一種獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體及其構(gòu)建方法，獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體是在含有g(shù)EL與gER的pUC19/HEK-gE重組質(zhì)粒中的gEL與gER之間插入含2個(gè)CMV啟動(dòng)、分別位于2個(gè)CMV啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)以及1個(gè)BGH?pA信號(hào)序列的雙基因表達(dá)盒獲得的。本發(fā)明利用2個(gè)啟動(dòng)子獨(dú)立表達(dá)兩個(gè)外源基因，能用于構(gòu)建獨(dú)立表達(dá)兩個(gè)外源基因的重組偽狂犬病毒。
【專利說明】一種獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體及其構(gòu)建 方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及屬于動(dòng)物病毒基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽 狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病是由偽狂犬病毒（pseudorabies virus，簡稱PRV)感染豬、牛、羊、犬、貓、 家兔、小鼠、水貂、狐等多種家畜和野生動(dòng)物引起的急性傳染病，豬是該病毒的貯存者和傳 播者。除豬以外的其它動(dòng)物呈散發(fā)形式，發(fā)病后通常具有發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎等癥狀，均 為致死性感染。該病對(duì)豬呈爆發(fā)流行，主要導(dǎo)致母豬繁殖障礙和新生仔豬大量死亡。PRV - 般經(jīng)鼻咽部感染動(dòng)物，并在感染局部的粘膜內(nèi)增殖，然后經(jīng)淋巴循環(huán)或神經(jīng)纖維移行，一般 認(rèn)為病毒經(jīng)神經(jīng)通路到達(dá)腦而引起中樞神經(jīng)功能紊亂，或在嗅球，三叉神經(jīng)中建立潛伏感 染。
[0003] 偽狂犬病毒的基因組為線狀雙鏈DNA，長約150kb，G+C含量高達(dá)74%，整個(gè)基因 組至少編碼70?100個(gè)蛋白，其中胸苷激酶（Thymidine Kinase, TK)基因位于UL區(qū)，全長 963bp，編碼320個(gè)氨基酸，催化脫氧胸昔磷酸化。TK基因與是偽狂犬病毒的一個(gè)主要毒力 基因，也與病毒的潛伏感染有關(guān)。除了 TK基因外，與偽狂犬病毒毒力有關(guān)的基因還有g(shù)G、 gE等。TK、gG、gE和gl基因都是病毒增殖所非必需的，缺失這些基因的病毒株與野毒株一 樣能正常增殖，而且不存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。但突變病毒株仍具有很好的免疫原性，接種動(dòng) 物后可產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)，但是不產(chǎn)生抗gG、gE、gl工糖蛋白的抗體，因此可以作 為區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物的一個(gè)標(biāo)志，有利于建立無偽狂犬病感染的豬群，為 最終根除該病提供有用的工具。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)在自主分離鑒定的偽狂犬病病毒強(qiáng)毒Ea株 的基礎(chǔ)上，通過DNA重組技術(shù)將主要毒力基因 TK、非必需糖蛋白基因 gG或gE、gl缺失，構(gòu) 建了一系列的重組突變毒株用于偽狂犬病的根除。但是目前還沒有一種可以用于偽狂犬病 毒的通用轉(zhuǎn)移載體。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬 病毒通用轉(zhuǎn)移載體，利用2個(gè)啟動(dòng)子獨(dú)立表達(dá)兩個(gè)外源基因，能用于構(gòu)建獨(dú)立表達(dá)兩個(gè)外 源基因的重組偽狂犬病毒。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體的 構(gòu)建方法。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體，其是在含有g(shù)EL與gER的 pUC19/HEK-gE重組質(zhì)粒中的gEL與gER之間插入含2個(gè)CMV啟動(dòng)子、分別位于2個(gè)CMV啟 動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)以及1個(gè)BGH pA信號(hào)序列的雙基因表達(dá)盒。
[0008] 作為優(yōu)選的方案，本發(fā)明所述的雙基因表達(dá)盒的全長基因序列為SEQ ID NO. 1。
[0009] 優(yōu)選的，所述表達(dá)盒在gEL與gER之間的Xba I位點(diǎn)插入。
[0010] 本發(fā)明的方案中還包括含有所述的獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體 的宿主細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建方法，其 具體步驟為：
[0012] 1)采用PCR法從PRV基因組DNA擴(kuò)增獲得同源重組臂gEL和gER ;
[0013] 2)將步驟1)中的再克隆至平端化消除了 Hind III和EcoR I位點(diǎn)的pUC19/HE載 體，獲得pUC19/HE-gE，然后平端化消除Κρη I位點(diǎn)，獲得pUC19/HEK-gE重組質(zhì)粒；
[0014] 3)合成含2個(gè)CMV啟動(dòng)、分別位于2個(gè)CMV啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)以及1個(gè)BGH pA信號(hào)序列的Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA雙基因表達(dá)盒；
[0015] 4)將 Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA雙基因表達(dá)盒克隆插入 pUC19/HEK-gE 重組質(zhì) 粒的gEL和gER之間的Xba I位點(diǎn)。
[0016] 上述方法，步驟3中Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA雙基因表達(dá)盒的合成方法為： 利用DNAClub軟件分析gEL、gER、pUC19、CMV啟動(dòng)子Pcmv及BGH pA信號(hào)各序列中的限制性 酶切位點(diǎn)，合成PcmV+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA的雙基因表達(dá)盒；其中，MCS1限制性酶切位 點(diǎn)依次為：Hind III、Spe I、Mlu I、EcoR V、Bgl II、Not I、Bal I、Pst I，MCS2 限制 性酶切位點(diǎn)依次為：Sal I、Kpn I、Stu I、EcoR I、Cla I、Hpa I、BamH I、Acc III、 Nru I、Xho I。
[0017] 在本發(fā)明中，所述Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA雙基因表達(dá)盒的合成方法還包括 在Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA雙基因表達(dá)盒兩端引入Xba I位點(diǎn)。
[0018] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 1.本發(fā)明所述的獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體中同源重組臂gEL 和gER有效地與PRV基因組DNA中的同源序列發(fā)生重組；
[0020] 2.本發(fā)明所述的獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體多克隆位點(diǎn)在載體 中均為單一酶切位點(diǎn)，符合多克隆位點(diǎn)的要求，可供外源基因的插入；
[0021] 3.本發(fā)明所述的獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體中的兩個(gè)Pcmv能同 時(shí)獨(dú)立地有效啟動(dòng)位于其下游的基因的表達(dá)。
[0022] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明中轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建過程及表達(dá)能力鑒定過程示意圖。
[0024] 圖2為同源重組臂gEL和gER的擴(kuò)增結(jié)果，其中A :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；B :gEL的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；C :gER的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0025] 圖3為pUC19/HE-gE酶切鑒定結(jié)果，其中A :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；B :Kpn I +Xba I 雙酶切結(jié)果；C :Xba I +Sph I雙酶切結(jié)果。
[0026] 圖4為pUC19-gE/EGFP轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后的熒光觀察，其中A :PUC19-gE/EGFP轉(zhuǎn)然 后的BHK細(xì)胞；B :PUC19/HEK-gE轉(zhuǎn)染后的BHK細(xì)胞。
[0027] 圖5為重組病毒PRV/gE_/EGFP+感染ST細(xì)胞熒光觀察，其中A :可見光下觀察的 細(xì)胞病變；B :紫外光下觀察的細(xì)胞病變。
[0028] 圖6為pgE_CMV2酶切鑒定結(jié)果，其中M :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1?3 :Xba I酶切結(jié) 果。
[0029] 圖7為pgE_CMV2多克隆位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶單酶切鑒定結(jié)果，其中M :DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)；1?18分別為MCS1與MCS2各限制性內(nèi)切酶依次單酶切。
[0030] 圖 8 為 pgE-EGFPl/DsRed2 及 pgE-EGFPl、pgE-DsRed2 轉(zhuǎn)染 BHK 細(xì)胞后的熒光觀 察，其中A :pgE-EGFPl轉(zhuǎn)染后的BHK細(xì)胞；B :PgE-EGFPl/DsRed2轉(zhuǎn)染后的BHK細(xì)胞；C : pgE-DsRed2轉(zhuǎn)染后的BHK細(xì)胞。
[0031] 圖 9 為 pgE_CMV2 圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下是本發(fā)明中選取的一個(gè)具體的實(shí)施例，以此來說明本發(fā)明。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 一種獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體，其是在含有g(shù)EL與gER的 pUC19/HEK-gE質(zhì)粒載體中的gEL與gER之間的Xba I位點(diǎn)插入含2個(gè)CMV啟動(dòng)、分別位于 2個(gè)CMV啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)以及1個(gè)BGH pA信號(hào)序列的雙基因表達(dá)盒，其具體構(gòu)建 過程如下：
[0035] 1)采用PCR法從PRV基因組DNA擴(kuò)增獲得同源重組臂gEL和gER :
[0036] 參考GenBank中已發(fā)表的豬偽狂犬病毒基因組序列，設(shè)計(jì)以下三對(duì)引物：
[0037] P1(SEQ ID NO. 2) :5-ATTGGTACCGCTGCTGTTCGTCTCGCG-3 為 gEL 上游引物，5'-端 引入Κρη I位點(diǎn)；
[0038] P2(SEQ ID NO. 3) :5-GTCTCTAGAAGGGACTCGGGACCTCG-3 為 gEL 下游引物，5'-端 引入Xba I位點(diǎn)；
[0039] P3(SEQ ID NO. 4) :5-GTCTCTAGAATCTGGACGTTCCTGCCC-3 為 gER 上游引物，5'-端 引入Xba I位點(diǎn)；
[0040] P4(SEQ ID NO. 5) :5-ATTGCATGCATCACGAAGGAGCCCAGC-3 為 gER 下游引物，5，-端 引入Sph I位點(diǎn)；
[0041] P5(SEQ ID NO. 6) :5-ATGCGGCCCTTTCTGCTGCG-3 為檢測(cè) gE 基因的上游引物；
[0042] P6(SEQ ID NO. 7) :5-TGCAGCGTGTAGAGGCCCGT-3 為檢測(cè) gE 基因的下游引物；
[0043] 以PRV基因組DNA為模板，分別用上述引物P1與P2、P3與P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得 的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳，可分別觀察到957bp的gEL和1014bp的gER條帶，結(jié)果見圖2 ;將兩個(gè) 同源重組臂gEL與gER的PCR產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切后回收。；
[0044] 2)將步驟1)中的gEL與gER再克隆至經(jīng)平端化消除Hind III與EcoR I位點(diǎn)的 PUC19/HE載體，再平端化消除Κρη I位點(diǎn)后，獲得pUC-gE-HEK重組質(zhì)粒：
[0045] 先后用Hind III和EcoR I酶切pUC19,補(bǔ)平后連接消除Hind III和EcoR I位點(diǎn)， 獲得PUC19/HE ;用Κρη I與Xba I、Xba I與Sph I分別雙酶切g(shù)EL與gER的PCR產(chǎn)物，分 別回收951bp的gEL和1008bp的gER ;先將gEL克隆至相同酶切的pUC19/HE，獲得pUC19/ HE-gEL，然后將gER克隆至經(jīng)相應(yīng)酶切的pUC19/HE-gEL，獲得重組質(zhì)粒pUC19/HE-gE，酶切 鑒定結(jié)果如圖3 ;用Κρη I酶切pUC19/HE-gE，酶切后對(duì)末端補(bǔ)平，然后連接，以消除載體中 的Κρη I位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pUC19/HEK-gE，其中同源重組臂gEL與gER的序列為SEQ ID NO. 8 ：
[0046] acggccagtgattattcgagctcgc
[0047] Rctgctgttcgtctcgcgcccggcctcgggggacgcggggtcgtacgtgctgcgggtccgcgtgaacgg gaccacggacctctttgtgctgacggccctggtgccgccgagggggcgccccgtccccacgtcgccgtccgcggacg agtgccggcccgtcgtcggatcgtggcacgacagcctgcgcgtcgtggaccccgccgaggacgccgtgttcaccacc cagcccccgcccgagcccgagccgccgacgacccccgcgcccccccgggggaccggcgccacccccgagccccgatc ggacgaggaggaggaggagggtgacgcggagacgacgacgccgacgacgaccccggcgcccgggaccctggacgcga acggcacgatggtgctgaacgccagcgtcgtgtcgcgcgtcctgctcgccgccgccaacgccacggcgggcgcccgg agccccgggaagatagccatggtgctggggcccacgatcgtcgtcctcctgatcttcttgggcgggatcgcctgcgt RRCccggcgctgcgcgcggaatcgcatctaccggccgcgacccgggcgcggatcggcggtccatgcggcgcccccgc gacgcccgccccccaaccccgtcgccggggcgcccgtcccccagcccaagatgacgttggccgagctgcgccagaag ctcgccaccatcgcagaagaacaataaaaaggtggtgtttgcataattttgtgggtggcgttttatctccgtccgcg ccgttttaaacctgggcacccccgcgagtctcgcacacaccggggttgagaccatgcggccctttctgctgcgcgcc gcgcagctcctggcgctgctggccctggcgctctccaccgaggccccgagcctctccgccgagacgaccccgggccc cgtcaccgaggtcccaagtccct (同源重組 gEL· 序歹丨J )
[0048] TCTAGA(Xba I 位點(diǎn)）
[0049] atctggacgttcctgcccgtccgcggctgcgacgccgtgtcggtgaccacggtgtgcttcgagaccgcg tgccacccggacctggtgctgggccgcgcctgcgtccccgaggccccggagatgggcatcggcgactacctgccgcc cgaggtgccgcggctccggcgcgagccgcccatcgtcaccccggagcggtggtcgccgcacctgagcgtcctgcggg ccacgcccaacgacacgggcctctacgcgctgcacgacgcctcggggccgcgggccgtgttctttgtggcggtgggc gaccggccgcccgcgccggcggacccggtgggccccgcgcgccacgagccccgcttccacgcgctcggcttccactc gcagctcttctcgcccggggacacgttcgacctgatgccgcgcgtggtctcggacatgggcgactcgcgcgagaact ttaccgccacgctggactggtactacgcgcgcgcgcccccgcggtgcctgctgtactacgtgtacgagccctgcatc taccacccgcgcgcgcccgagtgcctgcgcccggtggacccggcgtgcagcttcacctcgccggcgcgcgcgcggct ggtggcgcgccgcgcgtacgcctcgtgcagcccgctgctcggggaccggtggctgaccgcctgccccttcgacgcct tcggcgaggaggtgcacacgaacgccaccgcggacgagtcggggctgtacgtgctcgtgatgacccacaacggccac gtcgccacctgggactacacgctcgtcgccaccgcggccgagtacgtcacggtcatcaaggagctgacggccccggc ccgggccccgggcaccccgtggggccccggcggcggcgacgacgcgatctacgcggacggcgtcacgacgccggcgc cgcccgcgcgcccgtggaacccgtacggccggacgacgcccgggcggctgtttgtgctggcgctgggctccttcgtg atg(同源重組gER序列）
[0050] catgcaagctagctggcgtaatcatgt ；
[0051] 3)合成將含2個(gè)CMV啟動(dòng)、分別位于2個(gè)CMV啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)以及1個(gè) BGH pA信號(hào)序列的Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA雙基因表達(dá)盒：
[0052] 利用DNAClub軟件分析gEL、gER、pUC19、CMV啟動(dòng)子（Pcmv)及BGH pA信號(hào)各序列 中的限制性酶切位點(diǎn)，合成PcmV+MCSl+PcmV+MCS2+BGH pA的雙基因表達(dá)盒，其全長序列為 SEQ ID NO. 1 ;其中，MCS1 限制性酶切位點(diǎn)依次為：Hind III、Spe I、Mlu I、EcoR V、Bgl II、Not I、Bal I、Pst I，MCS2 限制性酶切位點(diǎn)依次為：Sal I、Κρη I、Stu I、EcoR I、Cla I、Hpa I、BamH I、Acc III、Nru I、Xho I ;
[0053] SEQ ID NO. 1 序列如下：
[0054] RRctctagatatacgcgttgacattgattattgacaagttattaatagtaatcaattacggggtcatta gttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgg agtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaat gacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgt attagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggg gatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgt cgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggttt agtgaaccgtcagatc(Pcmv)
[0055] actggctaaccg
[0056] aagcttactagtacgcgtgatatcagatctgcggccgctggccactgcag(MCS1)
[0057] acgactgatcag
[0058] taatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacg gtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaac gccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgt atcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacc ttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagta catcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgt tttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgt gtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatc(Pcmv)
[0059] actggctaacca
[0060] Rtcgacggtaccaggcctgaattcatcgatgttaacggatcctccggatcgcgactcgag(MCS2)
[0061] tcaagatcgact
[0062] Ratcagcctaggctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttga ccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcat tctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgc ggtgggctctatataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgtctagaagt(BGH pA)
[0063] 4)構(gòu)建能獨(dú)立表達(dá)雙基因的重組偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體pgE_CMV2 :
[0064] 將合成的 Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGHpA 雙基因表達(dá)盒克隆至 pUC19/HEK-gE 中 gEL與gER之間的Xba I位點(diǎn)，構(gòu)建能獨(dú)立表達(dá)雙基因的重組偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體 pgE-CMV2，Xba I酶切鑒定結(jié)果見圖6,表明Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGHpA雙基因表達(dá)盒成 功克隆至pUC19/HEK-gE中，pgE-CMV2質(zhì)粒圖譜見圖9。
[0065] 檢測(cè)鑒定
[0066] 1.同源重組臂gEL和gER重組效力鑒定
[0067] 本發(fā)明還涉及將含EGFP的表達(dá)盒克隆至pUC19/HEK-gE的gEL和gER之間，獲得 pUC19-gE/EGFP，如圖4所示，將該載體與PRV基因組DNA共轉(zhuǎn)染能成功拯救重組PRV/gE-/ EGFP+，如圖5所示，證明同源重組臂能有效地與PRV基因組DNA中的同源序列進(jìn)行重組。
[0068] 2. pgE-CMV2多克隆位點(diǎn)的鑒定
[0069] 利用MCS位點(diǎn)中的限制性內(nèi)切酶逐一對(duì)其進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物電泳后，觀察酶 切后片段大小，結(jié)果見圖7。
[0070] 圖7的結(jié)果表明逐一用多克隆位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶單獨(dú)消化pgE_CMV2,每個(gè)限制 性內(nèi)切酶消化后均為單一的、大小約為6200bp的片段，表明多克隆位點(diǎn)的在載體中均為單 一酶切位點(diǎn)，符合多克隆位點(diǎn)的要求，可供外源基因的插入。
[0071] 3. pgE_CMV2特異性表達(dá)鑒定
[0072] 用表1中引物擴(kuò)增EGFP基因，經(jīng)Spe I與Pst I消化后，將其克隆至pgE_CMV2的 MCS1，轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，確定其能被有效表達(dá)后，將DsRed基因繼續(xù)克隆至MCS2,轉(zhuǎn)染BHK21 細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到EGFP基因和DsRed基因表達(dá)后的特異性熒光。
[0073] 表1 :EGFP與DsRed基因擴(kuò)增引物
[0074]
【權(quán)利要求】
1. 一種獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體，其特征在于：其是在含有g(shù)EL與 gER的pUC19/HEK-gE重組質(zhì)粒中的gEL與gER之間插入含2個(gè)CMV啟動(dòng)子、分別位于2個(gè) CMV啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)以及1個(gè)BGH pA信號(hào)序列的雙基因表達(dá)盒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體，其特征在于： 所述雙基因表達(dá)盒的全長基因序列為SEQ ID NO. 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體，其特征在于： 所述表達(dá)盒在gEL與gER之間的Xba I位點(diǎn)插入。
4. 含有如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體的 宿主細(xì)胞。
5. -種如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的獨(dú)立表達(dá)雙基因的偽狂犬病毒通用轉(zhuǎn)移載體的 構(gòu)建方法，其特征在于，其具體步驟為： 1) 采用PCR法從PRV基因組DNA擴(kuò)增獲得同源重組臂gEL和gER ; 2) 將步驟1)中的再克隆至？此19載體，并經(jīng)酶切補(bǔ)平消除把11(11114(3〇1?1及邱111 獲得pUC19/HEK-gE重組質(zhì)粒； 3) 合成將含2個(gè)CMV啟動(dòng)、分別位于2個(gè)CMV啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)以及1個(gè)BGH pA信號(hào)序列的Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA雙基因表達(dá)盒； 4) 將Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA雙基因表達(dá)盒克隆插入pUC19/HEK-gE重組質(zhì)粒的 gEL和gER之間。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1)的具體過程如下：以細(xì)胞培 養(yǎng)物中抽提的PRV基因組DNA作模板，PCR擴(kuò)增出兩個(gè)同源重組臂gEL和gER，經(jīng)相應(yīng)限制 性內(nèi)切酶消化后先后定向克隆至經(jīng)酶切補(bǔ)平消除Hindm和E C0RI位點(diǎn)的pUC19/HE，獲得 pUC19/HE-gE，經(jīng)平端化消除Κρη I位點(diǎn)，獲得pUC19/HEK-gE重組質(zhì)粒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟3中）Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH PA雙基因表達(dá)盒的合成方法為：利用DNAClub軟件分析gEL、gER、pUC19、CMV啟動(dòng)子Pcmv 及BGH pA信號(hào)各序列中的限制性酶切位點(diǎn)，合成Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA的雙基因 表達(dá)盒；其中，MCS1限制性酶切位點(diǎn)依次為：Hind III、Spe I、Mlu I、EcoR V、Bgl II、 Not I、Bal I、Pst I，MCS2 限制性酶切位點(diǎn)依次為：Sal I、Kpn I、Stu I、EcoR I、 Cla I、Hpa I、BamH I、Acc III、Nru I、Xho I。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，上述合成方法還包括在 Pcmv+MCSl+Pcmv+MCS2+BGH pA雙基因表達(dá)盒兩端引入Xba I位點(diǎn)。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104195156SQ201410396024
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】黃紅亮, 陳瑞愛, 何玲, 謝小雨, 任常寶 申請(qǐng)人:肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司, 廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司