一種煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，屬于煙草抗病性鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】。將成熟期健康煙葉消毒、破碎，用無菌水配成4~6%的溶液；將赤星病菌產(chǎn)孢的菌絲點接種于培養(yǎng)基平板，在培養(yǎng)箱內(nèi)24~26℃培養(yǎng)10~20天，產(chǎn)孢后用煙葉溶液將孢子洗下，靜置培養(yǎng)7~9小時促進(jìn)其萌發(fā)，得到菌懸液；當(dāng)需要鑒定的煙葉進(jìn)入成熟期時采樣，消毒、晾干及保濕處理。吸取菌懸液10~15μl滴在煙葉上，每片煙葉滴10~16滴，將煙葉置于相對濕度≥90%，溫度為24~26℃的保濕框架或人工氣候箱內(nèi)光照培養(yǎng)3~5天，待煙葉出現(xiàn)黃色侵染斑后，測量病斑直徑，判定其抗病性。所述鑒定方法成功率高，重現(xiàn)性好，快速準(zhǔn)確，檢查監(jiān)測便捷，不會產(chǎn)生由于人工接種造成的田間污染，推廣應(yīng)用價值較高。
【專利說明】一種煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于煙草抗病性鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種成功率高，重現(xiàn)性好，快速準(zhǔn)確，檢查監(jiān)測便捷，無田間污染的煙草赤星病葉片抗病性鑒定方法。
【背景技術(shù)】[0002]煙草赤星病是一種危害煙草生產(chǎn)的嚴(yán)重病害，常給我國各煙區(qū)的煙葉生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，使選育抗赤星病的煙草品種顯得尤為重要，而快速、準(zhǔn)確、可靠且簡便易行的抗病性鑒定方法能夠有效縮短育種進(jìn)程。在現(xiàn)有的鑒定方法中，田間人工病圃法鑒定周期長，易受大田生長環(huán)境影響，使接種效果不穩(wěn)定，在致病結(jié)果的定量分析上也存在一定問題。赤星病菌毒素鑒定法雖然具有處理快速和適用對象多樣化的特點，卻與煙草赤星病的實際發(fā)病歷程并不完全相同，從而對鑒定結(jié)果的可靠性產(chǎn)生影響，此外，實際操作中毒素濃度的確定也需投入較多的人力物力。因此，開發(fā)一種成功率高，重現(xiàn)性好，快速準(zhǔn)確，檢查監(jiān)測便捷，無田間污染，且成本較低的煙草赤星病葉片抗病性鑒定方法是一個亟待解決的技術(shù)問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種成功率高，重現(xiàn)性好，快速準(zhǔn)確，檢查檢測便捷，無田間污染的煙草赤星病葉片抗病性鑒定方法。
[0004]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，包括煙葉溶液制備、病菌孢子培養(yǎng)、待鑒煙葉預(yù)處理及抗病性鑒定工序，具體包括:
A、煙葉溶液制備:將成熟期健康無病斑的煙葉消毒、晾干后，進(jìn)行組織破碎，再用無菌水配成4~6%的煙葉溶液；
B、病菌孢子培養(yǎng):將赤星病菌產(chǎn)生孢子的菌絲點接種于培養(yǎng)基平板上，在培養(yǎng)箱內(nèi)24~26°C培養(yǎng)10-20天，產(chǎn)生孢子后用煙葉溶液將孢子洗下，繼續(xù)靜置培養(yǎng)7、小時，促進(jìn)孢子萌發(fā)，得到赤星病菌孢子懸浮液，其孢子濃度為1.5^2.5X IO4個/ml，發(fā)芽率> 87% ；
C、待鑒煙葉預(yù)處理:當(dāng)需要鑒定抗病性的煙草品種的煙葉進(jìn)入成熟期時進(jìn)行采樣，將煙葉消毒后，晾干表面溶液，再進(jìn)行保濕處理；
D:抗病性鑒定:吸取赤星病菌孢子懸浮液10-?5μ I滴在煙葉上，每片煙葉滴10-16滴，然后將煙葉置于相對濕度> 90%，溫度為24~26°C的保濕框架或人工氣候箱內(nèi)光照培養(yǎng)3飛天，待煙葉出現(xiàn)黃色侵染斑后，測量病斑直徑，判定煙草品種其煙葉的抗病性。
[0005]本發(fā)明具有以下有益效果:
1、本發(fā)明所述鑒定方法在室內(nèi)即可進(jìn)行，克服了田間人工病圃法由于大田自然條件復(fù)雜多樣，影響發(fā)病的因素較多，難以精確操控和定量分析的缺點，無需大量實驗面積即可順利操作，提高鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性的同時，降低了鑒定成本，除了具有重現(xiàn)性好，快速準(zhǔn)確，結(jié)論穩(wěn)定可靠的優(yōu)點外，還避免了由于人工接種造成的大田污染。
[0006]2、在赤星病菌孢子培養(yǎng)步驟，本發(fā)明所述鑒定方法在培養(yǎng)基的選擇上兼顧了產(chǎn)孢量和萌發(fā)率兩方面的要求。優(yōu)選的PDA培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基產(chǎn)孢量大，萌發(fā)率高，配合多點接種法及適宜的培養(yǎng)環(huán)境設(shè)定，縮短了產(chǎn)孢周期，改善了產(chǎn)孢同步性和孢子質(zhì)量穩(wěn)定性，在提高鑒定效率的同時，兼顧了重現(xiàn)性及鑒定結(jié)果的可靠性。
[0007] 3、本發(fā)明所述鑒定方法在制備赤星病菌孢子懸浮液時，加入了煙葉溶液以促進(jìn)孢子萌發(fā)，煙葉溶液較普通的葡萄糖、蔗糖溶液含有更豐富的有利于病菌孢子發(fā)芽的營養(yǎng)物。所優(yōu)選的初熟期煙葉感病性更強，能進(jìn)一步促進(jìn)病菌孢子的侵染，有效提高了鑒定、監(jiān)測的效率。
[0008]4、本發(fā)明所述鑒定方法在消毒步驟采用的是次氯酸鈉溶液和乙醇溶液復(fù)用的消毒工藝。所述的乙醇溶液在殺滅煙葉表面微生物的同時，還具有一定的抽提作用，有利于增強赤星病菌孢子懸浮液對煙葉的滲透性，因而具有誘導(dǎo)感病的功效，提高了鑒定實驗的成功率。
[0009]5、在待鑒煙葉預(yù)處理步驟，本發(fā)明所述方法選用初熟期的煙葉作為鑒定樣本，目的是為了在考慮菌懸液孢子濃度的基礎(chǔ)上，通過準(zhǔn)確控制菌懸液的滴加量，兼顧鑒定試驗的致病率與病斑檢測的便捷性，控制病害發(fā)展的嚴(yán)重度，從而有利于提高鑒定的準(zhǔn)確性和成功率。
[0010]6、在接種后的觀察、監(jiān)測期間，本發(fā)明所述方法對鑒定環(huán)境的溫度、濕度和光照條件等都進(jìn)行了較精確的設(shè)定。各工藝參數(shù)尤其是溫、濕度的協(xié)同作用，能明顯加速赤星病菌孢子的萌發(fā)及其對葉面的侵染，進(jìn)一步縮短了鑒定周期。
[0011 ] 綜上所述，本發(fā)明所述鑒定方法成功率高，重現(xiàn)性好，快速準(zhǔn)確，檢查監(jiān)測便捷，無需大塊試驗面積即可實現(xiàn)，且不會產(chǎn)生由于人工接種造成的田間污染，具有較好的推廣應(yīng)用價值。
【具體實施方式】
[0012]下面對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換，本發(fā)明均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]一種煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，包括煙葉溶液制備、病菌孢子培養(yǎng)、待鑒煙葉預(yù)處理及抗病性鑒定工序，具體包括:
A、煙葉溶液制備:將成熟期健康無病斑的煙葉消毒、晾干后，進(jìn)行組織破碎，再用無菌水配成4~6%的煙葉溶液；
B、病菌孢子培養(yǎng):將赤星病菌產(chǎn)生孢子的菌絲點接種于培養(yǎng)基平板上，在培養(yǎng)箱內(nèi)24~26°C培養(yǎng)10-20天，產(chǎn)生孢子后用煙葉溶液將孢子洗下，繼續(xù)靜置培養(yǎng)7、小時，促進(jìn)孢子萌發(fā)，得到赤星病菌孢子懸浮液，其孢子濃度為1.5^2.5X IO4個/ml，發(fā)芽率≥ 87% ；
C、待鑒煙葉預(yù)處理:當(dāng)需要鑒定抗病性的煙草品種的煙葉進(jìn)入初熟期時進(jìn)行采樣，將煙葉消毒后，晾干表面溶液，再進(jìn)行保濕處理；
D:抗病性鑒定:吸取赤星病菌孢子懸浮液10-?5μ I滴在煙葉上，每片煙葉滴10-16滴，然后將煙葉置于相對濕度≥90%，溫度為24~26°C的保濕框架或人工氣候箱內(nèi)光照培養(yǎng)3飛天，待煙葉出現(xiàn)黃色侵染斑后，測量病斑直徑，判定煙草品種其煙葉的抗病性。
[0014]所述成熟期健康無病斑的煙葉為初熟期煙葉。
[0015]所述初熟期的煙葉為煙株任何部葉的葉片。[0016]所述煙葉消毒指的是先將煙葉置于4飛％的次氯酸鈉溶液中浸泡0.8^1.2min，清水漂凈后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡2(T40s。
[0017]所述煙葉消毒優(yōu)選先將煙葉置于5%的次氯酸鈉溶液中浸泡lmin，清水漂凈后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡30s。
[0018]所述組織破碎采用的是研磨法。
[0019]所述接種采用的是多點接種。
[0020]所述多點接種指的是每個培養(yǎng)基平板接種5~7個點。[0021]所述培養(yǎng)基可以為燕麥培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基中的任一種。
[0022]所述培養(yǎng)基優(yōu)選為PDA培養(yǎng)基或Czapek培養(yǎng)基中的任一種。
[0023]所述病菌孢子培養(yǎng)優(yōu)選將煙草赤星病菌接種于Czapek培養(yǎng)基平板上，在培養(yǎng)箱內(nèi)25°C培養(yǎng)15天，產(chǎn)生孢子后用煙葉溶液將孢子洗下，繼續(xù)靜置培養(yǎng)8小時，促進(jìn)病菌孢子萌發(fā)。
[0024]所述保濕處理指的是將煙葉置于具有保濕效果的器械內(nèi)，并將加入營養(yǎng)液的消毒保濕材料包裹于葉柄上。
[0025]所述具有保濕效果的器械可以為人工氣候箱或具有保濕效果的框架。
[0026]所述營養(yǎng)液可以為10%的霍氏營養(yǎng)液或IOOppm的煙用復(fù)合肥液中的任一種。
[0027]所述營養(yǎng)液優(yōu)選10%的霍氏營養(yǎng)液。
[0028]所述保濕處理的保濕天數(shù)為3飛天。
[0029]所述滴在煙葉上指的是滴在葉片的正面，不要在主脈上。
[0030]所述吸取赤星病菌孢子懸浮液滴在煙葉上之后，將煙葉置于相對濕度為95%，溫度為25°C的保濕框架或人工氣候箱內(nèi)光照培養(yǎng)4天。
[0031]所述測量病斑直徑，判定煙草品種其煙葉的抗病性指的是每次試驗都必須加凈葉黃作為抗病對照，G140作為感病對照，對參與鑒定的煙草品種的煙葉病斑直徑測量后進(jìn)行方差分析，與凈葉黃差異不顯著的煙草品種其葉片抗病性為抗病等級，與G140差異不顯著的煙草品種其葉片抗病性為感病等級，介于凈葉黃和G140之間的煙草品種其葉片抗病性為中抗或中感等級。
[0032]實施例1
——NC89品種對煙草赤星病的抗病性鑒定
A、煙葉溶液制備:將初熟期健康無病斑的煙葉采摘后，首先置于5%的次氯酸鈉溶液中浸泡lmin，清水漂凈后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡30s。晾干后在滅菌的研缽里磨細(xì)，進(jìn)行組織破碎，用無菌水配成5%的煙葉溶液；
B、病菌孢子培養(yǎng):將培養(yǎng)皿中已經(jīng)長有赤星病菌的菌絲用消毒刀片切成小塊，再轉(zhuǎn)接到Czapek培養(yǎng)基平板上，每個平板接種6個點。置于25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，產(chǎn)生孢子后用煙葉溶液將孢子洗下，繼續(xù)靜置培養(yǎng)8小時，促進(jìn)孢子萌發(fā)，得到赤星病菌孢子懸浮液，其孢子濃度為2.3 X IO4個/ml，發(fā)芽率為88% ；
C、待鑒煙葉預(yù)處理:當(dāng)需要鑒定的煙草品種的煙葉進(jìn)入成熟期后，當(dāng)中部葉片初熟時進(jìn)行采樣。首先將煙葉置于5%的次氯酸鈉溶液中浸泡lmin，清水漂凈后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡30s，晾干表面溶液，并將加入了 10%的霍氏營養(yǎng)液的消毒棉花包裹于葉柄上。
[0033]D、抗病性鑒定:用移液槍吸取赤星病菌孢子懸浮液12 μ I滴在煙葉正面葉脈間部位，每片煙葉滴14滴，然后將煙葉置于相對濕度為95%，溫度為25°C的保濕框架內(nèi)培養(yǎng)4天，待煙葉出現(xiàn)黃色侵染斑后，測量病斑直徑，判定煙草品種其煙葉的抗病性?？共⌒澡b定用凈葉黃作抗病對照，用G140作感病對照。
[0034]鑒定結(jié)果表明:NC89品種煙葉表面的病斑直徑為1.7~2.0cm,對煙草赤星病表現(xiàn)為感病等級。
[0035]實施例2
——PVHOl和PVH06品種對煙草赤星病的抗病性鑒定
A、煙葉溶液制備:將初熟期健康無病斑的煙葉采摘后，首先置于6%的次氯酸鈉溶液中浸泡0.8min，清水漂凈后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡20s。晾干后在滅菌的研缽里磨細(xì)，進(jìn)行組織破碎，用無菌水配成4%的煙葉溶液；
B、病菌孢子培養(yǎng):將培養(yǎng)皿中已經(jīng)長有赤星病菌的菌絲用消毒刀片切成小塊，再轉(zhuǎn)接到Czapek培養(yǎng)基平板上，每個平板接種7個點。置于24°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，產(chǎn)生孢子后用煙葉溶液將孢子洗下，繼續(xù)靜置培養(yǎng)7小時，促進(jìn)孢子萌發(fā)，得到赤星病菌孢子懸浮液，其孢子濃度為1.8X IO4個/ml，發(fā)芽率為87%;
C、待鑒煙葉預(yù)處理:當(dāng)需要鑒定的煙草品種的煙葉進(jìn)入成熟期后，當(dāng)上二棚部葉片初熟時進(jìn)行采樣。首先將煙葉置于6%的次氯酸鈉溶液中浸泡0.8min，清水漂凈后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡20s，晾干表面溶液，并將加入了 IOOppm的煙用復(fù)合肥液的消毒棉花包裹于葉柄上。
[0036]D、抗病性鑒定:用移液槍吸取赤星病菌孢子懸浮液15 μ I滴在煙葉正面葉脈間部位，每片煙葉滴10滴，然后將煙葉置于相對濕度為90%，溫度為26°C的保濕框架內(nèi)培養(yǎng)3天，待煙葉出現(xiàn)黃色侵染斑后，測量病斑直徑，判定煙草品種其煙葉的抗病性?？共⌒澡b定用凈葉黃作抗病對照，用G140作感病對照。
[0037]鑒定結(jié)果表明:PVH01、PVH06品種煙葉表面的病斑直徑分別為1.9~2.1cm和1.8~2.1cm，兩個品種對煙草赤星病表現(xiàn)為感病等級。
[0038]實施例3
——9147、9102、9111-21新品系對煙草赤星病的抗病性鑒定
A、煙葉溶液制備:將初熟期健康無病斑的煙葉采摘后，首先置于4%的次氯酸鈉溶液中浸泡1.2min，清水漂凈后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡40s。晾干后在滅菌的研缽里磨細(xì)，進(jìn)行組織破碎，用無菌水配成6%的煙葉溶液；
B、病菌孢子培養(yǎng):將培養(yǎng)皿中已經(jīng)長有赤星病菌的菌絲用消毒刀片切成小塊，再轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上，每個平板接種5個點。置于26°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天，產(chǎn)生孢子后用煙葉溶液將孢子洗下，繼續(xù)靜置培養(yǎng)9小時，促進(jìn)孢子萌發(fā)，得到赤星病菌孢子懸浮液，其孢子濃度為2.1 X IO4個/ml，發(fā)芽率為90% ；
C、待鑒煙葉預(yù)處理:當(dāng)需要鑒定的煙草品種的煙葉進(jìn)入成熟期后，當(dāng)上二棚部葉片初熟時進(jìn)行采樣。首先將煙葉置于4%的次氯酸鈉溶液中浸泡1.2min，清水漂凈后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡40s，晾干表面溶液，并將加入了 IOOppm的煙用復(fù)合肥液的消毒棉花包裹于葉柄上。
[0039]D、抗病性鑒定:用移液槍吸取赤星病菌孢子懸浮液10 μ I滴在煙葉正面葉脈間部位，每片煙葉滴16滴，然后將煙葉置于相對濕度為92%，溫度為24°C的保濕框架內(nèi)培養(yǎng)5天，待煙葉出現(xiàn)黃色侵染斑后，測量病斑直徑，判定煙草品種其煙葉的抗病性?？共⌒澡b定用凈葉黃作抗病對照，用G140作感病對照。
[0040]鑒定結(jié)果表明:9147、9102、9111_21三個新品系煙葉表面的病斑直徑分別為1.4~1.8cm、1.4~1.7cm、1.0~1.3cm,三個新品系對煙草赤星病表現(xiàn)為9147和9102表現(xiàn)為感病等級，9111-21表現(xiàn)為抗病等級。/
【權(quán)利要求】
1.一種煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，其特征在于包括煙葉溶液制備、病菌孢子培養(yǎng)、待鑒煙葉預(yù)處理及抗病性鑒定工序，具體包括: A、煙葉溶液制備:將成熟期健康無病斑的煙葉消毒、晾干后，進(jìn)行組織破碎，再用無菌水配成4~6%的煙葉溶液； B、病菌孢子培養(yǎng):將赤星病菌產(chǎn)生孢子的菌絲點接種于培養(yǎng)基平板上，在培養(yǎng)箱內(nèi)24~26°C培養(yǎng)10-20天，產(chǎn)生孢子后用煙葉溶液將孢子洗下，繼續(xù)靜置培養(yǎng)7、小時，促進(jìn)孢子萌發(fā)，得到赤星病菌孢子懸浮液，其孢子濃度為1.5^2.5X IO4個/ml，發(fā)芽率> 87% ； C、待鑒煙葉預(yù)處理:當(dāng)需要鑒定抗病性的煙草品種的煙葉進(jìn)入成熟期時進(jìn)行采樣，將煙葉消毒后，晾干表面溶液，再進(jìn)行保濕處理； D:抗病性鑒定:吸取赤星病菌孢子懸浮液10-?5μ I滴在煙葉上，每片煙葉滴10-16滴，然后將煙葉置于相對濕度> 90%，溫度為24~26°C的保濕框架或人工氣候箱內(nèi)光照培養(yǎng)3飛天，待煙葉出現(xiàn)黃色侵染斑后，測量病斑直徑，判定煙草品種其煙葉的抗病性。
2.如權(quán)利要求1所述的煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，其特征在于所述成熟期健康無病斑的煙葉為初熟期煙葉。
3.如權(quán)利要求1所述的煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，其特征在于所述煙葉消毒指的是先將煙葉置于4飛％的次氯酸鈉溶液中浸泡0.8^1.2min，清水漂凈后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡2(T40s。
4.如權(quán)利要求1所述的煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，其特征在于所述培養(yǎng)基可以為燕麥培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基中的任一種。
5.如權(quán)利要求4所述的煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基或Czapek培養(yǎng)基中的任一種。
6.如權(quán)利要求1所述的煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，其特征在于所述保濕處理指的是將煙葉置于具有保濕效果的器械內(nèi)，并將加入營養(yǎng)液的消毒保濕材料包裹于葉柄上。
7.如權(quán)利要求6所述的煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，其特征在于所述營養(yǎng)液可以為10%的霍氏營養(yǎng)液、IOOppm的煙用復(fù)合肥液中的任一種。
8.如權(quán)利要求1所述的煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，其特征在于所述吸取赤星病菌孢子懸浮液滴在煙葉上之后，將煙葉置于相對濕度為95%，溫度為25°C的保濕框架或人工氣候箱內(nèi)光照培養(yǎng)4天。
9.如權(quán)利要求f8任一項所述的煙草赤星病葉片抗病性的鑒定方法，其特征在于所述測量病斑直徑，判定煙草品種其煙葉的抗病性指的是每次試驗都必須加凈葉黃作為抗病對照，G140作為感病對照，對參與鑒定的煙草品種的煙葉病斑直徑測量后進(jìn)行方差分析，與凈葉黃差異不顯著的煙草品種其葉片抗病性為抗病等級，與G140差異不顯著的煙草品種其葉片抗病性為感病等級，介于凈葉黃和G140之間的煙草品種其葉片抗病性為中抗或中感等級。
【文檔編號】C12R1/645GK103571912SQ201310540265
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】段玉琪 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院