一種高效花生根瘤固氮菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新的根瘤固氮菌菌株，所述菌株具有較高的生物固氮活性，對植物真菌病害有一定的防治作用，且具有較好的耐鹽堿性和耐高溫特性，可起到固氮防病、抗逆、增產(chǎn)的作用。所述根瘤固氮菌（Rhizobiumleguminosarum）已經(jīng)于2013年7月15日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.7924。研究表明，所述菌株可以使花生根部結(jié)瘤、對灰霉病菌和腐霉病菌具有良好的抑制效果、具有耐鹽堿性以及耐高溫性能。
【專利說明】一種高效花生根瘤固氮菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一株對花生具有良好固氮和抑菌作用的根瘤固氮菌株及其在制備生物固氮菌肥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]氮素是植物生長最重要的營養(yǎng)元素之一，作物增產(chǎn)常需要施用大量氮肥。植物在土壤中生長主要依靠化學(xué)肥料和生物固氮作用來提供氮源。由于化學(xué)肥料的生產(chǎn)成本較高，利用率較低以及對土壤及環(huán)境所造成的巨大影響，使得生物固氮成為研究者關(guān)注的重點(diǎn)。生物固氮是固氮微生物將空氣中的N2轉(zhuǎn)化為NH3的過程，該過程是高效、環(huán)保和經(jīng)濟(jì)有效的。目前，研究最為廣泛、固氮效率較高的是與豆科植物共生的根瘤固氮菌。它具有固氮能力強(qiáng)、固氮量大、抗逆能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，不僅可以提高土壤肥力，也可以減少化肥的使用量，降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染。
[0003]隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)根瘤固氮菌與一些微量元素復(fù)配，可以明顯增加豆科植物的生物學(xué)產(chǎn)量。比如在花生根瘤固氮菌肥中適當(dāng)添加鑰元素，能夠明顯提高花生的固氮效果，進(jìn)一步研究表明鑰是固氮酶的組分之一，是豆科植物與根瘤固氮菌之間共生固氮過程中所必需的營養(yǎng)元素之一，花生上缺鑰時常表現(xiàn)根瘤發(fā)育不良，瘤偏小且少、固氮能力下降。還有研究發(fā)現(xiàn)，鐵肥與根瘤固氮菌混施情況下，可以促進(jìn)根瘤固氮菌與花生的共生固氮效應(yīng)，增加植株干重，提高植株全氮含量和葉綠素含量。另據(jù)報道，適宜濃度的鈷也能促進(jìn)根瘤固氮菌的生長繁殖、有助于結(jié)瘤的形成及植株的生長發(fā)育，如施用氯化鈷后可以改善豆科植物花生和大豆的外觀，提高了葉綠素含量、植株固氮能力及植株干重。綜合研究表明經(jīng)接種花生根瘤菌后，再追施鑰磷、鑰氮、磷氮及鑰磷氮等混合肥料比僅接種根瘤菌時增產(chǎn)更加明顯，而以根瘤菌+鑰磷氮混合施用效果最好。然而，由于不同根瘤固氮菌對微量元素的耐受性和土壤環(huán)境有所差異，因此“根瘤固氮菌+微量元素”復(fù)合菌肥的研制中，根瘤固氮菌與適宜的微量元素的配伍，以及二者的復(fù)合比例也是需要進(jìn)行選擇和優(yōu)化的?！? 此外，根瘤固氮菌株與其他有益菌株的合理復(fù)配能夠進(jìn)一步增強(qiáng)植株的固氮能力，促進(jìn)營養(yǎng)吸收和提高抗病抗逆能力，比如溶磷鉀微生物巨大芽孢桿菌(ACCC10008 Bacillusmegaterium)能夠分泌一些生長調(diào)節(jié)物質(zhì),促進(jìn)花生對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和根系生長,但這方面的研究也是處于探索階段。
[0004]目前，結(jié)合土壤肥力水平和高效菌株的選育，研制和應(yīng)用高效微生物肥料對提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)、降低成本、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)和生態(tài)農(nóng)業(yè)具有重要的意義。目前國內(nèi)外科研人員在根瘤固氮菌的分離篩選方面做了大量的工作，以期獲得一些高效的根瘤固氮菌株。本發(fā)明從我國北方地區(qū)土壤中分離得到一種新的根瘤固氮菌株，不僅有高效地固氮能力，還具有對植物病原菌很好的拮抗作用和耐鹽堿、耐高溫特性，并確定其在生物固氮肥料中的應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明目的是提供一種新的根瘤固氮菌菌株，所述菌株具有較高的生物固氮活性，對植物真菌病害有一定的防治作用，且具有較好的耐鹽堿性和耐高溫特性，可起到固氮、防病、抗逆、增產(chǎn)的作用。
[0006]本發(fā)明所述的豌豆根瘤菌(Rhizobium Ieguminosarum)已經(jīng)于2013年7月15日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中科院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.7924。
[0007]本發(fā)明所提供的根瘤固氮菌株是2012年7月在山東濰坊花生種植基地分離得到的，其實(shí)驗室命名為MSBl 103。
[0008]將菌株MSBl 103在YMA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述YMA固體培養(yǎng)基的組分為:甘露醇10 g, K2HPO4 0.25 g, MgSO4 0.2 g, KH2PO4 0.25 g, NaCl 0.1 g, CaCO3 3 g，酵母粉 3 g，瓊月旨15 g，蒸餾水1000 mL。通過觀察發(fā)現(xiàn)，初期菌落為半透明點(diǎn)狀物，后期菌落為圓形、乳白色、半透明、邊緣整齊。革蘭氏陰性菌，無芽孢存在。顯微觀察菌體為桿狀，運(yùn)動，有鞭毛。利用生理生化對其進(jìn)行鑒定:主要包括明膠水解、接觸酶試驗、固氮能力及5%NaCl呈陽性；淀粉水解、吲哚產(chǎn)生、檸檬酸鹽利用、V-P測定、卵磷脂降解、硝酸鹽還原呈陰性。然后利用分子生物學(xué)手段對采用16S rDNA基因特異引物對16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收并測序，將測序結(jié)果進(jìn)行Blast分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與菌株MSBl 103高度同源的菌株均是Ieguminosarum,同源性 9 5% 以上。
[0009]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供上述根瘤固氮菌株在花生植株中的固氮及防治植物病害的用途。
[0010]優(yōu)選地,所述植物病害的病原體為腐霉病菌sp.)或灰霉病菌cinerea)。
[0011]進(jìn)一步地，本發(fā)明 是提供上述根瘤固氮菌株在花生植株上共生固氮以及在生物固氮菌肥中的應(yīng)用。
[0012]進(jìn)一步地，本發(fā)明的上述根瘤固氮菌株可單獨(dú)用于制備固氮菌菌劑；即將所述菌株在YMA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述YMA培養(yǎng)基為甘露醇10 g, K2HPO4 0.25 g, MgSO4 0.2 g, KH2PO4
0.25 g，NaCl 0.1 g, CaCO3 3 g，酵母粉 3 g，蒸餾水 1000 mL ;培養(yǎng)溫度為 25_30°C，以 200rpm發(fā)酵3d，待菌液濃度達(dá)到I X IO9個/mL發(fā)酵結(jié)束，即制得本發(fā)明的液態(tài)的固氮菌菌劑。
[0013]進(jìn)一步地，本申請還提供一種復(fù)合微生物菌肥，即將上述固氮菌菌劑與其他有益成分進(jìn)行復(fù)配，所述有益成分為微量元素肥料、其它有益的微生物菌株、有機(jī)肥或無機(jī)氮磷鉀肥料等。
[0014]本申請涉及一種復(fù)合微生物菌肥，即將上述固氮菌菌劑與微量元素肥料以重量比為1:3進(jìn)行混合，所述微量元素肥料選自碳酸錳鋅、硼鎂肥、鑰酸鈉、螯合態(tài)銅或磷酸銨鐵中的一種或多種；
進(jìn)一步地，本申請涉及另一種復(fù)合微生物菌肥，即將上述固氮菌菌劑與微量元素肥料和拮抗微生物混合制得，三者的重量比為3:4:3，所述微量元素肥料選自碳酸錳鋅、硼鎂肥、鑰酸鈉、螯合態(tài)銅或磷酸銨鐵中的一種或多種；所述拮抗微生物為枯草芽孢桿菌{Bacillus例如武大綠洲生物生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌QBacillus subtilus)。
[0015]進(jìn)一步地，本申請涉及另一種復(fù)合微生物菌肥，即將上述固氮菌菌劑與微量元素肥料和有機(jī)肥混合制得，三者的重量比為1:3:6 ;所述微量元素肥料選自碳酸錳鋅、硼鎂肥、鑰酸鈉、螯合態(tài)銅或磷酸銨鐵中的一種或多種；所述有機(jī)肥為堆肥或沼氣肥。
[0016]本申請的上述復(fù)合微生物菌肥將原料按比例充分?jǐn)嚢瑁旌暇鶆?，隨后用傳送帶經(jīng)粉碎后送入滾筒造粒機(jī)，在滾筒內(nèi)噴射蒸汽使物料加熱至20-40°C，通過滾筒不停轉(zhuǎn)動使物料成球狀顆粒。將成球顆粒送入烘干滾筒，輸入熱風(fēng)烘干。將烘干的成球經(jīng)冷卻、篩分、罐裝或袋裝成成品。
[0017] 本發(fā)明的效果
1、在溫室試驗中，本發(fā)明的根瘤固氮菌株可以使花生根部結(jié)瘤，說明本發(fā)明菌株具有固氮能力。
[0018]2、在平板對峙法中，本發(fā)明的根瘤固氮菌株對灰霉病菌和腐霉病菌具有良好的抑制效果，抑制率均在60%以上，說明本發(fā)明菌株具有一定的抑菌性。
[0019]3、在耐鹽堿性試驗中，本發(fā)明的根瘤固氮菌株可在pH為9甚至11的培養(yǎng)基中有效生長，說明本發(fā)明菌株具有一定的耐堿性。
[0020]4、在耐高溫試驗中，本發(fā)明的根瘤固氮菌株可在溫度為45°C條件下有效生長，說明本發(fā)明菌株具有一定的耐高溫性。
[0021]【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1本發(fā)明的根瘤固氮菌MSB1103在花生上結(jié)瘤 圖2本發(fā)明的根瘤固氮菌MSB1103菌落形態(tài)圖 圖3本發(fā)明的根瘤固氮菌MSB1103革蘭氏染色圖 圖4本發(fā)明的根瘤固氮菌MSB1103固氮基因nif?部分序列鑒定電泳圖譜 圖5本發(fā)明的根瘤固氮菌MSB1103耐鹽堿性檢測 圖6本發(fā)明的根瘤固氮菌MSB1103耐高溫檢測 圖7本發(fā)明的根瘤固氮菌MSB1103拮抗真菌效果
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明公開了一種具有高固氮活性、耐高溫、耐鹽堿、且對植物真菌病害具有防治作用的根瘤固氮菌株，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)來實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，這些都被視為包括在被發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明所述的根瘤固氮菌株已經(jīng)通過較規(guī)范的實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不擺脫本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動和適當(dāng)?shù)淖兏c組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1、本發(fā)明根瘤固氮菌MSB1103的分離獲取
2012年7月在山東濰坊花生種植基地采集到一株結(jié)瘤多生長茂盛的花生，對其根部根瘤進(jìn)行分離及純化:取新鮮的根瘤，用水沖洗干凈，并用濾紙吸干表面水分；將根瘤放入95%的酒精中處理3 min，再放入0.1%的HgCl2中，滅菌3_5 min，取出后用無菌水沖洗5_6次；將經(jīng)滅菌的根瘤放在滅菌的載玻片上切成兩半，用無菌的鑷子夾住半個瘤，切口面向YMA培養(yǎng)基表面劃線，倒置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所述YMA培養(yǎng)基的組成為:甘露醇10 g,K2HPO40.25 g，MgSO4 0.2 g，KH2PO4 0.25 g，NaCl 0.1 g，CaCO3 3 g，酵母粉 3 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1000 mL。[0025]實(shí)施例2、接種鑒定
按照實(shí)施例1所述，本發(fā)明共篩選得到11株固氮菌，將11株固氮菌進(jìn)行接種鑒定。試驗用滅菌的質(zhì)量比為1:1的蛭石和營養(yǎng)土的混合物作為培養(yǎng)基質(zhì)。選取飽滿的花生種子，在75%酒精中處理I min，水洗5_6次，然后用0.1%的升汞表面滅菌6 min,水洗6_7次，在無菌水中浸種過夜至吸漲。將吸漲的種子在滅菌的培養(yǎng)皿中25°C催芽。將胚根長至3-4 cm時轉(zhuǎn)移到滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)中，待花生長出4片子葉時，每盆加2 mL菌液，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以不加菌液作為空白對照。對照和接種處理各設(shè)置3個重復(fù)。
[0026]接菌的花生培養(yǎng)至2個月左右時，將花生連根拔起，注意不要破壞根部，將分離出的根瘤菌回接到花生上，能結(jié)瘤的則為根瘤菌。結(jié)果如圖1所示，即本發(fā)明的根瘤固氮菌株MSBl 103可在花生上產(chǎn)生大量根瘤。
[0027]實(shí)施例3、本發(fā)明根瘤固氮菌MSB1103的菌落形態(tài)及生理生化鑒定
將本發(fā)明的根瘤固氮菌MSB1103在YMA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，所得單菌落形態(tài)如圖2所示:生長初期菌落為半透明點(diǎn)狀物，后期菌落為圓形、乳白色、半透明、邊緣整齊。革蘭氏檢測如圖3所示，該菌為革蘭氏陰性菌，無芽孢存在。顯微觀察菌體為桿狀，運(yùn)動，有鞭毛。
[0028]對獲得的菌株進(jìn)行生理生化鑒定，包括明膠水解、接觸酶試驗、固氮能力及5%NaCl、淀粉水解、吲哚產(chǎn)生、檸檬酸鹽利用、V-P測定、卵磷脂降解及硝酸鹽還原實(shí)驗。
[0029]表1菌株的生理生化指標(biāo)測定 __
【權(quán)利要求】
1.一種根瘤固氮菌iRhizobium Ieguminosarum),其特征在于，保藏編號為CGMCCN0.7924，其于2013年7月15日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的根瘤固氮菌能在花生植株中的固氮，并具有耐高溫、耐鹽堿特性以及防治植物病害的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述防治植物病害的用途，所述植物病害的病原體為腐霉病菌iPythium sp.)或灰霉病菌cinerea ) ?
4.一種固氮菌菌劑，其特征在于，將權(quán)利要求1的菌株在YMA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述YMA培養(yǎng)基為甘露醇 10 g, K2HPO4 0.25 g, MgSO4 0.2 g, KH2PO4 0.25 g, NaCl 0.1 g, CaCO3 3g，酵母粉3 g，蒸餾水1000 mL;培養(yǎng)溫度為25-30°C，以200 rpm發(fā)酵3 d，待菌液濃度達(dá)到I X IO9個/mL發(fā)酵結(jié)束，即制得所述固氮菌菌劑。
5.一種復(fù)合微生物菌肥，其特征在于，將權(quán)利要求4的固氮菌菌劑與微量元素肥料以重量比為1:3進(jìn)行混合，所述微量元素肥料選自碳酸錳鋅、硼鎂肥、鑰酸鈉、螯合態(tài)銅或磷酸銨鐵中的一種或多種。
6.一種復(fù)合微生物菌肥，其特征在于，將權(quán)利要求4的固氮菌菌劑與微量元素肥料和拮抗微生物混合制得，三者的重量比為3:4:3，所述微量元素肥料選自碳酸錳鋅、硼鎂肥、鑰酸鈉、螯合態(tài)銅或磷酸銨鐵中的一種或多種；所述拮抗微生物為枯草芽孢桿菌{Bacillussubtilus、。
7.一種復(fù)合微生物菌肥，其特征在于，將權(quán)利要求4的固氮菌菌劑與微量元素肥料和有機(jī)肥混合制得，三者的重量比為1:3:6 ;所述微量元素肥料選自碳酸錳鋅、硼鎂肥、鑰酸鈉、螯合態(tài)銅或磷酸銨鐵中的一種或`多種；所述有機(jī)肥為堆肥或沼氣肥。
【文檔編號】C12R1/41GK103571770SQ201310379759
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】趙巍, 趙斌, 董金皋 申請人:董金皋, 趙巍, 趙斌