸杞?jīng)_洗后迅速冷凍至-40-30°C ;升華干燥，真空度400-500Pa，干燥至水分 < 12% ;控制溫度在-10-2°C粉碎至粒徑在I. 5_以下；將枸杞、黃芪和靈芝子實(shí)體粉碎 物混合，添加上述混合物重量3-6倍的檸檬酸水溶液，控制溶液的pH值為4-5,添加混合物 重量0. 5-1 %的復(fù)合酶，所述復(fù)合酶由酸性果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶組成，三種酶的 重量比為2. 5 : 1 : 1.5,酶解溫度為40-48°C，酶解時(shí)間為1.5-2hr;之后將pH值調(diào)整為 5. 1-5. 6,溫度升到50-60°C，同時(shí)添加混合物重量0. 2-0. 5 %的果膠酶、0. 2-1 %的葡聚糖 酶，作用時(shí)間為2. 5-3hr ;酶解液在5-10°C過(guò)濾；濾液冷凍濃縮獲得復(fù)合枸杞濃縮汁；
[0042] 所述枸杞、黃芪、靈芝子實(shí)體的質(zhì)量份數(shù)比為：8 :1 :0. 5。
[0043] 有益效果：
[0044] 長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)培養(yǎng)條件具有嚴(yán)格的選擇性，本發(fā)明將長(zhǎng)雙歧桿菌與植物乳桿菌混 合發(fā)酵，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基，將食品原輔料進(jìn)行篩選并按照特定比例組合，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)基 原料組成復(fù)雜，含有非食品成分，不宜用于食品發(fā)酵的缺陷，通過(guò)控制培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件， 使長(zhǎng)雙歧桿菌與植物乳桿菌產(chǎn)生良好的協(xié)同促進(jìn)作用，提高了長(zhǎng)雙歧桿菌的活菌含量，縮 短了發(fā)酵時(shí)間，并提高了長(zhǎng)雙歧桿菌的發(fā)酵性、耐酸性和耐胃酸性。并且在調(diào)配混合的過(guò)程 中，添加低聚木糖、羅漢果提取物，加強(qiáng)了對(duì)活菌的保護(hù)作用，試驗(yàn)證明，各實(shí)施例保健飲品 在4-10°C保持2小時(shí)后，活菌存活率平均達(dá)到41. 7%。
[0045] 通過(guò)在培養(yǎng)各過(guò)程中添加并補(bǔ)充羅漢果提取物和復(fù)合枸杞濃縮汁，促進(jìn)了植物乳 桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)，菌種的生物活性又能充分發(fā)揮藥食同源物品的保健作用，在利 用天然添加物增進(jìn)口感的同時(shí)，使益生菌與藥食同源物品相輔相成，取得了很好的保健效 果。
[0046] 保健飲料中所含活性益生菌，在人體腸道內(nèi)的定植能力強(qiáng)、定植時(shí)間長(zhǎng)，有效抑制 了腸道有害菌尤其是革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)及繁殖，對(duì)腸道菌群的組成進(jìn)行了有益調(diào)整，從 而益生效果顯著且適宜人群廣泛。
[0047] 通過(guò)耐冷試驗(yàn)、模擬胃液及腸液耐受試驗(yàn)表明，該保健飲品能保持較高的活菌存 活率，其活菌存活率可達(dá)到41. 7-45. 3%，益生性顯著；經(jīng)小鼠腸道性能試驗(yàn)表明：飼喂保 健飲品小鼠體重平均增長(zhǎng)率47. 46%，顯著高于自然恢復(fù)組32. 14% ;飼喂保健飲品后腸道 大腸桿菌數(shù)量顯著下降，平均降低74. 8%，顯著高于自然恢復(fù)組24. 78%，表明本發(fā)明保健 飲品中的益生菌在小白鼠腸道內(nèi)迅速定植，形成優(yōu)勢(shì)菌群，并有效抑制大腸桿菌等病原菌 的生長(zhǎng)繁殖，并且定植時(shí)間長(zhǎng)，能持續(xù)、有效地改善腸道性能。
[0048] 植物乳桿菌CGMCC NO. 9405乳酸生產(chǎn)速率可以達(dá)到35g/L/d，該菌株經(jīng)過(guò)71小時(shí) 發(fā)酵后乳酸濃度達(dá)到95g/L ;能夠在pH為1. 80的條件下存活。與長(zhǎng)雙歧桿菌CICC6068協(xié) 同作用，相互促進(jìn)，使制得的保健飲品益生性能更加優(yōu)越。
[0049] 感官品評(píng)試驗(yàn)也證明了：本發(fā)明制備的含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健 飲品從外觀、香氣、風(fēng)味和口感各方面均明顯優(yōu)于市售同類保健飲品。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 實(shí)施例1
[0051] 一種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，包括如下步驟：
[0052] (1)按以下配方稱取原料，以質(zhì)量計(jì)，羅漢果提取物5%，低聚木糖1%，大豆多糖 0. 1%，大豆蛋白胨0. 2%，脫脂牛乳30%，NaclO. 2%，乳酸鈣0. 5%，復(fù)合枸杞濃縮汁2%， 其余為軟化水；
[0053] 脫脂牛乳95°C，5分鐘單獨(dú)加熱滅菌，備用；
[0054] 軟化水加熱至55°C，依次加入剩余原料溶解并混合均勻后，95°C，15分鐘滅菌，趁 熱加入滅菌的脫脂牛乳，混勻，入?yún)捬醢l(fā)酵罐冷卻，作為發(fā)酵培養(yǎng)液；
[0055] (2)接種植物乳桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為2%;培養(yǎng)溫度35°C，罐 壓0. 02MPa,培養(yǎng)時(shí)間3小時(shí)；
[0056] (3)接種長(zhǎng)雙歧桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為6%，并補(bǔ)加復(fù)合枸杞 濃縮汁2%、羅漢果提取物1% ;培養(yǎng)溫度37°C，罐壓0. 06MPa，培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)，得到發(fā)酵 乳基料，其中植物乳桿菌活菌數(shù)2X 108CFU/mL，長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)3X 101(lCFU/mL ;
[0057] 以質(zhì)量計(jì)，按如下組分：3%。的大豆多糖、維生素 CO. 24%。、羅漢果提取物0. 5%、低 聚木糖2%、葡萄糖6%、發(fā)酵乳基料補(bǔ)足至100%，混合均勻后灌裝得到含羅漢果提取物和 活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品。
[0058] 所述羅漢果提取物制備方法如下：
[0059] 取干羅漢果在110°C，烘烤60min，破碎，加入羅漢果重量10倍的水混勻，之后加入 羅漢果重量0. 5%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5. 8,溫度58 °C，酶解3h，將 酶解液置于配料缸中，邊緩慢攪拌邊用探頭式超聲提取儀在電流強(qiáng)度I. 0A/275W條件下進(jìn) 行超聲提取25min，過(guò)濾，4°C放置12h，再過(guò)濾一次，真空濃縮得到羅漢果提取物；
[0060] 所述混合酶制劑為纖維素酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果膠酶按質(zhì)量比4:3:2:1均勻 混合。
[0061] 所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)tlj_2014,保藏于中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 9405 ;
[0062] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌CICC6068購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0063] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌在種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)三次，以培養(yǎng)基質(zhì)量計(jì)：第一次，按3% 接種量進(jìn)行接種，37°C厭氧培養(yǎng)36h，第二次按4%接種量進(jìn)行接種，37°C厭氧養(yǎng)24h，第三 次按5%接種量進(jìn)行接種，37°C厭氧培養(yǎng)12h，得到長(zhǎng)雙歧桿菌菌液；
[0064] 所述種子培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨5. 0g，胰蛋白胨5. 0g，脫脂牛乳40mL，葡萄糖 10. 〇g，低聚木糖10. 〇g，羅漢果提取物5. 0g，復(fù)合枸杞濃縮汁2. 0g，乳酸媽0· 5g, NaclO. 2g， 軟化水補(bǔ)足IOOOmL, ρΗ6· 8。
[0065] 所述植物乳桿菌菌液的制備：
[0066] (1) 一級(jí)種子培養(yǎng)：將植物乳桿菌CGMCC NO. 9405斜面菌種1-2環(huán)接入500毫升 搖瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100 _升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
[0067] (2)二級(jí)種子培養(yǎng)：將一級(jí)種子按照5%的接種量接入500暈升二級(jí)種子搖瓶中， 種子培養(yǎng)基裝量100暈升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間20小時(shí)；
[0068] (3)三級(jí)種子培養(yǎng)：將二級(jí)種子以8%接種量接入5000暈升三級(jí)種子搖瓶中，種子 培養(yǎng)基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間18小時(shí)；
[0069] (4) 一級(jí)種子罐培養(yǎng)：將三級(jí)種子以10 %接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子 罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度37°C，罐壓0. 05MPa，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)；
[0070] 所述種子培養(yǎng)基組成為：酪蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0. 5%，葡 萄糖〇. 5 %，脫脂牛乳20mL，乳酸鈣1 %，羅漢果提取物1 %，復(fù)合枸杞濃縮汁2 %，余量為 水，ρΗ6· 8 ;
[0071] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨5. 0g，胰蛋白胨5. 0g，脫脂牛乳40mL，葡萄 糖10. 〇g，羅漢果提取物5. 0g，復(fù)合枸杞濃縮汁2. 0g，乳酸鈣0. 5g，NaclO. 2g，軟化水補(bǔ)足 IOOOmL, pH6. 8。
[0072] 所述復(fù)合枸杞濃縮汁由以下方法制備：
[0073] 枸杞?jīng)_洗后迅速冷凍至_40°C ;升華干燥，真空度450Pa，干燥至水分< 12% ;控制 溫度在-KTC粉碎至粒徑在I. 5_以下；將枸杞、黃芪和靈芝子實(shí)體粉碎物混合，添加上述 混合物重量4倍的檸檬酸水溶液，控制溶液的pH值為4. 5,添加混合物重量1 %的復(fù)合酶， 所述復(fù)合酶由酸性果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶組成，三種酶的重量比為2.5 : 1 : 1.5， 酶解溫度為45°C，酶解時(shí)間為2hr ;之后將pH值調(diào)整為5. 4,溫度升到55°C，同時(shí)添加混合 物重量〇. 3%的果膠酶、0. 6%的葡聚糖酶，作用時(shí)間為2. 5hr ;酶解液在5°C過(guò)濾；濾液冷凍 濃縮獲得復(fù)合枸杞濃縮汁；
[0074] 所述枸杞、黃芪、靈芝子實(shí)體的質(zhì)量份數(shù)比為：8 :1 :0. 5。
[0075] 實(shí)施例2
[0076] -種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，包括如下步驟：
[0077] (1)按以下配方稱取原料，以質(zhì)量計(jì)，羅漢果提取物10%，低聚木糖1%，大豆多糖 0. 2%，大豆蛋白胨0. 2%，脫脂牛乳30%，NaclO. 5%，乳酸鈣1%，復(fù)合枸杞濃縮汁2%，其 余為軟化水；
[0078] 脫脂牛乳95°C，5分鐘單獨(dú)加熱滅菌，備用；
[0079] 軟化水加熱至50°C，依次加入剩余原料溶解并混合均勻后，90°C，20分鐘滅菌，趁 熱加入滅菌的脫脂牛乳，混勻，入?yún)捬醢l(fā)酵罐冷卻，作為發(fā)酵培養(yǎng)液；
[0080] (2)接種植物乳桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為3%;培養(yǎng)溫度35°C，罐 壓0. 03MPa,培養(yǎng)時(shí)間3小時(shí)；
[0081] (3)接種長(zhǎng)雙歧桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為6%，并補(bǔ)加復(fù)合枸杞 濃縮汁2%、羅漢果提取物1% ;培養(yǎng)溫度35°C，罐壓0. 04MPa，培養(yǎng)時(shí)間10小時(shí)，得到發(fā)酵 乳基料，其中植物乳桿菌活菌數(shù)I X 108CFU/mL，長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)9. 5 X IO9CFUAiL ;
[0082] 以質(zhì)量計(jì)，按如下組分：蔗糖6%、羅漢果提取物0. 2%、穩(wěn)定劑0. 2%、軟水10%、 發(fā)酵乳基料補(bǔ)足至100%，混合均勻后灌裝得到含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健 飲品。
[0083] 所述羅漢果提取物為本領(lǐng)域常規(guī)產(chǎn)品；
[0084] 所述植物乳桿菌為本領(lǐng)域常用菌種；
[0085] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌CICC6068購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0086] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌菌液制備同實(shí)施例1 ;
[0087] 所述植物乳桿菌菌液的制備：
[0088] (1) -級(jí)種子培養(yǎng)：將植物乳桿菌菌種接入500毫升搖瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100 暈升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)；
[0089] (2)二級(jí)種子培養(yǎng)：將一級(jí)種子按照5%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中， 種子培養(yǎng)基裝量100暈升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間20小時(shí)；
[0090] (3)三級(jí)種子培養(yǎng)：將二級(jí)種子以8%接種量接入5000暈升三級(jí)種子搖瓶中，種子 培養(yǎng)基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間18小時(shí)；
[0091] (4) -級(jí)種子罐培養(yǎng)：將三級(jí)種子以10 %接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子 罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度37°C，罐壓0. 05MPa，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)；
[0092] 所述種子培養(yǎng)基組成為：酪蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0. 5%，葡 萄糖〇. 5 %，脫脂牛乳20mL，乳酸鈣1 %，羅漢果提取物1 %，復(fù)合枸杞濃縮汁2 %，余量為 水，ρΗ6· 8 ;
[0093] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨5. 0g，胰蛋白胨5. 0g，脫脂牛乳40mL，葡萄 糖10. 〇g，羅漢果提取物5. 0g，復(fù)合枸杞濃縮汁2. 0g，乳酸鈣0. 5g，NaclO. 2g，軟化水補(bǔ)足 lOOOmL，pH6. 8。
[0094] 所述復(fù)合枸杞濃縮汁為本領(lǐng)域常規(guī)產(chǎn)品。
[0095] 實(shí)施例3
[0096] 一種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，包括如下步驟：
[0097] (1)按以下配方稱取原料，以質(zhì)量計(jì)，羅漢果提取物1%，低聚木糖1%，大豆多糖 0. 2%，大豆蛋白胨0. 2%，脫脂牛乳30%，NaclO. 3%，乳酸鈣1%，復(fù)合枸杞濃縮汁2%，其 余為軟化水；
[0098] 脫脂牛乳95°C，5分鐘單獨(dú)加熱滅菌，備用；
[0099] 軟化水加熱至60°C，依次加入剩余原料溶解并混合均勻后，100°C，5分鐘滅菌，趁 熱加入滅菌的脫脂牛乳，混勻，入?yún)捬醢l(fā)酵罐冷卻，作為發(fā)酵培養(yǎng)液；
[0100] (2)接種植物乳桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為1 %;培養(yǎng)溫度32°C，罐 壓0. 02MPa,培養(yǎng)時(shí)間3小時(shí)；
[0101] (3)接種長(zhǎng)雙歧桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為6%，并補(bǔ)加復(fù)合枸杞 濃縮汁1%、羅漢果提取物1% ;培養(yǎng)溫度35°C，罐壓0. 04MPa，培養(yǎng)時(shí)間10小時(shí)，得到發(fā)酵 乳基料，其中植物乳桿菌活菌數(shù)I X 108CFU/mL，長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)3. 3 X 101(lCFU/mL ;
[0102] 灌裝得到含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品。
[0103] 所述羅漢果提取物制備方法如下：
[0104] 取干羅漢果在120°C，烘烤40min，破碎，加入羅漢果重量8倍的水混勻，之后加入 羅漢果重量0. 6%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5. 5,溫度55 °C，酶解2h，將 酶解液置于配料缸中，邊緩慢攪拌邊用探頭式超聲提取儀在電流強(qiáng)度0.6A/25W條件下進(jìn) 行超聲提取30min，過(guò)濾，6°C放置10h，再過(guò)濾一次，真空濃縮得到羅漢果提取物；
[0105] 所述混合酶制劑為纖維素酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果膠酶按質(zhì)量比4:3:2:1均勻 混合。
[0106] 所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)tlj_2014,保藏于中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 9405 ;
[0107] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌CICC6068購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0108] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌菌液制備同實(shí)施例1 ;
[0109] 所述植物乳桿菌菌液制備同實(shí)施例1 :
[0110] 所述復(fù)合枸杞濃縮汁為本領(lǐng)域常規(guī)產(chǎn)品。
[0111] 實(shí)施例4
[0112] -種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，包括如下步驟：
[0113] (1)按配方稱取以下原料，以質(zhì)量計(jì)，羅漢果提取物7%，低聚木糖0.8%，大豆 多糖0.2%，大豆蛋白胨0. 1%，脫脂牛乳30%，NaclO. 3%，乳酸鈣1%，復(fù)合枸杞濃縮汁 1. 5%，其余為軟化水；
[0114] 脫脂牛乳95°C，5分鐘單獨(dú)加熱滅菌，備用；
[0115] 軟化水加熱至55°C，依次加入剩余原料溶解并混合均勻后，加熱90°C，5分鐘滅 菌，趁熱加入滅菌的脫脂牛乳，混勻，入?yún)捬醢l(fā)酵罐冷卻，作為發(fā)酵培養(yǎng)液；
[0116] (2)接種植物乳桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為3%;培養(yǎng)溫度37°C，罐 壓0. 03MPa,培養(yǎng)時(shí)間3小時(shí)；
[0117] (3)接種長(zhǎng)雙歧桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為4%，并補(bǔ)加復(fù)合枸杞 濃縮汁1%、羅漢果提取物0. 5% ;培養(yǎng)溫度37°C，罐壓0. 06MPa，培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)，得到發(fā) 酵乳基料，其中植物乳桿菌活菌數(shù)3 X 108CFU/mL，長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)2 X 101(lCFU/mL ;
[0118] 以質(zhì)量計(jì)，按如下組分：2. 5%。的大豆多糖、維生素 CO. 12%。、羅漢果提取物0. 5%、 低聚木糖3%、葡萄糖10%、發(fā)酵乳基料補(bǔ)足至100%，混合均勻后灌裝得到含羅漢果提取 物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品。
[0119] 所述羅漢果提取物制備方法如下：
[0120] 取干羅漢果在100°C，烘烤lOOmin，破碎，加入羅漢果重量9倍的水混勻，之后加入 羅漢果重量0. 4%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6. 0,溫度60°C，酶解4h，將 酶解液置于配料缸中，邊緩慢攪拌邊用探頭式超聲提取儀在電流強(qiáng)度I. 5A/275W條件下進(jìn) 行超聲提取30min，過(guò)濾，5°C放置12h，再過(guò)濾一次，真空濃縮得到羅漢果提取物；
[0121] 所述混合酶制劑為纖維素酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果膠酶按質(zhì)量比4:3:2:1均勻 混合。
[0122] 所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)tlj_2014,保藏于中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 9405 ;
[0123] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌CICC6068購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0124] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌菌液制備同實(shí)施例1 ;
[0125] 所述植物乳桿菌菌液制備同實(shí)施例1 :
[0126] 所述復(fù)合枸杞濃縮汁由以下方法制備：
[0127] 枸杞?jīng)_洗后迅速冷凍至_30°C ;升華干燥，真空度500Pa，干燥至水分< 12% ;控制 溫度在-10°c粉碎至粒徑在I. 5_以下；將枸杞、黃芪和靈芝子實(shí)體粉碎物混合，添加上述 混合物重量3倍的檸檬酸水溶液，控制溶液的pH值為4,添加混合物重量1 %的復(fù)合酶，所 述復(fù)合酶由酸性果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶組成，三種酶的重量比為2.5 : 1 : 1.5,酶 解溫度為40°C，酶解時(shí)間為2hr ;之后將pH值調(diào)整為5. 1，溫度升到50°C，同時(shí)添加混合物 重量0. 2%的果膠酶、0. 2%的葡聚糖酶，作用時(shí)間為3hr ;酶解液在5°C過(guò)濾；濾液冷凍濃縮 獲得復(fù)合枸杞濃縮汁；
[0128] 所述枸杞、黃芪、靈芝子實(shí)體的質(zhì)量份數(shù)比為：8 :1 :0. 5。
[0129] 實(shí)施例5
[0130] 一種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，包括如下步驟：
[0131] (1)按配方稱取以下原料，以質(zhì)量計(jì)，羅漢果提取物8%，低聚木糖0. 8%，大豆多 糖0. 1%，大豆蛋白胨0.2%，脫脂牛乳10%，NaclO. 5%，乳酸鈣0.5%，復(fù)合枸杞濃縮汁 2%，其余為軟化水；
[0132] 脫脂牛乳95°C，5分鐘單獨(dú)加熱滅菌，備用；
[0133] 軟化水加熱至60°C，依次加入剩余原料溶解并混合均勻后，KKTC，20分鐘滅菌， 趁熱加入滅菌的脫脂牛乳，混勻，入?yún)捬醢l(fā)酵罐冷卻，作為發(fā)酵培養(yǎng)液；
[0134] (2)接種植物乳桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為2%;培養(yǎng)溫度35°C，罐 壓0. 025MPa,培養(yǎng)時(shí)間2. 5小時(shí)；
[0135] (3)接種長(zhǎng)雙歧桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為6%，并補(bǔ)加復(fù)合枸杞 濃縮汁2%、羅漢果提取物1% ;培養(yǎng)溫度37°C，罐壓0. 06MPa，培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)，得到發(fā)酵 乳基料，其中植物乳桿菌活菌數(shù)2X 108CFU/mL，長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)3. 5X 101(lCFU/mL ;
[0136] 將發(fā)酵乳基料與兩倍質(zhì)量的軟化水混合均勻后灌裝得到含羅漢果提取物和活性 長(zhǎng)雙歧桿囷的保健飲品。
[0137] 所述羅漢果提取物制備方法如下：
[0138] 取干羅漢果在120°C，烘烤lOOmin，破碎，加入羅漢果重量10倍的水混勻，之后加 入羅漢果重量0. 6 %的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5. 5,溫度60°C，酶解4h， 將酶解液置于配料缸中，邊緩慢攪拌邊用探頭式超聲提取儀在電流強(qiáng)度I. 2A/275W條件下 進(jìn)行超聲提取25min，過(guò)濾，4°C放置10h，再過(guò)濾一次，真空濃縮得到羅漢果提取物；
[0139] 所述混合酶制劑為纖維素酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果膠酶按質(zhì)量比4:3:2:1均勻 混合。
[0140] 所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)tlj_2014,保藏于中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 9405 ;
[0141] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌Cl C C6068購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0142] 所述長(zhǎng)雙歧桿菌菌液制備同實(shí)施例1 ;
[0143] 所述植物乳桿菌菌液制備同實(shí)施例1 ;
[0144] 所述復(fù)合枸杞濃縮汁由以下方法制備：
[0145] 枸杞?jīng)_洗后迅速冷凍至_35°C ;升華干燥，真空度500Pa，干燥至水分< 12% ;控制 溫度在-6°C粉碎至粒徑在I. 5_以下；將枸杞、黃芪和靈芝子實(shí)體粉碎物混合，添加上述混 合物重量6倍的檸檬酸水溶液，控制溶液的pH值為5,添加混合物重量0. 61 %的復(fù)合酶，所 述復(fù)合酶由酸性果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶組成，三種酶的重量比為2.5 : 1 : 1.5,酶 解溫度為46°C，酶解時(shí)間為2hr ;之后將pH值調(diào)整為5. 3,溫度升到56°C，同時(shí)添加混合物 重量〇. 5%的果膠酶、0. 5%的葡聚糖酶，作用時(shí)間為3hr ;酶解液在5°C過(guò)濾；濾液冷凍濃縮 獲得復(fù)合枸杞濃縮汁；
[0146] 所述枸杞、黃芪、靈芝子實(shí)體的質(zhì)量份數(shù)比為：8 :1 :0. 5。
[0147] 試驗(yàn)例1
[0148] 含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的益生性試驗(yàn)
[0149] 以本發(fā)明實(shí)施例1、2、6制備的含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品，進(jìn) 行下述試驗(yàn)：
[0150] 1、將實(shí)施例1、2、6的保健飲品，采用十倍逐級(jí)稀釋至ΚΓ8,取ImL稀釋液在滅菌平 板上，將滅菌后冷卻至45 °C的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注在平板上，迅速搖勻；同時(shí)將在4-10 °C保 持2小時(shí)的各實(shí)施例保健飲品十倍逐級(jí)稀釋至ΚΓ8,取ImL稀釋液在滅菌平板上，將滅菌后 冷卻至45°C的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注在平板上并迅速搖勻；分別在37°C條件下培養(yǎng)24h后計(jì) 數(shù)，將各實(shí)施例冷藏前后結(jié)果分別進(jìn)行對(duì)照。
[0151] 結(jié)果表明，活菌存活率分別達(dá)到了實(shí)施例175%、實(shí)施例260%、實(shí)施例665%，平 均為66. 7%。2、.模擬胃液及腸液的耐受試驗(yàn)：取100g/L的鹽酸16. 4mL加蒸餾水稀釋， 使pH值分別為I. 5、2. 5和3. 5,取IOOmL稀鹽酸溶液，分別加入Ig胃蛋白酶，使其充分溶 解，得模擬胃液，微孔濾膜除菌（〇. 22 μ m)備用。取磷酸二氫鉀6. 8g，加水500mL使溶解， 用0. lm〇L/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 8 ;另取胰蛋白酶10g，加水IOOmL使溶解，將兩液 混合后，加水稀釋至1000ml，得模擬腸液，微孔濾膜除菌（0. 22 μ m)備用。取ImL各實(shí)施例 保健飲品加入到9mL的模擬胃液中，并迅速在振蕩器上充分混勻，然后置于30-45?靜置培 養(yǎng)2-4h。分別在lh、2h、3h、4h的時(shí)候取出培養(yǎng)液并立即計(jì)數(shù)殘存活菌數(shù)，分別與原活菌數(shù) 進(jìn)行比較，結(jié)果表明，活菌存活率分別為實(shí)施例1 55%、實(shí)施例2 35%、實(shí)施例6 46%，平 均為45. 3%。然后取在人工胃液中消化不同時(shí)間的培養(yǎng)液各lmL，分別接種于9mLpH值為 6. 8的人工腸液中，置于30-45°C靜置培養(yǎng)2-4h，并分別在0、3、6、24h取樣，測(cè)定其活菌數(shù)， 與原活菌數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明活菌存活率分別為實(shí)施例1 50%、實(shí)施例2 33%、實(shí)施例6 42%，平均為 41. 7%。
[0152] 試驗(yàn)例2小鼠腸道性能試驗(yàn)
[0153] 以本發(fā)明實(shí)施例1、2、6制備的含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品，做 以下試驗(yàn)；
[0154] 選取普通昆明小白鼠180只，雌雄各半，18_20g，常規(guī)詞養(yǎng)。從中隨機(jī)挑選120只， 每天早晨9:00灌胃鹽酸林可霉素0. 2mL (20mg) /只，其它作為對(duì)照組，每天同一時(shí)間灌胃等 量滅菌生理鹽水，連續(xù)一周，制備腸道菌群失調(diào)的小鼠模型。模型組小鼠飲食下降，未出現(xiàn) 死亡和明顯的腹瀉現(xiàn)象，排軟糞，外形正常含水分較多，墊料潮濕。將120只腸道菌群失調(diào) 小鼠，隨機(jī)分為4組，每組30只，組1、組2、組3作為治療組，每天分別灌胃實(shí)施例1、2、6制 備的保健飲品2ml/只，組4作為自然恢復(fù)組，每天同一時(shí)間灌胃等量滅菌生理鹽水，連續(xù)兩 周。整個(gè)試驗(yàn)期21天，每天觀察小白鼠的生長(zhǎng)和排便情況，于第8、21天對(duì)各組的小鼠進(jìn)行 稱重，計(jì)算各組體重平均增長(zhǎng)率，結(jié)果如表1 ;每5天測(cè)各組小鼠糞便大腸桿菌數(shù)量，計(jì)算平 均數(shù)，結(jié)果如表2。取小鼠糞便約0. lg，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)加入3粒玻璃珠（以0. Ig糞樣加 0. 5mL稀釋液），稀釋并接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，計(jì)算每克濕便中的大腸桿菌數(shù)。
[0155] 各組編號(hào)對(duì)應(yīng)如下：組1一實(shí)施例1、組2-實(shí)施例2、組3-實(shí)施例6、組4一自然 恢復(fù)組
[0156] 表1小鼠增重情況
[0157]
【權(quán)利要求】
1. 一種含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，包括如下步驟： (1) 按以下配方稱取原料：以質(zhì)量計(jì)，羅漢果提取物1-10%，低聚木糖0.5-1%，大 豆多糖0.05-0. 2%，大豆蛋白胨0. 1-0. 2%，脫脂牛乳10-30%，NaclO. 2-0. 5%，乳酸鈣 〇. 5-1 %，復(fù)合枸杞濃縮汁1-2 %，其余為軟化水；將脫脂牛乳95°C，滅菌5分鐘，備用；同 時(shí)，將軟化水加熱至50-60°C，依次加入剩余原料溶解并混合均勻后，90-100°C滅菌5-20分 鐘，加入已滅菌的脫脂牛乳，混勻，入?yún)捬醢l(fā)酵罐冷卻，得到發(fā)酵培養(yǎng)液； (2) 接種植物乳桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為1-3% ;培養(yǎng)溫度32-37°C， 罐壓0. 02-0. 03MPa,培養(yǎng)時(shí)間2-3小時(shí)； (3) 再接種長(zhǎng)雙歧桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為4-6%，并補(bǔ)加復(fù)合枸杞 濃縮汁1-2%、羅漢果提取物0.5-1%;培養(yǎng)溫度35-371：，罐壓0.04-0.061〇^，培養(yǎng)6-10小 時(shí)，得到發(fā)酵乳基料，灌裝或調(diào)配后灌裝。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法， 其特征在于，所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) tlj-2014,保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 9405 ;所述長(zhǎng)雙歧桿菌為 CICC6068。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，其 特征在于，所述羅漢果提取物制備方法如下： 取干羅漢果在100-120°C，烘烤40-100min，破碎，加入羅漢果重量8-10倍的水混勻， 之后加入羅漢果重量0. 4-0. 6%的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5. 5-6. 0,溫度 55-60°C，酶解2-4h，將酶解液置于配料缸中，邊緩慢攪拌邊用探頭式超聲提取儀在電流強(qiáng) 度0. 6A/25W-1. 5A/275W條件下進(jìn)行超聲提取20-30min，過(guò)濾，4-6°C放置10_12h，再過(guò)濾一 次，真空濃縮得到羅漢果提取物； 所述混合酶制劑為纖維素酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果膠酶按質(zhì)量比4:3:2:1均勻混 合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，其 特征在于，所述復(fù)合枸杞濃縮汁由以下方法制備： 枸杞?jīng)_洗后迅速冷凍至-40-30°C ;升華干燥，真空度400-500Pa，干燥至水分< 12% ; 控制溫度在-l〇-2°C粉碎至粒徑在1. 5mm以下；將枸杞、黃芪和靈芝子實(shí)體粉碎物混合， 添加上述混合物重量3-6倍的檸檬酸水溶液，控制溶液的pH值為4-5,添加混合物重量 0. 5-1 %的復(fù)合酶，所述復(fù)合酶由酸性果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶組成，三種酶的重 量比為2. 5 : 1 : 1.5,酶解溫度為40-48°C，酶解時(shí)間為1.5-2hr;之后將pH值調(diào)整為 5. 1-5. 6,溫度升到50-60°C，同時(shí)添加混合物重量0. 2-0. 5 %的果膠酶、0. 2-1 %的葡聚糖 酶，作用時(shí)間為2. 5-3hr ;酶解液在5-10°C過(guò)濾；濾液冷凍濃縮獲得復(fù)合枸杞濃縮汁； 所述枸杞、黃芪、靈芝子實(shí)體的質(zhì)量份數(shù)比為：8 :1 :0. 5。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方 法，其特征在于，所述調(diào)配，按以下配方進(jìn)行，以質(zhì)量計(jì)：2-3%。的大豆多糖、維生素 C 0. 12-0. 24%。、羅漢果提取物0. 5-1%、低聚木糖1-3%、葡萄糖5-10%、發(fā)酵乳基料補(bǔ)足至 100%〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，其 特征在于，所述長(zhǎng)雙歧桿菌菌液制備方法如下： 長(zhǎng)雙歧桿菌在種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)三次，以種子培養(yǎng)基質(zhì)量計(jì)：第一次，接種量 3%，37°C厭氧培養(yǎng)36h，第二次接種量4%，37°C厭氧養(yǎng)24h，第三次接種量5%，37°C厭氧培 養(yǎng) 12h ; 所述種子培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨5. Og，胰蛋白胨5. Og，脫脂牛乳40mL，葡萄糖
10. 〇g，低聚木糖10. 〇g，羅漢果提取物5. Og，復(fù)合枸杞濃縮汁2. Og，乳酸媽0? 5g, NaclO. 2g， 軟化水補(bǔ)足lOOOmL, pH6. 8。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，其 特征在于，所述植物乳桿菌菌液的制備方法如下： (1) 一級(jí)種子培養(yǎng)：將植物乳桿菌CGMCC NO. 9405斜面菌種1-2環(huán)，接入500毫升搖瓶 中，種子培養(yǎng)基裝量1〇〇暈升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)； (2) 二級(jí)種子培養(yǎng)：將一級(jí)種子按照5%的接種量接入500暈升二級(jí)種子搖瓶中，種子 培養(yǎng)基裝量100毫升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間20小時(shí)； (3) 三級(jí)種子培養(yǎng)：將二級(jí)種子以8%接種量接入5000暈升三級(jí)種子搖瓶中，種子培養(yǎng) 基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間18小時(shí)； (4) 一級(jí)種子罐培養(yǎng)：將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，發(fā) 酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度37°C，罐壓0. 05MPa，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，其 特征在于，所述種子培養(yǎng)基組成為：酪蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0. 5%，葡 萄糖〇. 5 %，脫脂牛乳20mL，乳酸鈣1 %，羅漢果提取物1 %，復(fù)合枸杞濃縮汁2 %，余量為 水，pH6. 8 ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨5. 0g，胰蛋白胨5. 0g，脫脂牛乳40mL，葡萄糖
10. 〇g，羅漢果提取物5. 0g，復(fù)合枸杞濃縮汁2. 0g，乳酸鈣0. 5g，NaclO. 2g，軟化水補(bǔ)足 1000mL，pH6. 8。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健飲品的制備方法，包 括如下步驟： (1) 按以下配方稱取原料，以質(zhì)量計(jì)，羅漢果提取物5%，低聚木糖1%，大豆多糖 0. 1%，大豆蛋白胨0. 2%，脫脂牛乳30%，NaclO. 2%，乳酸鈣0. 5%，復(fù)合枸杞濃縮汁2%， 其余為軟化水； 脫脂牛乳95°C，滅菌5分鐘，備用； 軟化水加熱至55°C，依次加入剩余原料溶解并混合均勻后，95°C滅菌15分鐘，加入滅 菌的脫脂牛乳，入?yún)捬醢l(fā)酵罐冷卻并混勻，得到發(fā)酵培養(yǎng)液； (2) 接種植物乳桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為2 % ;培養(yǎng)溫度35°C，罐壓 0. 02MPa,培養(yǎng)時(shí)間3小時(shí)； (3) 接種長(zhǎng)雙歧桿菌菌液，以發(fā)酵培養(yǎng)液質(zhì)量計(jì)：接種量為6%，并補(bǔ)加復(fù)合枸杞濃縮 汁2%、羅漢果提取物1% ;培養(yǎng)溫度37°C，罐壓0. 06MPa，培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)，得到發(fā)酵乳基 料，其中植物乳桿菌活菌數(shù)2 X 108CFU/mL，長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)3 X 101(lCFU/mL ; 以質(zhì)量計(jì)，按如下組分：3%。的大豆多糖、維生素 C0. 24%。、羅漢果提取物0. 5%、低聚木 糖2%、葡萄糖6%、發(fā)酵乳基料補(bǔ)足至100%，混合均勻后灌裝得到含羅漢果提取物和活性 長(zhǎng)雙歧桿囷的保健飲品； 所述羅漢果提取物制備方法如下： 取干羅漢果在110°c，烘烤60min，破碎，加入羅漢果重量10倍的水混勻，之后加入羅漢 果重量0. 5 %的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5. 8,溫度58°C，酶解3h，將酶解 液置于配料缸中，邊緩慢攪拌邊用探頭式超聲提取儀在電流強(qiáng)度1. 0A/275W條件下進(jìn)行超 聲提取25min，過(guò)濾，4°C放置12h，再過(guò)濾一次，真空濃縮得到羅漢果提取物； 所述混合酶制劑為纖維素酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果膠酶按質(zhì)量比4:3:2:1均勻混 合； 所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)tlj_2014 保藏編號(hào)為 CGMCC NO. 9405; 所述長(zhǎng)雙歧桿菌CICC6068購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心； 所述長(zhǎng)雙歧桿菌在種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)三次，以培養(yǎng)基質(zhì)量計(jì)：第一次，接種量 3%，37°C厭氧培養(yǎng)36h，第二次接種量4%，37°C厭氧養(yǎng)24h，第三次接種量5%，37°C厭氧培 養(yǎng)12h，得到長(zhǎng)雙歧桿菌菌液； 所述種子培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨5. 0g，胰蛋白胨5. 0g，脫脂牛乳40mL，葡萄糖
10. 〇g，低聚木糖10. 〇g，羅漢果提取物5. 0g，復(fù)合枸杞濃縮汁2. 0g，乳酸媽0? 5g, NaclO. 2g， 軟化水補(bǔ)足lOOOmL, pH6. 8 ; 所述植物乳桿菌菌液的制備： (1) 一級(jí)種子培養(yǎng)：將植物乳桿菌CGMCC NO. 9405斜面菌種1-2環(huán)接入500毫升搖瓶 中，種子培養(yǎng)基裝量1〇〇暈升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)； (2) 二級(jí)種子培養(yǎng)：將一級(jí)種子按照5%的接種量接入500暈升二級(jí)種子搖瓶中，種子 培養(yǎng)基裝量100毫升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間20小時(shí)； (3) 三級(jí)種子培養(yǎng)：將二級(jí)種子以8%接種量接入5000暈升三級(jí)種子搖瓶中，種子培養(yǎng) 基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間18小時(shí)； (4) 一級(jí)種子罐培養(yǎng)：將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，發(fā) 酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度37°C，罐壓0. 05MPa，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)； 所述種子培養(yǎng)基組成為：酪蛋白胨1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，葡萄 糖0.5%，脫脂牛乳20mL，乳酸鈣1%，羅漢果提取物1%，復(fù)合枸杞濃縮汁2%，余量為 水，pH6. 8 ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨5. 0g，胰蛋白胨5. 0g，脫脂牛乳40mL，葡萄糖
10. 〇g，羅漢果提取物5. 0g，復(fù)合枸杞濃縮汁2. 0g，乳酸鈣0. 5g，NaclO. 2g，軟化水補(bǔ)足 lOOOmL, pH6. 8 ； 所述復(fù)合枸杞濃縮汁由以下方法制備： 枸杞?jīng)_洗后迅速冷凍至-40°C ;升華干燥，真空度450Pa，干燥至水分< 12% ;控制溫度 在-10°C粉碎至粒徑在1. 5_以下；將枸杞、黃芪和靈芝子實(shí)體粉碎物混合，添加上述混合 物重量4倍的檸檬酸水溶液，控制溶液的pH值為4. 5,添加混合物重量1 %的復(fù)合酶，所述 復(fù)合酶由酸性果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶組成，三種酶的重量比為2.5 : 1 : 1.5,酶解 溫度為45°C，酶解時(shí)間為2hr ;之后將pH值調(diào)整為5. 4,溫度升到55°C，同時(shí)添加混合物重 量0. 3%的果膠酶、0. 6%的葡聚糖酶，作用時(shí)間為2. 5hr ;酶解液在5°C過(guò)濾；濾液冷凍濃縮 獲得復(fù)合枸杞濃縮汁； 所述枸杞、黃芪、靈芝子實(shí)體的質(zhì)量份數(shù)比為：8 :1 :0. 5。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9所述制備方法制備的含羅漢果提取物和活性長(zhǎng)雙歧桿菌的保健 飲品。
【文檔編號(hào)】A23C9/133GK104489092SQ201410715715
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】于力欣 申請(qǐng)人:于力欣