金黃桿菌及其羰基還原酶用于阿瑞匹坦手性中間體生產(chǎn)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株金黃桿菌（Chryseobacterium?sp.CA49，保藏號為CCTCC?M2012484）及該菌基因組編碼的一種羰基還原酶ChKRED20，并利用該菌原始菌株或該種羰基還原酶作為生物催化劑制備阿瑞匹坦手性醇中間體(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。產(chǎn)物的對映體過量值大于99.9%。以ChKRED20粗酶粉可催化高達(dá)200g/L的底物，24h內(nèi)獲得99%以上轉(zhuǎn)化率，且輔酶循環(huán)體系簡單、廉價(jià)，產(chǎn)物分離提純?nèi)菀?，回收率高，極具工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利說明】金黃桿菌及其羰基還原酶用于阿瑞匹坦手性中間體生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物與酶工程領(lǐng)域，具體涉及一株金黃桿菌及其基因組編碼的一種新型羰基還原酶，并利用該菌或者這種羰基還原酶作為生物催化劑生產(chǎn)阿瑞匹坦手性中間體?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]光學(xué)活性(R)-l-[3，5_ 二(三氟甲基)苯基]乙醇是Merk公司研發(fā)的藥物阿瑞匹坦(Aprepitant,商品名“Emend”)的關(guān)鍵手性中間體。阿瑞匹坦的主要功能是預(yù)防和治療化療引起的急性或延遲性嘔吐。[0003]目前制備該手性中間體的主流工藝是化學(xué)合成。近年來，隨著生物催化技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者們積極探索采用酶催化前手性酮的方法生產(chǎn)該中間體，篩選到了一些對映體選擇性>99%的微生物菌株，包括Lactobacillus Kefir、Aspergillus niger (Tetrahedron:Asymmetry,2006,17, 2000-2005), Penicillium expansum (Tetrahedron: Asymmetry,2009, 20, 2759-2763), Leifsonia xy I i HS0904 (Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 90, 1897-1904),氧化微桿菌 Microbacterium oxydans C3 (專利號 ZL201010271579.7),以及選擇性稍差的熱帶假絲酵母菌Candida tropicalis20216 (ee 值>92%，Tetrahedron, 2004，60，789-797)等。但是，這些報(bào)道都是以微生物菌株全細(xì)胞作為生物催化劑，可轉(zhuǎn)化的底物濃度較低，目前僅有Leifsonia xyli HS0904轉(zhuǎn)化的底物濃度較高，最高可轉(zhuǎn)化的底物濃度為51g/L，30h的轉(zhuǎn)化率為91.8% (J.Microbiol.Biotechnol.2013, 23 (3)，343-350)?？紤]產(chǎn)物分離純化成本問題，這些菌株的轉(zhuǎn)化能力與實(shí)際應(yīng)用還有較大的距離。[0004]為獲得高效的前手性酮催化工藝，首先應(yīng)解決高效高選擇性酶源問題，從環(huán)境中篩選新型微生物菌株作為催化劑是常用的有效途徑之一。然而原始菌株直接轉(zhuǎn)化可能存在安全性、遺傳穩(wěn)定性問題，原始菌株可能繼續(xù)利用醇產(chǎn)物導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量低以及原始菌株內(nèi)的其他酶可能對底物作用生成副產(chǎn)物等問題，因此將原始菌株的關(guān)鍵羰基還原酶基因克隆并異源表達(dá)，以重組菌或者酶用于生物轉(zhuǎn)化則可避免上述問題，且這種催化體系較為簡單， 穩(wěn)定，產(chǎn)物分離提純?nèi)菀祝子诠I(yè)化。
【發(fā)明內(nèi)容】
`[0005]本發(fā)明的目的是公開一種新篩選的金黃桿菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49), 及其所產(chǎn)高活力高對映選擇性羰基還原酶ChKRED20，并利用該菌或者該酶還原底物 3，5-雙三氟甲基苯乙酮制備光學(xué)純(R)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，從而以生物催化的方法制備高光學(xué)純度的阿瑞匹坦手性中間體。該菌從果園土壤中富集、分離并經(jīng)過多輪篩選后獲得。關(guān)于該菌的保藏信息是:保藏號為CCTCC M2012484 ;分類命名為金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49);于2012年11月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址是湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心。[0006]基于上述發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)，保藏編號為 CCTCC M2012484)。
[0007]本發(fā)明還提供了上述金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)的篩選方法， 所述篩選方法為:于果園采集土樣，以3，5-雙三氟甲基苯乙酮為唯一碳源，經(jīng)2輪富集篩選獲得可能的產(chǎn)酶菌株。將初篩菌株培養(yǎng)后，以休止細(xì)胞為催化劑轉(zhuǎn)化底物，測定產(chǎn)物生成量和產(chǎn)物對映體過量值,并將產(chǎn)物對映體過量值高的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定,得到本發(fā)明涉及的金黃桿菌。
[0008]本發(fā)明還提供一種上述金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)作為生物催化劑在轉(zhuǎn)化底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮生成(R)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。
[0009]具體地，上述用途的操作方法為:將篩選的金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)培養(yǎng)后，收集菌體，以休止細(xì)胞作為催化劑，并添加異丙醇和葡萄糖作為輔酶循環(huán)底物，底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后得到(R)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基] 乙醇，產(chǎn)物的對映體過量值>99%。
[0010]另外，本發(fā)明還提供一種羰基還原酶ChKRED20。該酶是從上述金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中調(diào)取出來的。
[0011]本發(fā)明還提供一種上述羰基還原酶ChKRED20作為生物催化劑在轉(zhuǎn)化底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮生成(R)-l_[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。
[0012]其中，從上述金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中關(guān)鍵羰基還原酶基因ChKRED20的調(diào)取和生物轉(zhuǎn)化包括以下步驟:
[0013](I)基因chKRED20的調(diào)取和鑒定:
[0014]將上述金黃桿菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49)全基因組測序(深圳華大基因公司完成)，根據(jù)測序框架圖預(yù)測的基因功能，調(diào)取出40余個(gè)可能`具有羰基還原酶功能的基因，將這些基因用常規(guī)PCR方法克隆，并連入pET28a ( + )載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3) 中以常規(guī)方法過量表達(dá)。將這些重組菌休止細(xì)胞作為催化劑轉(zhuǎn)化3，5-雙三氟甲基苯乙酮， 獲得R-型醇產(chǎn)物且ee值大于99%的酶有3個(gè)(ChKRED08、ChKRED 19, ChKRED20)。在培養(yǎng)基中加入或者不加入3，5-雙三氟甲基苯乙酮，以新鮮培養(yǎng)的菌提取總RNA，通過RT-PCR分析，兩種情況下均只有ChKRED08和ChKRED20酶的基因表達(dá)(總RNA提取和RT-PCR方法均為常規(guī)方法)。同時(shí)，測定了 ChKRED08和ChKRED20酶的活力，ChKRED20酶活是ChKRED08的 7倍左右。因此,最后確定金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中關(guān)鍵羰基還原酶基因?yàn)閏hKRED20。
[0015]其中，上述步驟中涉及的chKRED20基因PCR擴(kuò)增所用引物為:正向5' -GAATTCAT GGGAATTTTAGACAACAAAGTAGC-3'(酶切位點(diǎn) EcoR I)，反向 5' -GTCGACTTAAACTGCCGTGTAGC CACC-3'(酶切位點(diǎn) Sal I);
[0016]PCR 條件為，95°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，55。。退火 30s，72。。延伸 Imin, 30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物連入pMD19T載體構(gòu)建TA克隆，而后將測序正確的質(zhì)粒以EcoR I和Sal I酶切，將其連入以同樣酶消化的pET28a( + )空載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒， 并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，構(gòu)建重組菌。
[0017]chKRED20基因堿基數(shù)為750bp，其序列為(SEQ N0.1)[0018]ATGGGAATTTTAGACAACAAAGTAGCACTTGTTACAGGAGCAGGATCCGGAATCGGATTAGCTGTTGCT CATTCGTATGCAAAAGAAGGCGCCAAAGTTATTGTATCCGATATTAATGAAGATCACGGTAACAAAGCAGTCGAAGA CATTAAAGCACAAGGCGGGGAAGCGTCTTTT GTAAAAGCAGATACTTCAAACCCTGAAGAAGTGGAAGCTTTAGTA AAAAGAACAGTAGAAATCTACGGAAGACTTGATATTGCATGTAATAATGCGGGAATCGGTGGCGAACAGGCGCTGGC AGGCGATTACGGTCTCGACAGCTGGCGAAAAGTATTAAGCATAAATCTTGATGGCGTATTCTACGGGTGCAAATATG AGTTAGAACAAATGGAAAAAAACGGGGGCGGCGTTATTGTGAATATGGCCTCTATTCATGGTATTGTTGCTGCACCG CTTTCCTCAGCCTACACTTCTGCAAAGCACGCAGTGGTAGGGCTTACTAAAAATATAGGAGCAGAATACGGACAGAA AAATATCCGTTGCAATGCGGTGGGGCCTGCTTATATTGAAACCCCGCTGTTGGAAAGCCTGACAAAGGAAATGAAGG AAGCACTGATTTCAAAACATCCGATGGGAAGACTGGGAAAACCTGAAGAAGTAGCAGAACTGGTGTTGTTCCTGAGT TCAGAAAAATCATCTTTTATGACGGGAGGCTATTATCTTGTAGATGGTGGCTACACGGCAGTTTAA ；[0019]chKRED20基因編碼249個(gè)氨基酸，序列為(SEQ N0.2):[0020]MGILDNKVALVTGAGSGIGLAVAHSYAKEGAKVIVSDINEDHGNKAVEDIKAQGGEASFVKADTSNPEE VEALVKRTVEIYGRLDIACNNAGIGGEQALAGDYGLDSWRKVLSINLDGVFYGCKYELEQMEKNGGGVIVNMASIHG IVAAPLSSAYTSAKHAVVGLTKNIGAEYGQKNIRCNAVGPAYIETPLLESLTKEMKEALISKHPMGRLGKPEEVAELV LFLSSEKSSFMTGGYYLVDGGYTAV。[0021](2)重組菌生物催化:[0022]挑取單克隆至LB(含卡那霉素50 μ g/ml)培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，以1%的接種量轉(zhuǎn)接至TB (含卡那霉素50 μ g/ml)培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3h，加入0.5mM IPTG誘導(dǎo)后，30°C 繼續(xù)培養(yǎng)至20~36h。8000rpm，4°C離心收集菌體，用pH值為7.0,0.1M濃度的磷酸鉀緩沖溶液洗滌2次，獲得濕菌體。[0023]取上述新鮮培養(yǎng)的濕菌體重懸于上述緩沖液，加入底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮， 加入1%~3% (w/v,占總轉(zhuǎn)化體系的質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù))葡萄糖和/或5%異丙醇(v/v，占總轉(zhuǎn)化體系的體積百分?jǐn)?shù))作為輔酶循環(huán)底物。轉(zhuǎn)化體系中菌體濃度為50~150g/L，底物終濃度為I~150g/L，轉(zhuǎn)化溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為230rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為I~24h。[0024](3) ChKRED20酶的輔酶依賴型和比活力測定[0025]ChKRED20酶的純化采用鎳柱親和層析(Bio-Rad)。將上述步驟(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)20~ 36h后的菌體以13，000rpm，4°C離心收集，重懸于Buffer A (50mM磷酸鹽緩沖液，pH8.0， 300mM NaCl，IOmM咪唑)，超聲破碎(超聲10s，間隔30s，30次)，之后以13，OOOrpm，4°C離心 20min，將上清液加入已用Buffer A平衡的柱料中，輕微混勻30min，用含有20mM咪唑的 Buffer A漂洗雜蛋白，再用含250mM咪唑的Buffer A的緩沖液洗脫目的蛋白，最后電泳鑒定純度，并用BCA Protein Assay kit測定蛋白`濃度。[0026]輔酶依賴型的確定:磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.0)，加有0.2mg/ml純酶，IOmM底物和20mM NADH或者NADPH，30°C反應(yīng)2h。等體積乙酸乙酯萃取，測定產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。以NADH 為輔酶時(shí)，轉(zhuǎn)化率為76% ;以NADPH為輔酶時(shí)，轉(zhuǎn)化率為56% ;兩者的ee值均大于99.9%，因此該酶以NADH為輔酶時(shí)轉(zhuǎn)化率更高。[0027]比活力測定反應(yīng)條件:1ml磷酸鉀緩沖液(0.1Μ，ρΗ7.0)加有0.2mg純酶，IOmM底物和40mM NADH，30°C反應(yīng)lmin。等體積乙酸乙酯萃取，測定產(chǎn)物的生成量。酶活力單位定義為:lmin內(nèi)催化生成I μ mo I產(chǎn)物所需的酶量。ChKRED20純酶的比活力達(dá)到43U。[0028](4)粗酶粉生物催化:[0029]表達(dá)ChKRED20酶的大腸桿菌重組菌的菌體培養(yǎng)、獲得濕菌體的步驟同步驟(2)。
[0030]取新鮮培養(yǎng)的濕菌體重懸于磷酸鹽緩沖液(pH7.0,0.1M)，濕菌體終濃度為50~ 150g/L,以超聲破碎機(jī)破細(xì)胞，13，OOOrpm離心后取上清液冷凍于_80°C過夜，而后用冷凍干燥機(jī)干燥至粉狀，制成粗酶粉。轉(zhuǎn)化體系為:磷酸鉀緩沖液(0.1M，PH7.0)，粗酶粉，底物 3，5-雙三氟甲基苯乙酮，異丙醇(輔酶循環(huán)底物，用量為40%，v/v), Na-NAD (200mg/L);轉(zhuǎn)化條件:30°C, IOOrpm, 24h。
[0031]粗酶粉用量為10g/L，底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮濃度為200g/L，轉(zhuǎn)化24h可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率>99%, ee值>99.9%。
[0032]本發(fā)明涉及的金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)可高效轉(zhuǎn)化3，5_雙三氟甲基苯乙酮生成R-醇，其關(guān)鍵羰基還原酶基因chKRED20與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他基因的相似度最高70%，氨基酸序列的最高相似度為76%，與已報(bào)道的功能蛋白(NCBI登錄號為: BAD99642)的最高相似度為51%，為(R)-l_[3，5_ 二(三氟甲基)苯基]乙醇生物催化合成提供了可供選擇的新型酶源。
[0033]該蛋白在大腸桿菌中過量表達(dá)后制成粗酶粉，10g/L的酶量便可在24h內(nèi)轉(zhuǎn)化高達(dá)200g/L的底物，且轉(zhuǎn)化率為99%以上，ee值大于99.9%。粗酶轉(zhuǎn)化工藝簡單，以廉價(jià)異丙醇和少量NAD+作為輔酶循環(huán)，產(chǎn)物易于分離純化，回收率高達(dá)90%以上，極具工業(yè)應(yīng)用前
旦
o
[0034]凡是與ChKRED20氨基酸相似度高于51%且具有催化3，5_雙三氟甲基苯乙酮生成 (R)-l-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇功能的酶均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035]圖1是ChKRED20蛋白純化后SDS-PAGE圖。`【專利附圖】
【附圖說明】
[0036]以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明。實(shí)施方案為便于更好的理解本發(fā)明，但并非對本發(fā)明的限制。
【具體實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例1:菌株篩選
[0038]于某果園采集土樣，以3，5-雙三氟甲基苯乙酮(2g/L)為唯一碳源并添加無機(jī)鹽于 30°C，230rpm 培養(yǎng) 7 ~10 天。無機(jī)鹽為:Na2HP042g/L，KH2PO41 g/L, NH4Cl0.4g/L， MgCl20.4g/L。從富集液中取出1%加入到上述相同培養(yǎng)基中再次富集培養(yǎng)7~10天。而后將培養(yǎng)液稀釋IO4倍，并涂布至篩選平板上(上述無機(jī)鹽+3，5-雙三氟甲基苯乙酮lg/L + 酵母粉0.5g/L +瓊脂粉15g/L)，30°C培養(yǎng)I~3天，每支平板上可見許多微生物單菌落，這些菌株為可能的產(chǎn)酶菌株。
[0039]將富集平板中的單菌落用無菌牙簽逐一接入24孔篩選板各孔(Costar，美國)進(jìn)行培養(yǎng)(每孔裝有發(fā)酵培養(yǎng)基1ml，發(fā)酵培養(yǎng)基組分:蛋白胨5g/L，牛肉膏1.5g/L，酵母粉
1.5g/L, NaC15g/L,葡萄糖 10g/L), 30。。, 240rpm 培養(yǎng) 24h。6000rpm 離心收集菌體，用磷酸鉀緩沖液(pH7.0,0.1M)洗滌2次，再加入Iml緩沖液重懸菌體，而后加入底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮5mg, 30°C, 270rpm進(jìn)行生物催化篩選試驗(yàn)。轉(zhuǎn)化36h后，以200 y I乙酸乙酯萃取。以氣相手性柱分析產(chǎn)物的對映體過量值，得到產(chǎn)(R)-醇菌株5株。其中I株為本發(fā)明涉及的金黃桿菌(Chryseobacterium sp.CA49),產(chǎn)物對映體過量值大于99%。
[0040]實(shí)施例2:篩選菌株的鑒定
[0041]為確定該菌株分類地位并詳細(xì)了解其性能，對該菌株進(jìn)行了初步鑒定。該菌株的菌落為圓型，光滑，隨培養(yǎng)時(shí)間不同，菌落呈淺黃色到金黃色。
[0042]16S rRNA鑒定:基因組DNA為模板，以細(xì)菌通用引物27f和1492r擴(kuò)增16S rRNA 序列，并將PCR產(chǎn)物直接送樣測序，獲得的部分序列(1381bp)如下(SEQ N0.3):
[0043]AGCTGAGCGGTAGAGTTTCTTCGGAGACTTGAGAGCGGCGTACGGGTGCGGAACACGTGTGCAACCTGC CTTTATCAGGGGGATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCCCATAATATATAGAGTGGCATCACTTTATATTGAAA ACTGAGGTGGATAAAGATGGGCACGCGCAAGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCGATGATCTTTA GGGGGCCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAAT ATTGGACAATGGGTTAGCGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGAAGGACGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTG TACAGGGATAAACCTATTTACGTGTAAATAGCTGAAGGTACTGTACGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGATCTGTAAGTCAG TGGTGAAATCTCACAGCTT AACTGTGAAACTGCCATTGATACTGCAGGTCTTGAGTAAGGTAGAAGTGGCTGGAAT AAGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACTTAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTCACTATGTCTTAACTGAC GCTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGCTAACTCGTT TTTGGGCTTTCGGGTTCAGAGACTAAGCGAAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGAACGCAAGTTTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGATTATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAG GCTTAAATGGGAATTGATCGGTTTAGAAATAGACCTTCCTTCGGGCAATTTTCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAG CTCGTGCCGTGAGGTGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTTACTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGGA CTCTAGTAAGACTGCCTACGCAAGTAGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGCCTTGGGC CACACACGTAATACAATGGCCGGTACAGAGGGCAGCTACACAGCGATGTGATGCAAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGT TCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATA CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC`GTCAAGCCATGGAAGTCTGGGGTACCTGAAGTCGGTGACCGTAAAAGGAG CTGC
[0044]經(jīng)NCBI的 blast 比對，該菌與 Chryseobacterium taiwanense, Chryseobacterium sp.MG-2011-139-ER、Chryseobacterium sp.HNRl2 等菌株的同源性大于 99%,初步可確定為 Chryseobacterium sp.金黃桿菌屬，實(shí)驗(yàn)室自編號為 Chryseobacterium sp.CA49, 2012 年 11月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M2012484。
[0045]實(shí)施例3:金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)原始菌株生物催化
[0046]菌株培養(yǎng):將少量金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)斜面種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(組分同實(shí)施例1 )，30°C，230rpm培養(yǎng)16~24h制備種子液，以0.5%~2%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:30°C，230rpm，24~48h。
[0047]休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化:將第I步培養(yǎng)的菌體以13，OOOrpm離心收集，用pH值為7.0,0.1M 濃度的磷酸鉀緩沖溶液洗滌2次。轉(zhuǎn)化體系包括磷酸鹽緩沖液(pH值7.0,0.1M)、菌體、底物和輔酶循環(huán)底物。輔酶底物為5%~10% (v/v)的異丙醇和2%~5% (v/w)的葡萄糖。菌體濃度為50~200g/L，底物終濃度為I~50g/L，轉(zhuǎn)化溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為230rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為5~24h。以下為幾種原始菌株休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化的具體實(shí)施例:
[0048](I)取菌體0.5g重懸于IOml緩沖液,加入底物3，5_雙三氟甲基苯乙酮IOmg,并加入異丙醇0.5ml (5%)和葡萄糖0.2g (2%)，30°C，230rpm轉(zhuǎn)化5h。以IOml乙酸乙酯萃取，取有機(jī)相氣相色譜(SGE，澳大利亞，AC-5,30mX0.22)測定轉(zhuǎn)化率為95.6%，氣相手性柱 (CHIRASIL-DEX CB，瓦里安 25mX0.25)測定產(chǎn)物 ee 值大于 99%。[0049].夕入CF,印人、,'O,[0050]產(chǎn)物數(shù)據(jù)如下:[0051]無色液體，[a]D25=+21.6(c=l，乙腈)；[0052]ee>99%(CHIRASIL-DEX CB,柱溫:120 °C，進(jìn)樣器:260 °C,檢測器:280 °C， t=8.403min);[0053]IH NMR (600MHz, CDCl3): δ 7.84 (s, 2H, Ar-H)，7.78 (s, 1H, Ar-H)，5.04 (q, J=6.54Hz ，1H, -CH)，1.99 (br, 1H, OH)，1.55 (d, J=6.54Hz, 3H, -CH3)[0054](2)取菌體1.0g重懸于IOml緩沖液中，加入底物lOOmg，葡萄糖和異丙醇添加量同上，轉(zhuǎn)化條件和分析方法也同上。底物的轉(zhuǎn)化率為91.5%，產(chǎn)物對映體過量值大于99%。[0055](3)取菌體1.5g重懸于IOml緩沖液中，加入底物500mg，并加入異丙醇1.0ml (10%)和葡萄糖0.5g (5%)，30°C，230rpm轉(zhuǎn)化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，經(jīng)氣相色譜分析，底物的轉(zhuǎn)化率為90.8%，產(chǎn)物對映體過量值大于99%。[0056]實(shí)施例4:羰基還原酶ChKRED20重組菌全細(xì)胞生物催化[0057]羰基還原酶ChKRED20重組菌的培養(yǎng)方法和菌體收集方法見說明書
【發(fā)明內(nèi)容】
部分。[0058](I)取菌體0.5g，重懸于IOml磷酸鹽緩沖液，加入底物IOmg和0.1g葡萄糖，30°C， 230rpm轉(zhuǎn)化2h。以IOml乙酸乙酯萃取，經(jīng)氣相色譜分析，底物的轉(zhuǎn)化率為30.1%，產(chǎn)物對映體過量值大于99.9%。[0059](2)取菌體0.5g，重懸于IOml磷酸鹽緩沖液，加入底物10mg，0.2g葡萄糖和0.5ml 異丙醇，30°C，230rpm轉(zhuǎn)化lh。以IOml乙酸乙酯萃取，經(jīng)氣相色譜分析，底物的轉(zhuǎn)化率為 29.5%，產(chǎn)物對映體過量值大于99.9%。[0060](3)取菌體1.0g,重懸于IOml磷酸鹽緩沖液，加入底物500mg和0.2g葡萄糖， 30°C，230rpm轉(zhuǎn)化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，經(jīng)氣相色譜分析，底物的轉(zhuǎn)化率為88.2%，產(chǎn)物對映體過量值大于99.9%。[0061](4)取菌體1.0g,重懸于IOml磷酸鹽緩沖液，加入底物500mg和0.5ml異丙醇， 30°C，230rpm轉(zhuǎn)化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，經(jīng)氣相色譜分析，底物的轉(zhuǎn)化率為79.1%，產(chǎn)物對映體過量值大于99.9%。[0062](5)取菌體1.5g,重懸于IOml磷酸鹽緩沖液,加入底物1500mg和0.5ml異丙醇， 30°C，230rpm轉(zhuǎn)化24h。以IOml乙酸乙酯萃取，經(jīng)氣相色譜分析，底物的轉(zhuǎn)化率為46.1%，產(chǎn)物對映體過量值大于99.9%。[0063]實(shí)施例5:羰基還原酶ChKRED20純酶生物催化[0064]轉(zhuǎn)化體系:磷酸鉀緩沖液(0.1M，pH7.0)，純酶濃度2g/L，底物3，5_雙三氟甲基苯乙酮，異丙醇40% (V/V)，Na-NAD200mg/L，30°C生物轉(zhuǎn)化。反應(yīng)`結(jié)束后用等體積乙酸乙酯萃取，氣相色譜分析轉(zhuǎn)化率和ee值，結(jié)果見表1。
[0065]表1羰基還原酶ChKRED20純酶對不同濃度底物轉(zhuǎn)化
[0066]
【權(quán)利要求】
1.一種保藏號為 CCTCC M2012484 的金黃桿菌 CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)。
2.一種從權(quán)利要求1所述的金黃桿菌CA49 (Chryseobacterium sp.CA49)中調(diào)取出來的羰基還原酶ChKRED20，其特征在于其核苷酸序列為如SEQ N0.1所示，其氨基酸序列為如 SEQ N0.2 所示。
3.權(quán)利要求1所述的金黃桿菌CA49作為生物催化劑在轉(zhuǎn)化底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮生成(R)-l_[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的羰基還原酶ChKRED20作為生物催化劑在轉(zhuǎn)化底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮生成(R)-l_[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/01GK103497911SQ201310399109
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】吳中柳, 劉艷, 湯脫險(xiǎn), 裴小瓊 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所