一種Rv2645蛋白的制備及其在結(jié)核診斷與重組BCG疫苗中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Rv2645蛋白的制備及其在結(jié)核診斷與重組BCG疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)結(jié)核基因RD10-14區(qū)的Rv2645蛋白不僅具有誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的γ干擾素的能力，而且用于結(jié)核病人血清抗體診斷特別是IgG4亞型的抗體診斷時(shí)與健康人群具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Rv2645蛋白作為結(jié)核分枝桿菌的優(yōu)勢抗原具有誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平細(xì)胞免疫及體液免疫的功能，其可作為結(jié)核病的新型診斷試劑；也可用于結(jié)核病新型重組BCG疫苗或蛋白疫苗，構(gòu)建的能表達(dá)Rv2645蛋白的重組BCG具有抗結(jié)核免疫保護(hù)作用。本發(fā)明證實(shí)了Rv2645蛋白在用于結(jié)核病診斷及重組BCG疫苗時(shí)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，將具有重要的經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】-種Rv2645蛋白的制備及其在結(jié)核診斷與重組BCG疫苗中 的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子微生物學(xué)和感染免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種RV2645蛋白的制備及其 在結(jié)核診斷與重組BCG疫苗中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, M. tb)導(dǎo)致的結(jié)核病 (Tuberculosis，TB)是一種流行廣、危害大的傳染病，與艾滋病、瘧疾并稱為世界三大傳染 病。全球有三分之一的人感染過結(jié)核病，每年死于結(jié)核病者有170多萬人，為防治TB耗去 大量人力、物力。
[0003] 長期以來，結(jié)核病的診斷依賴于結(jié)核菌素皮膚實(shí)驗(yàn)，但是這種方法不能用于區(qū)分 結(jié)核病患者及接種過結(jié)核疫苗BCG的健康人。痰培養(yǎng)雖然是結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其 培養(yǎng)周期長，至少需要一個(gè)星期獲取結(jié)果，而且該實(shí)驗(yàn)必須在嚴(yán)格的生物安全實(shí)驗(yàn)室里 進(jìn)行。痰涂片的抗酸染色雖然簡單易行，但是其靈敏度低（約34%檢出率）。唯一獲準(zhǔn) 用于預(yù)防結(jié)核病、并廣泛使用的疫苗是減毒的牛分枝桿菌制備的卡介苗（BCG，bacillus Calmette-Gue' rin)。多年實(shí)踐表明，BCG僅對兒童有一定保護(hù)作用，對成年人保護(hù)效果差 異很大，其預(yù)防作用從0%?80%不等，這一傳統(tǒng)疫苗的效果受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。BCG是從20世 紀(jì)60年代開始通過培養(yǎng)的方法進(jìn)行傳代和保存的。反復(fù)傳代使BCG -些重要的免疫保護(hù)性 抗原基因發(fā)生變化，當(dāng)年有效預(yù)防肺結(jié)核的BCG菌株已不復(fù)存在。Behr等（Behr MA，Wilson MA, Anderson P, et al. Comparative genomic of BCG vaccines by whole genome DNA microarray [J]. Sciernce, 1996, 284(541) :1520-1523)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn) BCG 較 M. tb 缺失了 RDl_RD16(regions of difference,!?)這16個(gè)基因區(qū)域。近年來許多研究報(bào)道顯 示，恰恰是這些丟失區(qū)域所表達(dá)的蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性。譬如，RDl區(qū)基因中廣為報(bào)道 的丟失基因ESAT-6,該基因所表達(dá)蛋白已被證實(shí)具有很強(qiáng)的免疫原性。后續(xù)的研究證實(shí)， 通過電轉(zhuǎn)技術(shù)將ESAT-6基因插入BCG基因組后能增強(qiáng)免疫保護(hù)作用，這一研究已發(fā)表在 Nature(Pym AS,Brodin P, Mailessi L, et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6confers enhanced protection against tuberculosis. Nature, 2003, 5, 9 (5) : 533-9.)上。但該石開 究僅限于RDl區(qū)，其他RD區(qū)可能亦存在類似于ESAT-6或更強(qiáng)于ESAT-6的優(yōu)勢抗原。但由 于RD1-16基因數(shù)眾多，使得該研究較為困難。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的第一目的在于篩選并制備出結(jié)核桿菌RD10-14區(qū)中的優(yōu)勢抗原蛋白。
[0005] 本發(fā)明的第二目的在于評(píng)價(jià)篩選出的RD13區(qū)的優(yōu)勢目的抗原Rv2645蛋白在結(jié)核 病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。通過ELISA抗體夾心法，檢測健康人與結(jié)核病人在Rv2645抗原特異 性抗體IgG、IgM、IgG2、IgG4上的差異。進(jìn)一步篩選出Rv2645用于結(jié)核病臨床診斷時(shí)最具 特異性的抗體亞型。
[0006] 本發(fā)明的第三目的在于評(píng)價(jià)優(yōu)勢目的抗原Rv2645在結(jié)核病疫苗研究中的潛力及 應(yīng)用價(jià)值，特別是用于重組BCG的抗結(jié)核保護(hù)性效果。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明研究內(nèi)容是采用經(jīng)典分子生物克隆技術(shù)，從GenBank中查RD區(qū)（RD10-14) 基因序列，設(shè)計(jì)引物并從M. tb菌株H37Rv (ATCC 25618)基因組中PCR得到RD區(qū)PCR產(chǎn)物， 將PCR產(chǎn)物構(gòu)建到His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET28a (Invitrogen)上，重組成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 蛋白表達(dá)工程菌大腸桿菌-BL21 (Invitrogen)，利用IPTG (異丙基硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)及 Ni-NTA (瓊脂糖-鎳珠）親和純化獲取表達(dá)純化蛋白，并通過BSA (牛血清蛋白）制作標(biāo)準(zhǔn) 曲線的Bradford方法測量各純化蛋白的濃度。
[0009] 首先將滅活的H37Rv菌株尾靜脈注射BABL/c小鼠，預(yù)免疫小鼠7天，免疫結(jié)束7 天后取脾臟細(xì)胞，將純化的H37Rv菌株RD蛋白分別刺激經(jīng)免疫過的小鼠脾臟細(xì)胞，利用 ELISP0T (酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法）檢測其INF-Y釋放水平。此外，RD蛋白刺激結(jié)核病人PBMC(夕卜 周血單個(gè)核細(xì)胞）釋放的IFN-Y水平通過ELISA (酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）檢測。綜合小鼠和 人的檢測結(jié)果，評(píng)估刺激INF-Y釋放產(chǎn)生較高水平的RD蛋白。將此RD蛋白包被96孔板 利用經(jīng)典的ELISA法檢測其在結(jié)核病人中的抗體水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rv2645不僅在 IFN- Y釋放水平中最高，而且在24位結(jié)核病人與24位健康人血清IgG及IgM抗體檢測中 表現(xiàn)出的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異最大。為了進(jìn)一步證實(shí)該Rv2645蛋白在結(jié)核診斷中的用途和價(jià)值，大 量制備并純化Rv2645蛋白，將檢測樣本量增加到104位結(jié)核病人及104例健康人，檢測的 抗體類型包括IgG、IgM、IgG2、IgG4,同時(shí)加入已有報(bào)道能用于診斷的CFP-IO與ESAT6的 融合蛋白即CE蛋白作為陽性對照。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過SPASS軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CE蛋白在 IgG、IgM及IgG4此三項(xiàng)指標(biāo)在結(jié)核病人和健康人中的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均較Rv2645的小。且 Rv2645的結(jié)核病人及健康人血清IgG2檢測結(jié)果亦具有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CE蛋白無IgG2 的差異。因而證明Rv2645在血清學(xué)結(jié)核診斷的應(yīng)用價(jià)值高于已有報(bào)道的CE蛋白。
[0010] 本發(fā)明的一系列的研究證明RV2645具有較強(qiáng)免疫原性，本研究進(jìn)一步構(gòu)建重組 表達(dá)Rv2645蛋白的重組BCG結(jié)核疫苗。將Rv2645基因構(gòu)建至穿梭質(zhì)粒pMV361 (Biovector Science Lab，Inc)上，通過電轉(zhuǎn)技術(shù)將重組質(zhì)粒pMV361-Rv2645轉(zhuǎn)入BCG(ATCC 35734)感 受態(tài)中，通過卡那抗性篩選、PCR、Western-blot (免疫印跡實(shí)驗(yàn)）、Southern blot (基因探 針印記雜交）驗(yàn)證電轉(zhuǎn)成功。該基因?qū)㈦SPMV361整合于BCG染色體中，在BCG中獲得穩(wěn)定 的表達(dá)且長時(shí)間內(nèi)不會(huì)隨著重組后的BCG傳代而丟失。將重組BCG即rBCG-Rv2645、BCG及 PBS(磷酸鹽緩沖液空白對照組）分別免疫BALB/c小鼠，BCG作為陽性對照組、PBS作為陰 性空白對照組，繼而進(jìn)行結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv (ATCC 25618)氣溶膠攻毒感染。攻毒結(jié) 束后解剖小鼠取肺臟、脾臟做菌落計(jì)數(shù)、抗酸染色、及染色觀察病理損傷程度。最終結(jié)果 顯示，rBCG-Rv2645菌落計(jì)數(shù)低于BCG組，BCG又低于PBS空白對照組，且各差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。綜合抗酸染色、染色的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)rBCG-Rv2645的免疫保護(hù)作用確實(shí)高于BCG 組，證實(shí)了 Rv2645蛋白在預(yù)防結(jié)核病方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
[0011] 一種結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢抗原蛋白，為RD13區(qū)Rv2645蛋白，該蛋白分子量大小約為 15. 6KD，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；該蛋白的編碼基因片段長432bp，其核苷酸序 列如SEQ ID NO. 2所示。經(jīng)篩選實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rv2645蛋白能顯著刺激小鼠及人產(chǎn)生高水平的 結(jié)核特異性的細(xì)胞及體液免疫。目前為止，尚無其蛋白制備及功能的研究報(bào)道。
[0012] 作為結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢抗原的Rv2645蛋白的制備方法，包括如下步驟：
[0013] (1)以結(jié)核分枝桿菌的基因組為模板，使用下述引物擴(kuò)增Rv2645基因；
[0014] 上游引物：5' -AITGGATCCATGACCACCACGC-3'，
[0015] 下游引物：5,-AATAAGCTTCCGCCGGTGTTCGC-3，；
[0016] (2)將Rv2645基因通過限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III構(gòu)建到原核表達(dá)載體 pET28a上得到重組質(zhì)粒pET28a-Rv2645 ;
[0017] (3)再將pET28a-Rv2645轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，通過IPTG誘導(dǎo)和Ni-NTA親和 純化得到Rv2645蛋白。
[0018] 作為結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢抗原的Rv2645蛋白可用于結(jié)核病的診斷。
[0019] Rv2645蛋白能用于制備結(jié)核病T-SPOT的新型診斷試劑，可以用于區(qū)分結(jié)核感染 還是BCG接種。將按上述方法制備得到的Rv2645蛋白去內(nèi)毒素且定量后可作為T-SPOT的 新型診斷試劑，用其刺激病人PBMC利用ELISP0T法檢測INF-Y的釋放水平。其較目前報(bào) 道的ESAT6-CFP10蛋白免疫原性強(qiáng)，刺激INF-Y水平更高。
[0020] Rv2645蛋白也能用于制備結(jié)核病特異IgG4抗體的新型診斷試劑，Rv2645用于檢 測結(jié)核特異性抗體IgG4時(shí)其特異度及靈敏度高達(dá)80%以上。Rv2645為BCG缺失蛋白，當(dāng) 其用于結(jié)核病人的血清學(xué)診斷時(shí)能用于區(qū)分結(jié)核感染還是BCG接種，包括如下步驟：
[0021] (1)將心2645蛋白定量后包被96孔板，1001^/1^，1001117孔。41：，包被過夜或 37 〇C>lh〇
[0022] (2) 2%的BSA封閉：包被板用PBS洗滌兩遍后每孔加入2%的BSA，每孔200 ii L， 37°C，lh。封閉結(jié)束后PBS洗2遍，拍干，ELISA板4°C保存待用。
[0023] (3)樣品孵育：血清樣本用PBS進(jìn)行200倍稀釋后，每孔加入IOOii L，37°C，lh。結(jié) 束后用PBST洗板6遍，拍干。
[0024] (4)孵育抗體：加入帶HRP標(biāo)記的人IgG4抗體按說明書進(jìn)行稀釋。每孔100 ii L， 37°C，lh。結(jié)束后用PBST洗板6遍，拍干。
[0025] (5)加底物顯色：將TMB底物IOOii L，37°C，l_5min ;等待變藍(lán)。
[0026] (6)終止：顯色穩(wěn)定后加入終止液2M的H2SO4溶液50 ii L。
[0027] (7)檢測：當(dāng)終止變黃后，將ELISA板置于酶標(biāo)儀讀取OD值，檢測波長為450nm。 結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)cut off值區(qū)分結(jié)核與非結(jié)核病人。
[0028] Rv2645蛋白作為結(jié)核分枝桿菌的優(yōu)勢抗原可用于結(jié)核病新型重組BCG疫苗或蛋 白疫苗。
[0029] -種結(jié)核病蛋白疫苗，為通過上述方法制備的Rv2645蛋白。
[0030] 一種結(jié)核病新型重組BCG疫苗，為能表達(dá)結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢抗原Rv2645蛋白的重 組BCG，其優(yōu)選通過包含如下步驟的方法制備：
[0031] (1)以結(jié)核分枝桿菌的基因組為模板，使用下述引物擴(kuò)增RV2645基因；
[0032] 上游引物：5, -AITGAAITCATGACCACCACGC-3'，
[0033] 下游引物：5'-AATAAGCTTCCGCCGGTGITCGC-3' ；
[0034] (2)將Rv2645基因通過限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III構(gòu)建到穿梭質(zhì)粒PMV361 中得到重組質(zhì)粒pMV361-Rv2645 ;
[0035] (3)再將pMV361-Rv2645電轉(zhuǎn)到BCG中得到能表達(dá)Rv2645蛋白的重組BCG，驗(yàn)證 成功后從而作為改良的新型重組BCG疫苗。
[0036] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0037] (I) Rv2645利用原核表達(dá)表達(dá)載體表達(dá)，Ni-NTA親和層析進(jìn)行純化，方法簡單，產(chǎn) 量高，且純度較高。Rv2645蛋白較其他部分RD蛋白免疫原性強(qiáng)，刺激INF-Y水平最高。
[0038] (2)重組表達(dá)Rv2645蛋白的BCG疫苗在小鼠結(jié)核桿菌氣溶膠攻毒實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，其 比BCG的免疫保護(hù)作用增強(qiáng)，其抗結(jié)核保護(hù)作用得到了證實(shí)。
[0039] (3)將Rv2645整合于BCG上時(shí)，利用了較為先進(jìn)的電轉(zhuǎn)技術(shù)及穿梭質(zhì)粒pMV361， 該質(zhì)粒能將Rv2645基因整合于BCG染色體上，使其不同于普通質(zhì)粒，不會(huì)在短期傳代內(nèi)丟 失。利于該基因在BCG中的長期穩(wěn)定表達(dá)。
[0040] (4)同時(shí)大樣本的病人血清及健康人血清相應(yīng)抗體實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rv2645在結(jié)核病血 清診斷上具有較高應(yīng)用價(jià)值。特別是Rv2645用于檢測特異性抗體IgG4時(shí)其特異度及靈敏 度高達(dá)80%以上，同時(shí)其與臨床T-Spot診斷相符率達(dá)72%略高于T-Spot自身抗原蛋白成 分（CFP-10及ESAT-6)用于結(jié)核病人抗體IgG4診斷時(shí)的相符率（70% )。此外，Rv2645為 BCG缺失蛋白，當(dāng)其用于結(jié)核病人的血清學(xué)診斷時(shí)能與接種過BCG的健康人區(qū)別開來。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041] 圖1是滅活H37Rv預(yù)免疫小鼠的具體方案示意圖。
[0042] 圖2是RD10-14區(qū)蛋白刺激預(yù)免疫小鼠脾臟細(xì)胞及人PBMC后用ELISP0T及ELISA 法檢測其產(chǎn)生的相應(yīng)IFN- Y水平。A圖為各RD純化蛋白刺激滅活H37Rv預(yù)免疫小鼠的脾 臟細(xì)胞48h后用ELISP0T法檢測其INF- Y釋放水平，其中箭頭所示處為釋放水平前三位的 RD蛋白，分別為Rv2645、Rvl768及Rvl773。PHA(菜豆凝集素）為試劑盒所附淋巴細(xì)胞陽 性刺激物，Ag85B為已有報(bào)道的刺激INF-Y高水平釋放的蛋白，在此作為本實(shí)驗(yàn)的自選陽 性對照；圖中基因代號(hào)為簡寫。B圖為A結(jié)果中部分斑點(diǎn)實(shí)圖。C圖為Rv2645、Rvl768及 Rvl773蛋白刺激結(jié)核病人及健康人PBMC后ELISA法檢測其IFN- Y釋放水平、ConA (刀豆 蛋白）為試劑盒附帶的淋巴細(xì)胞陽性刺激物，其中Rv2645組具有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0043] 圖3是ELISA法檢測Rv2645、Rvl768、Rvl773在24例TB病人及24例健康人中的 相應(yīng)抗體總IgG及IgM水平。A圖為IgG抗體的檢測，其中Rv2645及Rvl768為p = 0? 0236 及p = 0. 0292,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異p〈0. 05,而Rvl773的p = 0. 229。B圖為IgM抗體的檢測， 其中 Rv2645 及 Rvl768 為 p = 0. 0229 及 p = 0. 0394,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 p〈0. 05,而 Rvl773 的p = 0.4789。
[0044] 圖4是Rv2645用于104例結(jié)核病人及104例健康人血清IgG、IgM、IgG2及IgG4 的檢測。其中A為Rv2645的ELSIA檢測的散點(diǎn)圖，B為其相應(yīng)的ROC曲線。Rv2645檢測的 各抗體 P〈〇. 0001，其 ROC 曲線的 AUC 值分別為 0. 7865、0. 7760、0. 6781 及 0. 8205。
[0045] 圖5是CE用于104例結(jié)核病人及104例健康人血清IgG、IgM、IgG2及IgG4的 檢測。其中A為CE的ELSIA檢測的散點(diǎn)圖，B為其相應(yīng)的ROC曲線。CE檢測的p值分別 〈0? 0001、〈0? 001、>0? 05、〈0? 001。其 ROC 曲線的 AUC 值分別為 0? 6936、0. 6516、0. 5419 及 0.6475。
[0046] 圖6是制備Rv2645的兔多克隆抗體用于2例非結(jié)核病人與2例結(jié)核病人肺組織切 片檢測，并以CE作陽性對照（視野為100倍放大）。其中A-D為CE兔多克隆抗體與Rv2645 兔多克隆抗體用于1-2號(hào)非結(jié)核病人的肺臟組織切片檢測作為陰性對照。E-F為CE兔多克 隆抗體與Rv2645兔多克隆抗體用于1-2號(hào)結(jié)核病人肺臟組織切片的檢測。其中箭頭所示 處為陽性棕區(qū)域結(jié)核結(jié)節(jié)（本應(yīng)為棕黃色，非彩圖中為深色區(qū)域）。
[0047] 圖7是BCG電轉(zhuǎn)插入pMV361_Rv2645重組穿梭質(zhì)粒后卡那抗性板篩選板上的典型 單克隆菌落圖。A為電轉(zhuǎn)后rBCG-Rv2645的菌落形態(tài)圖，B為rBCG-Rv2645電轉(zhuǎn)后傳代圖形 態(tài)圖，C為局部放大形態(tài)圖。
[0048] 圖8是rBCG-Rv2645的PCR及WB鑒定圖。A為PCR驗(yàn)證圖，其中1、3泳道分別為 陰陽對照，2為實(shí)驗(yàn)組，Rv2645的片段大小為432bp。B為Western-blot驗(yàn)證圖，其中2, 3 泳道為陰陽性對照，1為實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果顯示，rBCG-Rv2645具有陽性條帶。C-E為利用生物 素標(biāo)記的Rv2645基因探針對提取的rBCG-Rv2645基因組進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證。
[0049] 圖9是重組疫苗rBCG-Rv2645免疫小鼠攻毒后的肺臟（A)及脾臟（B)菌落計(jì)數(shù)。 結(jié)果顯示，rBCG-Rv2645組與BCG及PBS具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0050] 圖10是攻毒后的肺臟HE染色圖。其中PBS組，肺泡結(jié)構(gòu)不完整，箭頭所示處結(jié)節(jié) 較大；BCG較PBS組大為改善，rBCG-Rv2645最完整，結(jié)節(jié)罕見。其中ABC圖為40倍放大， DEF圖為100倍放大的鏡下圖。
[0051] 圖11是攻毒后的脾臟HE染色圖。其中PBS組，箭頭所示處淋巴結(jié)節(jié)邊緣模糊炎 癥較重，BCG較PBS組大為改善，rBCG-Rv2645組淋巴結(jié)節(jié)邊緣整齊界限清楚。其中ABC圖 為40倍放大，DEF圖為100倍放大的鏡下圖。
【具體實(shí)施方式】
[0052] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指 明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0053] 實(shí)施例1RD10-14區(qū)各原核表達(dá)載體pET28a_RDs的構(gòu)建
[0054] I. 1各RD基因引物的設(shè)計(jì)，構(gòu)建所需具體引物見表1 :
[0055] 表1.各RD基因引物序列
【權(quán)利要求】
1. 結(jié)核分枝桿菌RV2645蛋白作為結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢抗原的應(yīng)用，其特征在于：所述的 Rv2645蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 結(jié)核分枝桿菌Rv2645蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 以結(jié)核分枝桿菌的基因組為模板，使用下述引物擴(kuò)增Rv2645基因； 上游引物：5' -ATTGGATCCATGACCACCACGC-3'， 下游引物：5'-AATAAGCTTCCGCCGGTGTTCGC-3' ； (2) 將Rv2645基因通過限制性內(nèi)切酶沒I和"i/?d III構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28a 上得到重組質(zhì)粒pET28a-Rv2645 ; (3) 再將pET28a-Rv2645轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，通過IPTG誘導(dǎo)和Ni-NTA親和純化 得到Rv2645蛋白。
3. 結(jié)核分枝桿菌Rv2645蛋白在制備結(jié)核病T-SP0T的新型診斷試劑中的應(yīng)用。
4. 一種結(jié)核病T-SP0T的新型診斷試劑，其特征在于：將按權(quán)利要求2所述的方法制備 的Rv2645蛋白去內(nèi)毒素得到。
5. 結(jié)核分枝桿菌Rv2645蛋白在制備結(jié)核病特異IgG4抗體的新型診斷試劑中的應(yīng)用。 6. Rv2645蛋白作為結(jié)核分枝桿菌的優(yōu)勢抗原在結(jié)核病新型重組BCG疫苗或蛋白疫苗 中的應(yīng)用。
7. -種結(jié)核病蛋白疫苗，其特征在于：為按權(quán)利要求2所述的方法制備的Rv2645蛋 白。
8. -種結(jié)核病新型重組BCG疫苗，其特征在于：為能表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Rv2645蛋白的 重組BCG。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的結(jié)核病新型重組BCG疫苗，其特征在于通過包含如下步驟的 方法制備得到： (1) 以結(jié)核分枝桿菌的基因組為模板，使用下述引物擴(kuò)增Rv2645基因； 上游引物：5' -ATTGAATTCATGACCACCACGC-3'， 下游引物：5'-AATAAGCTTCCGCCGGTGTTCGC-3' ； (2) 將Rv2645基因通過限制性內(nèi)切酶feoR I和班/?d III構(gòu)建到穿梭質(zhì)粒pMV361中得 到重組質(zhì)粒pMV361-Rv2645 ; (3) 再將pMV361-Rv2645電轉(zhuǎn)到BCG中得到能表達(dá)Rv2645蛋白的重組BCG。
【文檔編號(hào)】C12N15/31GK104292315SQ201410582674
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】章曉聯(lián), 羅微, 屈子璐 申請人:武漢大學(xué)