cDNA的合成方法
【專利摘要】一種cDNA合成方法，其具有如下工序：吸附工序，在含有核糖核酸（RNA）的試樣中混合含有離液物質(zhì)的溶解液和核酸結(jié)合性固相載體，將RNA吸附于載體上；逆轉(zhuǎn)錄工序，將吸附于載體的RNA，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中以吸附于載體的原樣直接進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA；以及，溶出工序，將合成的cDNA溶出到溶出液中。
【專利說明】cDNA的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種cDNA的合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]Boom等報告了使用二氧化硅粒子等核酸結(jié)合性固相載體和離液劑，從生物體材料更簡便地提取核酸的方法(參照非專利文獻I)。而包含Boom等方法在內(nèi)的使用二氧化硅等核酸結(jié)合性固相載體和離液劑將核酸吸附在載體上而提取的方法，主要由以下3工序組成:(I)離液劑的存在下，使核酸吸附于核酸結(jié)合性固相載體的工序(吸附工序)、(2)為了除去非特異性結(jié)合的夾雜物和離液劑，通過清洗液將吸附核酸的載體清洗的工序(清洗工序)、以及(3)通過水或低鹽濃度緩沖液將核酸從載體溶出的工序(溶出工序)。其中作為(2)的清洗液，溶解有離液劑且為了防止核酸從載體的溶出而一直以來使用水溶性有機溶劑，特別是以50~80%左右的比例含有乙醇的水或低鹽濃度緩沖液。
[0003]但是，該水溶性有機溶劑在(3)的工序中殘留時，由于在將提取液進行酶處理時阻礙酶反應(yīng)，通常，在用含有乙醇的水溶液進行清洗之后，根據(jù)需要進行用100%乙醇、或者、揮發(fā)性更高的丙酮等清洗，然后，進行干燥將有機溶劑從體系中完全去除的操作。已知該干燥不僅需要時間，而且如果干燥時間不充分會導(dǎo)致乙醇的殘留，干燥過度時，由于核酸干燥過度而固化，溶出變得困難，結(jié)果導(dǎo)致核酸回收量的降低、重現(xiàn)性降低。因此有機溶劑的使用，不僅很難估計其干燥的程度，而且由于乙醇、丙酮這樣的有機溶劑具有易燃性和揮發(fā)性，特別是考慮操作的自動化時，存在起火等的危險性。
[0004]因此，開發(fā)了載體吸附核酸之后，(2)的清洗工序中，使用完全不含乙醇等有機溶劑的水或低鹽濃度緩沖液清洗載體，(3)的溶出工序中，50~70°C下，通過用水或低鹽濃度緩沖液將核酸溶出，提取核糖核酸(RNA)的方法(參照專利文獻I)。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0006]專利文獻
[0007]專利文獻I日本特開平11-146783號公開公報
[0008]非專利文獻
[0009]非專利文獻1J.Clin.Microb1l.，vol.28Νο.3，p.495-503 (1990)
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠效率良好地利用的cDNA的合成方法。
[0011]目前為止，Boom法中，將核酸吸附于載體，(2)的清洗工序中，用實際上不含乙醇等機溶劑的水或低鹽濃度緩沖液清洗載體之后，(3)的溶出工序中，50~70°C下，通過用水或低鹽濃度水溶液溶出核酸，將核糖核酸(RNA)分離(日本特開平11-146783號公開公報)。但是，本
【發(fā)明者】發(fā)現(xiàn)將用Boom法分離的RNA用于RT-PCR時，通過將吸附于載體的RNA，在不從載體游離的秦光下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而能夠?qū)⒑铣傻腸DNA直接溶出至PCR反應(yīng)液中，可效率良好地進行之后的PCR反應(yīng)，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的完成。
[0012]本發(fā)明的一個實施方式是一種cDNA合成方法，其具有以下工序:吸附工序，在含有核糖核酸(RNA)的試樣中，混合含有離液物質(zhì)的溶解液和核酸結(jié)合性固相載體，將RNA吸附于所述載體上；逆轉(zhuǎn)錄工序，將吸附于所述載體的RNA，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中在吸附于所述載體的情況下進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA ;溶出工序，將合成的所述cDNA溶出至溶出液中?？梢栽谀孓D(zhuǎn)錄工序之前或之后進一步具有將吸附上述RNA的所述載體用不含有機溶劑的清洗液清洗的工序。上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液可以含有逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄用引物。上述溶出液可以含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA擴增用引物。上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和/或溶出液可以含有BSA。此外，上述逆轉(zhuǎn)錄工序中，優(yōu)選在小于50°C的條件下將上述RNA逆轉(zhuǎn)錄。上述載體優(yōu)選為磁性粒子。
[0013]本發(fā)明的另一實施方式是一種cDNA合成試劑盒，其含有:含4~7M的胍鹽、O~5%的非離子性表面活性劑、O~0.2M的還原劑的中性溶解液，核酸結(jié)合性固相載體；含4~7M的胍鹽、O~5%的非離子性表面活性劑的第I清洗液；由水或低鹽濃度水溶液組成的第2清洗液；含有逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP以及逆轉(zhuǎn)錄用引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液；含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA擴增用引物的DNA擴增液。
[0014]通過本發(fā)明，能夠提供一種能夠效率良好地利用的cDNA的合成方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1是表示使用本發(fā)明的一個實施例中通過在載體上進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)而合成的cDNA進行PCR反應(yīng)的結(jié)果的圖。
[0016]圖2是表示本發(fā)明的一實施例中在載體上進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之后，省略清洗工序進行PCR反應(yīng)的結(jié)果的圖。
【具體實施方式】
[0017]實施方式和實施例沒有特別說明的情況下，使用M.R.Green &J.Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual(4th edit1n), ColdSpring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012) ;F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, K.Struhl (Ed.), Current Protocols inMolecular B1logy, John Wiley & Sons Ltd.等的標準的實驗指南集記載的方法或者將其修飾、改變的方法。此外，使用市售的試劑盒、測定裝置時，沒有特別說明的情況下，使用這些中所附的實驗指南。
[0018]應(yīng)予說明，通過本說明書的記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員可明確本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點及其構(gòu)思，本領(lǐng)域技術(shù)人員從本說明書的記載容易將本發(fā)明再現(xiàn)。以下記載的發(fā)明的實施方式以及具體的實施例等，示出的是本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，是為了例示或說明而示出的內(nèi)容，本發(fā)明不受這些內(nèi)容的限定。在本說明書公開的本發(fā)明的意圖以及該范圍內(nèi)，基于本說明書的記載，可以做出各種改變及修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
[0019]cDNA合成用試劑
[0020]本發(fā)明中上述的cDNA合成方法具有以下工序:在含有RNA的試樣中，混合含有離液物質(zhì)的溶解液和核酸結(jié)合性固相載體，將RNA吸附于載體的吸附工序；將吸附于載體的RNA，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中在吸附于載體的情況下進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄工序；將合成的cDNA溶出至溶出液中的溶出工序?？梢栽谀孓D(zhuǎn)錄工序之前進一步含有將吸附上述RNA的上述載體用清洗液清洗的工序。
[0021]提取RNA的試樣，含有RNA則沒有特別限制，可以是細胞，組織等的細胞塊等的生物體試樣、病毒、合成RNA、在臨時分離的RNA中混入有雜質(zhì)、夾雜物的試樣等。
[0022]離液物質(zhì)在水溶液中生成離液離子(離子半徑大的I價陰離子)，具有增加疏水性分子的水溶性的作用，只要是對RNA向固相載體的吸附有作用的物質(zhì)就沒有特別限制。具體的可舉出硫氰酸胍鹽、胍鹽酸鹽、碘化鈉、碘化鉀、過氯酸鈉等，這些物質(zhì)中，優(yōu)選蛋白質(zhì)變性作用強的硫氰酸胍鹽或胍鹽酸鹽。這些離液物質(zhì)的使用濃度沒有特別限制，因各物質(zhì)而不同，例如，使用硫氰酸胍鹽時，在3~5.5M的范圍內(nèi)，使用胍鹽酸鹽時，優(yōu)選在5M以上使用。
[0023]溶解液含有這樣的離液物質(zhì)即可，沒有特別限制，可以含有以細胞膜的破壞或者使細胞中含有的蛋白質(zhì)變性為目的的表面活性劑。作為該表面活性劑，是通常用于從細胞等提取核酸的表面活性劑即可，沒有特別限制，具體的可舉出Triton-X等TRITON系表面活性劑、Tween20等Tween系表面活性劑這樣的非離子性表面活性劑、N-月桂?；“彼徕c(SDS)等陰離子性表面活性劑，特優(yōu)選非離子性表面活性劑在0.1~2%的范圍進行使用。進而，溶解液中優(yōu)選含有2-巰基乙醇或者二硫蘇糖醇等還原劑。溶解液可以是緩沖液，優(yōu)選是pH6~8的中性?？紤]這些情況，具體優(yōu)選含有4~7M的胍鹽、O~5%的非離子性表面活性劑、O~0.2M的還原劑等。
[0024]核酸結(jié)合性固相載體是具有在離液離子的存在下能夠?qū)⒑怂嵛郊赐ㄟ^可逆的物理結(jié)合進行保持的親水性表面的固體即可，沒有特別限制。具體的，優(yōu)選含有二氧化硅的物質(zhì)，例如，二氧化硅 、玻璃、硅藻土或者將這些物質(zhì)通過化學(xué)修飾實施表面處理的物質(zhì)，更優(yōu)選與磁性材料、超順磁性金屬氧化物等的復(fù)合物。通過化學(xué)修飾實施表面處理時，在不妨礙與核酸可逆性結(jié)合的范圍可以帶有適度的陽電荷。
[0025]此外，作為這些核酸結(jié)合性固相載體的形態(tài)，具體可舉出粒子、過濾器、袋、盤、反應(yīng)容器等，沒有特別限制。這些形態(tài)中，考慮到吸附和溶出的效率，更優(yōu)選粒子形態(tài)。此時的粒徑?jīng)]有特別的限制，可以是0.05~500 μ m，優(yōu)選I~100 μ m，特別優(yōu)選I~10 μ m。
[0026]清洗液優(yōu)選實際上不含有乙醇、異丙醇等有機溶劑和離液物質(zhì)的清洗液。該清洗液優(yōu)選為水或低鹽濃度水溶液，在低鹽濃度水溶液的情況下，優(yōu)選為緩沖液。低鹽濃度水溶液的鹽濃度，優(yōu)選為10mM以下，更優(yōu)選為50mM以下，最優(yōu)選為15mM以下。此外，低鹽濃度水溶液的下限沒有特別限制，優(yōu)選為0.1mM以上，進一步優(yōu)選為ImM以上，最優(yōu)選為1mM以上。此外，該溶液可以含有TritoruTweeruSDS等表面活性劑，pH沒有特別限制。用于制備緩沖液的鹽沒有特別限制，優(yōu)選使用Tris、Hepes、Pipes、磷酸等的鹽。
[0027]進行多次清洗時，可以使用相同成分的清洗液，也可以使用不同成分的清洗液。例如，作為溶解后立即使用的清洗液，可以使用含有胍鹽的溶液，該清洗液，特別優(yōu)選含有4~7M的胍鹽、O~5%的非離子性表面活性劑。
[0028]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含有逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP以及逆轉(zhuǎn)錄酶用引物(寡核苷酸)即可，沒有特別限制。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中，作為反應(yīng)抑制防止劑優(yōu)選含有BSA (牛血清白蛋白)或明膠。溶劑優(yōu)選為水，更優(yōu)選為實際上不含有乙醇、異丙醇等有機溶劑和離液物質(zhì)的溶劑。此外，為了配制成逆轉(zhuǎn)錄酶用緩沖液，優(yōu)選含有適當(dāng)濃度的鹽。用于配制緩沖液的鹽，只要不抑制酶反應(yīng)即可，沒有特別限制，優(yōu)選使用Tris、Hepes、Pipes、磷酸等的鹽。逆轉(zhuǎn)錄酶沒有特別限制，例如，可使用源自禽成髓細胞瘤病毒(Avian Myeloblast Virus)、Ras相關(guān)病毒2型(Ras Associated Virus2 型)、莫洛尼小鼠白血病病毒(Mouse Molony Murine LeukemiaVirus)、人類免疫缺陷病毒I型(Human Immunodefficiency Virusl型)的逆轉(zhuǎn)錄酶等。
[0029]溶出液含有用于繼續(xù)處理逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA的酶、底物、鹽等的溶質(zhì)。溶出液中，作為反應(yīng)抑制防止劑優(yōu)選含有BSA (牛血清白蛋白)或明膠。溶劑優(yōu)選為水，更優(yōu)選為實際上不含有乙醇、異丙醇等有機溶劑和離液物質(zhì)的溶劑。
[0030]例如，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之后，繼續(xù)將cDNA用PCR擴增時，溶出液含有DNA聚合酶、dNTP、以及DNA聚合酶用引物(寡核苷酸)即可，沒有特別限制。此外也可以含有TaqMan探針、Molecular Beacon、循環(huán)探針等實時PCR用探針、SYBR Green等嵌入劑用突光色素。此外，為了配制成DNA聚合酶用緩沖液，優(yōu)選含有適當(dāng)濃度的鹽。用于配制成緩沖液的鹽，只要不抑制酶反應(yīng)即可，沒有特別限制，優(yōu)選使用Tris、Hepes、Pipes、磷酸等的鹽。DNA聚合酶沒有特別限制，例如，有Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶或者這些酶的修飾體等數(shù)量非常多的市售品。
[0031]將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、溶出液中含有的dNTP、鹽的濃度，設(shè)置為對使用的反應(yīng)適合的濃度即可，通常將dNTP設(shè)置為10~1000 μ Μ，優(yōu)選為100~500 μ M ;將Mg2+設(shè)置為I~10mM,優(yōu)選為5~1mM ;將Cl-設(shè)置為I~2000mM，優(yōu)選為200~700mM較好，總離子濃度沒有特別限制，可以是比50mM高的濃度，優(yōu)選為比10mM高的濃度，更優(yōu)選為比120mM高的濃度，進一步優(yōu)選為比150mM高的濃度，進一步優(yōu)選為比200mM高的濃度。上限優(yōu)選為500mM以下，更優(yōu)選為300mM以下，進一步優(yōu)選為200mM以下。引物用寡核苷酸分別使用0.1~10 μ M，優(yōu)選為0. 1~ΙμΜ。BSA或明膠的濃度在lmg/mL以下時，反應(yīng)抑制防止效果較小，10mg/mL以上時，存在抑制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲其后的酶反應(yīng)的可能性，因此優(yōu)選I~10mg/mL。使用明膠時，作為其來源可例示牛皮、豬皮、牛骨，沒有特別限制。明膠難以溶解時，可以加溫使其溶解。
[0032]cDNA合成方法
[0033]具體的可以按照以下合成cDNA。
[0034](吸附工序)
[0035]首先，將適量的溶解液放入Eppendorf微管、塑料管等符合目的的管中，將提取RNA的試樣和核酸結(jié)合性固相載體混合，通過勻質(zhì)機、渦旋混合器等將試樣破碎，將RNA吸附在載體上。
[0036](清洗工序)
[0037]接下來，從管中除去溶解液，可以向吸附RNA的載體中直接添加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，但為了將非特異地吸附于載體的夾雜物除去，減少因溶液置換而從前一工序帶入溶質(zhì)，將鹽濃度正確地調(diào)整，優(yōu)選將吸附RNA的載體用適量的清洗液清洗。清洗次數(shù)沒有特別限制，可以清洗I次~多次。多次清洗時，優(yōu)選開始使用含有胍鹽的清洗液，最后使用不含胍鹽的清洗液。例如，作為含有胍鹽的清洗液，可例示含有4~7M的胍鹽、O~5%的非離子性表面活性劑的清洗液，作為不含胍鹽的清洗液，可例示水或低鹽濃度水溶液組成的清洗液。
[0038]本發(fā)明的cDNA合成方法中，清洗是指使結(jié)合有RNA的載體與清洗液接觸，進行再分離，從載體將RNA以外的非特異性結(jié)合的物質(zhì)除去的操作。具體的分離方法因使用的載體的形態(tài)而不同，載體是珠子等粒子形態(tài)時，可以使用離心分離、過濾分離以及柱操作等。
[0039](逆轉(zhuǎn)錄工序)
[0040]接下來，從管將清洗液除去，向吸附RNA的載體添加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。由于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中含有逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP以及逆轉(zhuǎn)錄酶用引物，可以在RNA吸附在載體的情況下，直接用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，可以使用含有吸附RNA的載體的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的一部分或全部，使用一部分時，優(yōu)選用調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄酶用的緩沖液進行稀釋。調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄酶用的緩沖液可以使用與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液相同成分的溶液，只要將鹽濃度進行適當(dāng)調(diào)節(jié)，則沒有特別限制，逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP以及逆轉(zhuǎn)錄酶用引物可以分別進行添加，也可以不分別進行添加。通過本發(fā)明的方法，在該逆轉(zhuǎn)錄工序中，不具有除去載體的工序。即，通過將吸附于載體的RNA，不從載體游離的情況下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從而能夠合成可效率良好地用于之后的反應(yīng)的cDNA。因此，例如，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)優(yōu)選在低溫下進行，可以是小于50°C，優(yōu)選為小于45°C，更優(yōu)選為小于40°C，進一步優(yōu)選為小于35°C。此外，溫度的下限優(yōu)選為20°C以上，更優(yōu)選為25°C以上，進一步優(yōu)選為30°C以上。
[0041](清洗工序)
[0042]該工序之后，從管將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液除去，可以向吸附RNA的載體直接添加溶出液，但為了除去載體非特異性吸附的夾雜物，減少因置換溶液而從前一工序帶入溶質(zhì)，為了正確調(diào)整鹽濃度，優(yōu)選將吸附RNA的載體，用適量的清洗液清洗。清洗次數(shù)沒有特別限制，可以清洗I次~數(shù)次。清洗液優(yōu)選由水或低鹽濃度水溶液組成的清洗液。
[0043](溶出工序)
[0044] 清洗后，將清洗液除去，加入適量的溶出液，通過渦旋混合器等進行混合，將載體上結(jié)合的cDNA從載體上游離。此時，為了促進cDNA溶出，可以將溶出液加熱。加熱溫度沒有特別限制，高于40°C即可，優(yōu)選50°C以上，更優(yōu)選60°C以上。加熱溫度的上限沒有特別限制，優(yōu)選為70°C以下，更優(yōu)選為65°C以下，進一步優(yōu)選為60°C以下，最優(yōu)選為60°C。作為加熱方法，可以添加預(yù)先加熱的溶出液，也可以在將溶出液加入載體后加熱。加熱時間沒有特別限制，優(yōu)選30秒~10分鐘左右。溶出后，通過將載體除去，能夠?qū)⑸锨宸蛛x。這樣合成的cDNA可效率良好地用于包括PCR的聚合酶反應(yīng)等各種用途。
[0045]應(yīng)予說明，通過清洗工序等，將載體和上清分離時，可通過離心等將載體沉淀并分離，但載體含有磁性體時，使用磁石等就能夠簡便地進行分離。
[0046]合成的cDNA的利用
[0047]例如，可通過在溶出液添加10分之I量的DNA聚合酶反應(yīng)用緩沖液(10倍溶液)等而能夠進行PCR反應(yīng)，但優(yōu)選溶出液的鹽濃度預(yù)先針對酶反應(yīng)被優(yōu)化，含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA聚合酶用引物。這種情況下，可以將溶出液直接用于DNA聚合酶反應(yīng)。此時，DNA聚合酶反應(yīng)中，可以使用反應(yīng)液的一部分或全部,使用一部分時,可用DNA調(diào)節(jié)聚合酶用緩沖液稀釋。調(diào)節(jié)為DNA聚合酶用的緩沖液可以使用與溶出液具有相同成分的溶液，只要將鹽濃度進行了合理的調(diào)節(jié)即可，沒有特別限制，DNA聚合酶、dNTP以及DNA聚合酶用引物，可以分別進行添加，也可以不分別進行添加。
[0048]DNA聚合酶反應(yīng)在適用于使用的DNA聚合酶的條件下進行即可。進而，在DNA聚合酶反應(yīng)之后，擴增的cDNA可用于文庫制作等各種用途。
[0049]cDNA合成試劑盒
[0050]本發(fā)明的cDNA合成試劑盒含有:(I)含有4~7M的胍鹽、O~5%的非離子性表面活性劑以及O~0.2M的還原劑的中性溶解液；(2)核酸結(jié)合性固相載體；(3)含有4~7M的胍鹽以及O~5%的非離子性表面活性劑的第I清洗液；(4)水或低鹽濃度水溶液組成的第2清洗液；(5)含有逆轉(zhuǎn)錄酶以及dNTP的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液；以及，(6)含有DNA聚合酶以及dNTP的DNA擴增液。通過本試劑盒，只要向逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中添加對應(yīng)于目的基因的逆轉(zhuǎn)錄用引物，向DNA擴增液添加DNA擴增用引物，就能夠容易、效率良好地進行本發(fā)明的cDNA合成和接著的cDNA擴增。
[0051]此外，該試劑盒可以含有逆轉(zhuǎn)錄用引物和/或DNA擴增用引物。由此，能夠得到針對特定基因的cDNA合成試劑盒。
[0052]應(yīng)予說明，本試劑盒的溶解液、清洗液、溶出液等的構(gòu)成要素是以DNA合成用試劑中記載的內(nèi)容為準。
[0053]實施例
[0054]實驗方法
[0055](I)吸附工序
[0056]向裝在1.5mL 的 Eppendorf 微管(Eppendorf microcentrifuge tube)的血清樣品(取自罹患流感A型的患者)150 μ L，添加350 μ L溶解液(5.5Μ硫氰酸胍鹽、2%Triton_X100、0.15M2-巰基乙醇)，充分混合，將血液細胞溶解。該溶解液中添加磁性二氧化硅粒子(NPK-401，東洋紡織公司制)20 μ L，室溫下用渦旋混合器(Vortex mixer)攪拌5分鐘。然后，將微管設(shè)置于磁性支架(MGS-101，東洋紡織社)上收集磁性二氧化硅粒子，將上清除去。
[0057](2)清洗工序
[0058]接下來，將微管從磁性支架取出，加入350 μ L清洗液I (7Μ胍鹽酸鹽)，充分混合后，再次設(shè)置在磁性支架上，收集磁性二氧化硅粒子，將上清除去，清洗磁性珠。接下來，同樣地用450 μ L清洗液II (5m M Tris鹽酸緩沖液)清洗粒子，最后將上清除去。
[0059](3)逆轉(zhuǎn)錄工序
[0060]向除去上清而收集的粒子中添加20 μ L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，將粒子混懸。進而，將微管用管加熱器40°C下加熱10分鐘，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后，將微管設(shè)置在磁性支架上收集磁性二氧化硅粒子，將上清除去。
[0061](4)清洗工序
[0062]向該樣品中添加450 μ L清洗液II，室溫下通過渦旋混合器攪拌10秒鐘后，將其設(shè)置在磁性支架上收集磁性二氧化硅粒子，將上清除去清洗粒子。
[0063](5)實施例1:向水的溶出和PCR反應(yīng)
[0064]向(4)中除去上清而收集的粒子中添加20 μ L水，將粒子混懸，65°C加熱2分鐘，室溫下通過渦旋混合器攪拌5秒鐘后，將微管設(shè)置在磁性支架上收集磁性二氧化硅粒子，回收上清。
[0065]從上清中取4 μ L添加到PCR反應(yīng)調(diào)制液16 μ L中，制作總計20 μ L的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液安放于PCR裝置(Roche制LightCycler-480)中，進行實時PCR反應(yīng)，測定每個循環(huán)中的亮度。
[0066](6)實施例2:向PCR反應(yīng)液的溶出和PCR反應(yīng)
[0067]向(4)中除去上清而收集的粒子中添加20 μ LPCR反應(yīng)液，將粒子混懸，65°C加熱2分鐘，室溫下通過渦旋混合器攪拌5秒鐘后，將微管設(shè)置在磁性支架上，回收上清。
[0068]將這樣得到的20 μ LPCR反應(yīng)液直接安置于PCR裝置，進行實時PCR反應(yīng)，測定每個循環(huán)中的亮度。
[0069](7)實施例3:以往的方法
[0070]向(2)中除去上清而收集的粒子添加20 μ L水，將粒子混懸，60°C加熱5分鐘，將微管設(shè)置在磁性支架上收集磁性二氧化硅粒子，回收上清。
[0071]從上清取出4 μ L添加到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)調(diào)整液16 μ L中，制作總計20 μ L的反應(yīng)液。通過管加熱器40°C加熱10分鐘進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0072]從反應(yīng)后的溶液取出4 μ L添加到PCR反應(yīng)調(diào)制液16 μ L,制作總計20 μ L的反應(yīng)液。將該反應(yīng)液安置于PCR裝置,進行實時PCR反應(yīng),測定每個循環(huán)中的亮度。
[0073][表 1]
[0074][表 1]
[0075]
【權(quán)利要求】
1.一種cDNA合成方法，其特征在于，包括以下工序: 吸附工序，在含有核糖核酸RNA的試樣中混合含有離液物質(zhì)的溶解液和核酸結(jié)合性固相載體，將RNA吸附于所述載體上， 逆轉(zhuǎn)錄工序，將吸附于所述載體的RNA在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中以吸附于所述載體的原樣直接進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，以及 溶出工序，將合成的所述cDNA溶出至溶出液中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA合成方法，其中，在逆轉(zhuǎn)錄工序之前，進一步包括將吸附有所述RNA的所述載體用清洗液清洗的工序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的cDNA合成方法，其中，在逆轉(zhuǎn)錄工序之后，進一步包括將吸附有所述RNA的所述載體用不含有機溶劑的清洗液清洗的工序。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中的任一項所述的cDNA合成方法，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含有逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄用引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中的任一項所述的cDNA合成方法，其特征在于，所述溶出液含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA擴增用引物。
6.根據(jù)權(quán)利要 求1~5中的任一項所述的cDNA合成方法，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和/或溶出液含有BSA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中的任一項所述的cDNA合成方法，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄工序中，在小于50°C的條件下將所述RNA逆轉(zhuǎn)錄。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中的任一項所述的cDNA合成方法，其特征在于，所述載體是磁性粒子。
9.一種cDNA合成試劑盒，其特征在于，含有: 含4~7M的胍鹽、O~5%的非離子性表面活性劑和O~0.2M的還原劑的中性溶解液， 核酸結(jié)合性固相載體， 含4~7M的胍鹽和O~5%的非離子性表面活性劑的第I清洗液， 由水或低鹽濃度水溶液組成的第2清洗液， 含逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP以及逆轉(zhuǎn)錄用引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，以及 含DNA聚合酶、dNTP以及DNA擴增用引物的DNA擴增液。
【文檔編號】C12N15/10GK104046613SQ201410089861
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月13日
【發(fā)明者】齊藤祐司, 高城富美男 申請人:精工愛普生株式會社