一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法。該方法包括（1）樣品采集；（2）培養(yǎng)基制備；（3）截取吸頭的制備；（4）共培養(yǎng)菌株的制備；（5）絲狀真菌分離及共培養(yǎng)；（6）抗菌活性菌株篩選。本發(fā)明方法通過共培養(yǎng)的方式快速地篩選抗菌活性絲狀真菌，與純種培養(yǎng)篩選抗菌活性絲狀真菌相比，可以增加新穎抗菌活性菌株及抗菌活性物質(zhì)的篩選幾率，并且整個篩選過程快速，操作簡單，能夠快速、直觀、高效的篩選到抗菌活性的絲狀真菌，為抗菌活性絲狀真菌的篩選研究提供了極大方便。
【專利說明】一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物的快速分離方法，更具體的說是一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗生素的長期廣泛使用導致耐藥性病原細菌種類增加，甚至出現(xiàn)“超級細菌”，新的感染性疾病也不斷涌現(xiàn)，致使新型抗菌物質(zhì)的研究與開發(fā)迫在眉睫(李越中，陳琦.海洋微生物資源及其產(chǎn)生生物活性代謝產(chǎn)物的研究，生物工程進展，2000，20 (5): 28-31)。一直以來，放線菌被認為是活性次級代謝產(chǎn)物的最主要來源，但是近期的研究表明，絲狀真菌產(chǎn)活性次級代謝產(chǎn)物的潛力也非常巨大，因此篩選絲狀真菌活性次級代謝產(chǎn)物成為研究熱點(朱偉明，王俊鋒.海洋真菌生物活性物質(zhì)研究之管見，菌物學報，2011，30 (2):218-228)
微生物活性次級代謝產(chǎn)物的篩選方法是制約新穎活性次級代謝產(chǎn)物篩選效率的關(guān)鍵步驟。分子生物學技術(shù)快速發(fā)展，通過構(gòu)建宏基因組文庫篩選新型天然產(chǎn)物可以避開微生物的分離過程，擴大了天然產(chǎn)物篩選范圍。但是，目前環(huán)境大片段DNA的提取困難、基因在宿主細胞中不表達或表達量低、無法進行高通量的活性物質(zhì)篩選等問題制約了宏基因組文庫的實用性。通過化學修飾或全化學合成可以獲得新穎抗生素，但是合成過程復雜，且造成環(huán)境污染。通過基因組發(fā)掘可以提高天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)效率，但是天然產(chǎn)物基因簇的功能鑒定一直是尚未解決的難題(白林泉，鄧子新.微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇與藥物創(chuàng)新，中國抗生素雜志，2006，31(2): 80-86)。由此可見，對微生物進行調(diào)查，篩選新型次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌株，仍 然是一種重要的開發(fā)新型抗生素的途徑。
[0003]近期研究表明，兩種或多種微生物的共培養(yǎng)可以刺激微生物產(chǎn)生新穎的次級代謝產(chǎn)物，對新穎物質(zhì)的開發(fā)有重要意義，提供了通過共培養(yǎng)提高新穎抗菌物質(zhì)的篩選效率的可能性。(黃兵，劉寧，黃英，陳勁春.放線菌與枯草芽孢桿菌的共培養(yǎng)及其對活性次生代謝產(chǎn)物的影響，生物工程學報，2009，25(6): 932-940)。但是，目前對新穎抗菌物質(zhì)的篩選方法多以單一的純菌種進行的篩選方法。通過共培養(yǎng)篩選新穎抗菌物質(zhì)產(chǎn)生絲狀真菌，按傳統(tǒng)方法，首先分離絲狀真菌，對所有菌株和其它菌株共同液體培養(yǎng)發(fā)酵，制備發(fā)酵上清液或發(fā)酵液有機溶劑萃取液，進一步用濾紙片法、管碟法、打孔法測定抑菌活性(李小俊，成麗霞，吳彥彬，邊艷青.拮抗菌抗菌譜及發(fā)酵液拮抗能力測定的新方法，生物技術(shù)，2007，17(1): 55-58)。該方法成本高，周期長，勞動強度大。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種成本低、操作簡單、周期短、效率高的通過共培養(yǎng)方式篩選抗菌活性絲狀真菌的方法。
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法，其特點是:(1)樣品采集:用無菌取樣瓶采集水樣及土樣，迅速送至實驗室，4°c保存；
(2)培養(yǎng)基制備:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:牛肉膏3g，蛋白胨IOg,NaCl 5g，蒸餾水1000 ml,pH7.2 ;PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000 ml,自然pH ;若制備固體培養(yǎng)基平板，添加瓊脂20g/L ;121°C滅菌20min，待溫度降至60°C，加入過濾除菌的鏈霉素和氨芐青霉素至終濃度分別為100 mg/ml和50 mg/ml，混勻后倒平板；若分離是海洋樣品則上述培養(yǎng)中配制過程中，用海水代替蒸餾水；
(3)截取吸頭的制備:取Iml移液器吸頭，以寬口端為準，截取12_，其余部分鋸掉，邊緣打磨光滑，121°C滅菌20min ；
(4)共培養(yǎng)菌株的制備:從斜面中挑取AscAericAiacoli保存菌種,在厚度約為3mm營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線，37°C倒置培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落；用截取吸頭的窄口端在Escherichia coli單菌落上打孔,使coli單菌落及培養(yǎng)基進入吸頭內(nèi)；
(5)絲狀真菌分離及共培養(yǎng):將所取樣品進行梯度稀釋，取50μ L不同稀釋度的稀釋液涂布在厚度約為4mm的PDA平板。30°C倒置培養(yǎng)l_5d，在絲狀真菌菌落形成初期，即菌落直徑小于截取吸頭寬口端前，用含有coli單菌落及培養(yǎng)基的截取吸頭寬口端在培養(yǎng)基上打孔，使絲狀真菌菌落和培養(yǎng)基保留在截取吸頭寬口端內(nèi)，并使兩側(cè)培養(yǎng)基離開大約3mm的距離，30°C繼續(xù)培養(yǎng)3d ；
(6)抗菌活性菌株篩 選:將共培養(yǎng)吸頭寬口端向下置于51taphylococcus aureus、Escherichia coli ^Saccharomyces cere vi si ae ^Peni ci Ilium 等含菌指7]^平板，并用滅菌鑷子輕壓窄口端培養(yǎng)基，使吸頭內(nèi)的絲狀真菌和Escherichia coli接觸。指示細菌用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，真菌為PDA培養(yǎng)基。于指不菌適合的溫度培養(yǎng)后觀察，并用游標卡尺測定抑菌圈的大小，抑菌圈越大，菌株抗菌活性越強，從而快速篩選得到抗菌活性絲狀真菌。
[0006]本發(fā)明中涉及的菌株均來自于中國普通微生物菌種保藏中心，Escherichiacoli 的保藏號為 CGMCC 1.487，Staphylococcus aureus 的保藏號為 CGMCC 1.2465，Saccharomyces cerevisiae 的保藏號為 CGMCC 2.114, Peni ci Ilium expansum 的保藏號為CGMCC 3.3703。
[0007]本發(fā)明所述的一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法的步驟(5)中，通過截取吸M務E— coli和待篩選絲狀真菌共培養(yǎng)，并放于指示菌平板，指示菌培養(yǎng)后測定抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈的有無和大小快速篩選抗菌活性菌株。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明方法通過共培養(yǎng)的方式快速地篩選抗菌活性絲狀真菌，與純種培養(yǎng)篩選抗菌活性絲狀真菌相比，可以增加新穎抗菌活性菌株及抗菌活性物質(zhì)的篩選幾率，并且整個篩選過程快速，操作簡單，能夠快速、直觀、高效的篩選到抗菌活性的絲狀真菌，為抗菌活性絲狀真菌的篩選研究提供了極大方便。
【具體實施方式】
[0009]以下通過實例進一步說明本發(fā)明，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明權(quán)利的限制。
[0010]實施例1，一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法，
(I)樣品采集:用無菌取樣瓶采集海水樣及土樣，迅速送至實驗室，4°c保存；(2)培養(yǎng)基制備:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:牛肉膏3g，蛋白胨IOg,NaCl 5g，蒸餾水1000 ml,pH7.2 ;PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000 ml,自然pH ;若制備固體培養(yǎng)基平板，添加瓊脂20g/L ;用于絲狀真菌分離時，PDA培養(yǎng)基滅菌后待溫度降至60°C，加入過濾除菌的鏈霉素和氨芐青霉素至終濃度分別為100 mg/ml和50 mg/ml，混勻后倒平板；若為海洋樣品則上述培養(yǎng)中配制過程中，用海水代替蒸餾水；
(3)截取吸頭的制備:取Iml移液器吸頭，以寬口端為準，截取12mm，其余部分鋸掉，邊緣打磨光滑，121°C滅菌20min ；
(4)共培養(yǎng)菌株的制備:從斜面中挑取AscAericAiacoli保存菌種,在厚度約為3mm營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線，37°C倒置培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落；用截取吸頭的窄口端在Escherichia coli單菌落上打孔,使coli單菌落及培養(yǎng)基進入吸頭內(nèi)；
(5)絲狀真菌分離及共培養(yǎng):將所取樣品進行梯度稀釋，取50μ L不同稀釋度的稀釋液涂布在厚度約為4mm的PDA平板。30°C倒置培養(yǎng)l_5d，在絲狀真菌菌落形成初期，即菌落直徑小于截取吸頭寬口端前，用含有coli單菌落及培養(yǎng)基的截取吸頭寬口端在培養(yǎng)基上打孔，使絲狀真菌菌落和培養(yǎng)基保留在截取吸頭寬口端內(nèi)，并使兩側(cè)培養(yǎng)基離開大約3mm的距離，30°C繼續(xù)培養(yǎng)3d ；
(6)抗菌活性菌株篩選:將共培養(yǎng)吸頭寬口端向下置于51taphylococcus aureus、Escherichia coli ^Saccharomyces cere vi si ae ^Peni ci Ilium 等含菌指7]^平板，并用滅菌鑷子輕壓窄口端培養(yǎng)基，使吸頭內(nèi)的絲狀真菌和Escherichia coli接觸。指示細菌用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，真菌為PDA培養(yǎng)基。于指不菌適合的溫度培養(yǎng)后觀察，并用游標卡尺測定抑菌圈的大??；抑菌圈越大，菌株抗菌活性越強；從而快速篩選得到抗菌活性絲狀真菌。
[0011](7)菌株的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定
真菌的鑒定參照《真菌鑒定手冊》(魏景超，上海:上?？茖W技術(shù)出版社，1979)和文獻(許玉林，鄭月霞，葉冰瑩，張積森，陳由強.一株纖維素降解真菌的篩選及鑒定，微生物學報，2013，40(2): 220 227)進行。
[0012]實施例2，實施例1所述的一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法的步驟(5)中，通過截取吸頭將coli和待篩選絲狀真菌共培養(yǎng),并放于指示菌平板,指示菌培養(yǎng)后測定抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈的有無和大小快速篩選抗菌活性菌株。
[0013]實施例3，對比實驗:
1.現(xiàn)有技術(shù)方法篩選。從連云港海域連島取海水、海泥，花果山上采集土壤和淡水樣品，通過稀釋涂布法利用PDA培養(yǎng)基分離絲狀真菌，海洋樣品中絲狀真菌分離培養(yǎng)基中用海水代替蒸餾水。將純化后的單菌落接種至PDA斜面培養(yǎng)后4°C保藏。共分離獲得絲狀真菌122株。將不同菌株接種至PDA液體培養(yǎng)基，30°C，160rpm培養(yǎng)2-3d，發(fā)酵液雙層濾紙抽濾后，上清液過0.22 //m微孔濾膜后為待測樣品，采用管碟法測定抑菌活性。每個牛津杯中加入 200 P L 發(fā)酵樣品，米用含 Staphylococcus aureus、Escheri chi a col1、Saccharomyces cerevisiae^ Penicillium expansum 指不菌平板，30°C 培養(yǎng)后觀察，共獲卷抵Staphylococcus atfreus活性菌株18株，抗fecAe—ricAia coli活性菌株13株，抗Saccharomyces cerevisiae 活性菌株 3 取,紙PeniciIIium expansum 活性菌株 8 株。
[0014]2.采用實施例1記載的本發(fā)明方法進行篩選。用上述同樣的海洋及陸源樣品，通過稀釋涂布法利用PDA培養(yǎng)基分離絲狀真菌。從斜面中挑取coli保存菌種，在厚度約為3mm營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線，37°C倒置培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落；用截取吸頭的窄口端在coli單菌落上打孔,使coli單菌落及培養(yǎng)基進入吸頭內(nèi)。在絲狀真菌菌落形成初期，即菌落直徑小于截取吸頭寬口端前，用含有Escherichia coli單菌落及培養(yǎng)基的截取吸頭寬口端在培養(yǎng)基上打孔，使絲狀真菌菌落和培養(yǎng)基保留在截取吸頭寬口端內(nèi)，并使兩側(cè)培養(yǎng)基離開大約3mm的距離，30°C繼續(xù)培養(yǎng)3d。將此共培養(yǎng)微生物的截取吸頭寬口端置于含Staphylococcus aureus ^Escheri chi a col1、Saccharomyces cerevisiae^ Penicillium expansum 指不菌平板，30°C 培養(yǎng)后觀察，共獲得抗Staphylococcus aureus活性菌株22株，抗Escheri chi a coli活性菌株15株，抗Saccharomyces cerevisiae 活性菌株 6 取,紙PeniciIIium expansum 活性菌株 10 株。
[0015]從以上對比篩選實驗 可以看出，本發(fā)明方法顯著地提高了抗菌活性絲狀真菌的篩選效率。
【權(quán)利要求】
1.一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法，其特征在于，其步驟如下: (1)樣品采集:用無菌取樣瓶采集水樣及土樣，迅速送至實驗室，4°c保存； (2)培養(yǎng)基制備:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:牛肉膏3g，蛋白胨IOg,NaCl 5g，蒸餾水1000 ml,pH7.2 ;PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000 ml，自然pH ;制備固體培養(yǎng)基平板時，添加瓊脂20g/L ;用于絲狀真菌分離時，PDA培養(yǎng)基滅菌后待溫度降至60°C，加入過濾除菌的鏈霉素和氨芐青霉素至終濃度分別為100 mg/ml和50 mg/ml，混勻后倒平板；若為海洋樣品則上述培養(yǎng)基配制過程中，用海水代替蒸餾水； (3)截取吸頭的制備:取Iml移液器吸頭，以寬口端為準，截取12mm，其余部分鋸掉，邊緣打磨光滑，121°C滅菌20min ； (4)共培養(yǎng)菌株的制備:從斜面中挑取coli保存菌種，在厚度約為3mm營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線，37°C倒置培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落；用截取吸頭窄口端在Escherichia coli單菌落上打孔,使coli單菌落及培養(yǎng)基進入吸頭內(nèi)； (5)絲狀真菌分離及共培養(yǎng):將所取樣品進行梯度稀釋，取50μ L不同稀釋度的稀釋液涂布在厚度為4mm的PDA平板；30°C倒置培養(yǎng)l_5d，在絲狀真菌菌落形成初期，即菌落直徑小于截取吸頭寬口端前，用含有coli單菌落及培養(yǎng)基的截取吸頭寬口端在培養(yǎng)基上打孔，使絲狀真菌菌落和培養(yǎng)基保留在截取吸頭寬口端內(nèi)，并使兩側(cè)培養(yǎng)基距離大約3mm，3(TC繼續(xù)培養(yǎng)3d ； (6 )抗菌活性菌株篩選:將共培養(yǎng)吸頭寬口端向下置于51 taphylococcus aureus、Escherichia coli ^Saccharomyces cere vi siae ^Peni ci Ilium expansum 白勺含菌指 7]^ 平板，并用滅菌鑷子輕壓窄口端培養(yǎng)基，使吸頭內(nèi)的絲狀真菌和Escherichia coli接觸；指示細菌用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，真菌為PDA培養(yǎng)基；于指不菌適合的溫度培養(yǎng)后觀察,并用游標卡尺測定抑菌圈的大小，抑菌圈越大，菌株抗菌活性越強，從而快速篩選得到抗菌活性絲狀真菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速篩選抗菌活性絲狀真菌的方法，其特征在于:步驟 (5)中通過截取吸頭將coli和待篩選絲狀真菌共培養(yǎng),并放于指示菌平板，指示菌培養(yǎng)后測定抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈的有無和大小快速篩選抗菌活性菌株。
【文檔編號】C12N1/14GK103966108SQ201410212913
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】劉姝, 房耀維, 呂明生, 王淑軍, 焦豫良 申請人:淮海工學院