α淀粉酶變體及其編碼多核苷酸的制作方法

α淀粉酶變體及其編碼多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及α淀粉酶的變體。本發(fā)明還涉及編碼所述變體的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及使用所述變體的方法。
【專利說(shuō)明】α淀粉酶變體及其編碼多核苷酸
[0001 ] 涉及序列表
[0002]本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，其通過(guò)提述并入本文。
[0003]發(fā)明背景
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及α淀粉酶的變體、編碼所述變體的多核苷酸、產(chǎn)生所述變體的方法，以及使用所述變體的方法。
[0005]相關(guān)技術(shù)的描述
[0006]本發(fā)明提供親本α淀粉酶的變體，所述變體與其親本相比具有改進(jìn)的性質(zhì)。α -淀粉酶(1，4-α-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)是催化淀粉和其它直鏈和支鏈1，4-葡糖苷寡糖和多糖的水解的一類酶。
[0007]有非常多的專利和科學(xué)文獻(xiàn)涉及此類在工業(yè)上極為重要的酶。被稱為ttTeiindmyI li樣α -淀粉酶”的α -淀粉酶及其變體可在例如W090/11352，W095/10603,
W095/26397，W096/23873，和W096/23874中有介紹。Termamy丨x樣α -淀粉酶熱穩(wěn)定性很
高，因此適于高溫下實(shí)施的處理工藝，如葡萄糖生產(chǎn)過(guò)程中的淀粉液化。
[0008]還有一組稱為“Fungamyl?樣α _淀粉酶”的α -淀粉酶，它們與得自米曲霉的α -淀粉酶相關(guān)或同源。這些Fungamyl樣α -淀粉酶熱穩(wěn)定性相對(duì)較低,例如Novozymes
A/S，Demnark所銷售的商品名為FUNGAMYL?的市售產(chǎn)品，最適溫度約為55°C，因此不適于在高溫下實(shí)施的處理。目前Fungamyl樣α -淀粉酶用于制造糖漿，例如釀造工業(yè)用的糖漿。
[0009]先前已經(jīng)成功地分離了一種具有增加的熱穩(wěn)定性，優(yōu)選在酸性pH下的增加的熱穩(wěn)定性的α淀粉酶。W02004/055178公開(kāi)了來(lái)自微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的編碼一種名為AM782的α淀粉酶的基因。對(duì)這種淀粉酶的定性已經(jīng)顯示它是高度嗜熱酸性的α淀粉酶，具有一種非常令人感興趣的活性，從淀粉酶ΑΜ782水解糊精產(chǎn)生的糖譜可以看出。淀粉酶ΑΜ782能夠在很高的溫度下工作，最高達(dá)70°C。但是，這種α淀粉酶在沒(méi)有冷卻的條件下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性差。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供如SEQ ID NO: 3的ΑΜ782 (成熟多肽)的儲(chǔ)存穩(wěn)定變體，所述變體保留良好的生淀粉水解活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明涉及親本α淀粉酶的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:2的成熟多肽的128，143，141，192，20，76，123，136，142，165，219，224，265，383 和 410 位中的一個(gè)或多個(gè)位置上包含取代，其中所述變體具有α淀粉酶活性。
[0011]本發(fā)明還涉及編碼所述變體的分離的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生所述變體的方法。
[0012]本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的變體從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法。[0013]發(fā)明詳述
[0014]本發(fā)明涉及α淀粉酶的變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:2的成熟多肽的128，143，14I, 192，20，76，123，136，142，165，219，224，265，383 和 410 位中的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))位置上包含取代，其中所述變體具有α淀粉酶活性。
[0015]定義
[0016]α淀粉酶活性:術(shù)語(yǔ)“ α淀粉酶”指I, 4-α _D_葡聚糖葡聚糖水解酶，EC.3.2.1.1，其催化淀粉和其它直鏈和支鏈1，4-葡糖苷寡糖和多糖的水解。為了本發(fā)明的目的，α淀粉酶活性可以使用α淀粉酶測(cè)定試劑盒，例如可獲自Kikkoman BiochemifaCompany, Cat N0.60213的α淀粉酶測(cè)定試劑盒來(lái)加以測(cè)定。詳情可見(jiàn)“材料與方法”部分。1U=30°C，ρΗ4.0條件下釋放I μ mol CNP/min。作為替代可以使用其他合適的測(cè)定α淀粉酶活性的方法。
[0017]本發(fā)明的變體多肽具有SEQ ID NO: 2中所含的親本α淀粉酶的成熟多肽的α淀粉酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，和至少100%。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述成熟α淀粉酶由SEQ ID Ν0:3組成。
[0018]變體:術(shù)語(yǔ)“變體”意指具有α淀粉酶活性，且在一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))位置上包含改變，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代意指占據(jù)某個(gè)位置的氨基酸被不同的氨基酸所替換；缺失意指去除占據(jù)某個(gè)位置的氨基酸；而插入意指在占據(jù)某個(gè)位置的氨基酸近鄰加入一個(gè)或幾個(gè)，例如1-3個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，所述改變是取代。本發(fā)明的變體多肽具有親本α淀粉酶，例如SEQ ID NO: 3的α淀粉酶的至少20%的活性，例如至少40%，至少50%，至少60%,至少70%，至少80%，至少 90%，至少95%，和至少100%的活性。
[0019]突變體/突變的(mutant):術(shù)語(yǔ)“突變體”(或突變的)意指編碼變體的多核苷酸。
[0020]野生型酶:術(shù)語(yǔ)“野生型” α淀粉酶意指由天然存在的微生物，例如自然界中出現(xiàn)的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌所表達(dá)的α淀粉酶。
[0021]親本或親本α淀粉酶:術(shù)語(yǔ)“親本”或“親本α淀粉酶”意指這樣的α淀粉酶，它被施加改變以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體。親本可以是天然存在的(野生型)多肽或其變體。
[0022]分離的:術(shù)語(yǔ)“分離的”意指以不在自然界出現(xiàn)的形式或環(huán)境存在的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限定性實(shí)例包括(I)任何非天然存在的物質(zhì)，(2)任何至少部分地與一種或多種或所有與其天然伴隨的天然存在的成分分開(kāi)的物質(zhì)，包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；(3)任何這樣的物質(zhì):相對(duì)于在自然界存在的該物質(zhì)，其經(jīng)過(guò)人工修飾；或(4)任何這樣的物質(zhì):該物質(zhì)經(jīng)過(guò)增加該物質(zhì)相對(duì)于與其自然伴隨的其他成分的量的修飾(例如，宿主細(xì)胞中編碼該物質(zhì)的基因的多重拷貝；和與編碼該物質(zhì)的基因自然結(jié)合的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子的使用)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。
[0023]基本上純的變體:術(shù)語(yǔ)“基本上純的變體”意指這樣的制備物，其包含的與其天然伴隨或者由于重組而伴隨的其他多肽材料以重量計(jì)至多10%，至多8%，至多6%，至多5%，至多4%，至多3%，至多2%，至多1%，至多0.5%。優(yōu)選地，變體按制備物中存在的總多肽物質(zhì)的重量計(jì)是至少92%純，例如至少94%純，至少95%純，至少96%純，至少97%純，至少98%純，至少99%純，至少99.5%純，或100%純。本發(fā)明的變體優(yōu)選地呈基本上純的形式。這可以通過(guò)，例如，利用已知的重組方法或經(jīng)典的純化方法制備所述變體來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0024]成熟多肽:成熟多肽:術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個(gè)實(shí)施方案中，SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein EngineeringlO: 1-6)程序預(yù)測(cè)SEQ ID NO:2的氨基酸I至21為信號(hào)肽，而氨基酸22-33為前肽，根據(jù)該預(yù)測(cè)，成熟多肽為SEQ ID NO:2的氨基酸34-471。成熟多肽作為SEQ ID NO:3公開(kāi)。
[0025]成熟多肽編碼序列:術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有α淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個(gè)方面，SignalP (Nielsen et al., 1997, ProteinEngineeringlO:1-6)程序預(yù)測(cè)SEQ ID NO:1的核苷酸I至63編碼信號(hào)肽，且核苷酸64-99編碼前肽，根據(jù)該預(yù)測(cè)，成熟多肽編碼序列為SEQ ID NO:1的核苷酸100至1416 (包括終止密碼子)。
[0026]序列同一性:參數(shù)“序列同一性”描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,Trends in Geneticsl6:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)來(lái)測(cè)定。使用的可選參數(shù)為缺口開(kāi)啟罰分(gap open p enalty) 10,缺口延伸罰分(gap extensionpenalty) 0.5 和 EBL0SUM62 (BL0SU M62 的 EMBOSS 版)取代矩陣。使用 Needle 標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一'I"生(longest identity) ”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性，并計(jì)算如下:
[0027](同樣的殘基X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口的總數(shù))
[0028]就本發(fā)明而言，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBO SS軟件包(EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,見(jiàn)上文)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所執(zhí)行的Needle man-ffunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見(jiàn)上文)來(lái)測(cè)定。使用的可選參數(shù)為缺口開(kāi)啟罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EM BOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性，并計(jì)算如下:
[0029](同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口的總數(shù))
[0030]片段:術(shù)語(yǔ)“片段”在本文中定義為從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的多肽；其中所述片段具有α淀粉酶活性。
[0031]等位變體(allelic variant):術(shù)語(yǔ)“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過(guò)突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
[0032]基本上純的多核苷酸:術(shù)語(yǔ)“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來(lái)的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形 式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然伴隨或由于重組而伴隨的其它多核苷酸物質(zhì)。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。
[0033]編碼序列:當(dāng)用于本文時(shí)術(shù)語(yǔ)“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開(kāi)讀框決定，所述開(kāi)讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開(kāi)始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。
[0034]cDNA:術(shù)語(yǔ)“cDNA”意指能夠通過(guò)反轉(zhuǎn)錄從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級(jí)的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體,其通過(guò)一系列的步驟加工包括剪接,然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。
[0035]核酸構(gòu)建體:術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛?lái)不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段，或所述核酸分子是合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”同義。
[0036]調(diào)控序列(control sequence):術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”在本文定義為包括對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的所有成分。各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。調(diào)控序列可以具備用于引入可促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接的特異性限制位點(diǎn)的接頭。
[0037]可操作地連接:術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。
[0038]表達(dá):術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)`生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
[0039]表達(dá)載體:術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼變體的多核苷酸，并且所述多核苷酸與幫助其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。
[0040]宿主細(xì)胞:如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括任何適合于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋親本細(xì)胞的由于在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而不與親本細(xì)胞完全相同的后代。
[0041]改進(jìn)的性質(zhì):術(shù)語(yǔ)“改進(jìn)的性質(zhì)”意指變體的相比于親本有所改進(jìn)的相關(guān)性質(zhì)。這樣的改進(jìn)的性質(zhì)包括但不限于熱活性、熱穩(wěn)定性、PH活性、pH穩(wěn)定性、底物/輔因子特異性、改進(jìn)的表面性質(zhì)、產(chǎn)物特異性、增加的穩(wěn)定性、改進(jìn)的儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性、和化學(xué)穩(wěn)定性。
[0042]改進(jìn)的熱穩(wěn)定性:術(shù)語(yǔ)“改進(jìn)的熱穩(wěn)定性”意指變體在緩沖液中、或在例如在產(chǎn)品儲(chǔ)存/運(yùn)輸中存在的那些條件下，或在與該變體的工業(yè)應(yīng)用中存在的條件相似的條件下，在高溫下溫育一段時(shí)間后，顯示的殘余α淀粉酶活性相對(duì)于親本有所改善。變體可以或者可以不顯示相對(duì)于親本有所改變的熱活性規(guī)律。例如，相對(duì)于親本，變體在高溫下溫育之后重折疊的能力可能有所改進(jìn)。與作為SEQ ID NO:2的成熟多肽公開(kāi)的親本微小根毛霉α淀粉酶相比，依照本發(fā)明的變體在65°C、pH3.5溫育I小時(shí)后顯示改進(jìn)的殘余活性。殘余活性如實(shí)施例中所述加以測(cè)量。
[0043]在一個(gè)方面，當(dāng)比較殘余活性，例如使用可獲自Kikkoman BiochemifaCompany, Cat N0.60213)的淀粉酶活性試劑盒比較殘余活性時(shí),具有α淀粉酶活性的變體的熱穩(wěn)定性為相比于親本熱穩(wěn)定至少1.05倍，例如至少1.1倍，至少1.5倍，至少1.8倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少15倍，至少20倍，或至少25倍。也可以使用其他合適的淀粉酶測(cè)定法。
[0044]改進(jìn)的pH穩(wěn)定性:術(shù)語(yǔ)“改進(jìn)的pH穩(wěn)定性”意指變體在可降低親本的酶活性的特定PH下溫育一段時(shí)間之后，顯示α淀粉酶活性的保留。依照本發(fā)明的變體可在低于4.7的pH，例如低于4.5，特別是低于4.0，更特別是低于3.8，例如ρΗ3.5，具有改進(jìn)的耐性。
[0045]改進(jìn)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性:術(shù)語(yǔ)“改進(jìn)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性”意指變體在特定的PH的溫度下溫育一段時(shí)間之后，相對(duì)于親本α淀粉酶顯示出改善的殘余α淀粉酶活性。測(cè)試的條件包括在40°C、pH4.0歷時(shí)3至10天。
[0046]變體指稱規(guī)則
[0047]為本發(fā)明的目的，使用SEQ ID N0:2中包含的成熟多肽來(lái)確定另一 α淀粉酶中的相應(yīng)氨基酸殘基。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述成熟多肽由SEQ ID Ν0:3組成，且依照本發(fā)明進(jìn)行取代的具體位置參照SEQ ID Ν0:3中的位置。因此，將另一 α淀粉酶的氨基酸序列與SEQ ID NO:2中所含的成熟多肽對(duì)齊，并基于該比對(duì)，使用如EMBOSS程序包(EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice etal., 2000, Trends Genet.16:276-277),優(yōu)選5.0.0或更新的版本中的Needle程序所實(shí)現(xiàn)的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman and Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48:443-453)來(lái)確定與SEQ ID N0:2中所含的 成熟多肽中的任何氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸位置編號(hào)。
[0048]對(duì)另一 α淀粉酶中的對(duì)應(yīng)氨基酸殘基的指認(rèn)可以通過(guò)使用幾種計(jì)算機(jī)程序，以其各自的缺省參數(shù)進(jìn)行多個(gè)多肽序列的比對(duì)來(lái)加以確證，所述計(jì)算機(jī)程序包括但不限于MUSCLE (基于log-期望的多重序列比較；3.5或更新版本；Edgar, 2004, Nucleic Acids Research32:1792-1797)，MAFFT (6.857 或更新版本；Katoh and Kuma, 2002, Nucleic AcidsResearch30:3059-3066;Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research33:511-518;Katohand Toh,2007, Bioinformatics23:372-374;Katoh et al., 2009, Methods in MolecularBiology537:39-64;Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics26:1899-1900),和使用Clustalff 的 EMBOSS EMMA (1.83 或更新版本；Thompson et al., 1994, Nucleic AcidsResearch22:4673-4680)。
[0049]當(dāng)所述另一種酶與SEQ ID NO: 2的成熟多肽已經(jīng)分歧到如此程度，以至于傳統(tǒng)的基于序列的比較無(wú)法檢測(cè)出它們的關(guān)系時(shí)(Lindahl and Elofsson, 2000, J.Mol.Biol.295:613-615)，可以使用其他逐對(duì)的序列比較算法(pairwise sequencecomparison)。
[0050]當(dāng)其它酶與SEQ IDN0:27的成熟多肽差異較大從而傳統(tǒng)的基于序列的比較不能檢測(cè)它們之間的關(guān)系時(shí)(Lindahl 和 Elofsson, 2000，J.Mol.Biol.295:613-615)，可以使用其它逐對(duì)序列比較算法。使用利用多肽家族(譜)的概率代表搜索數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索程序，可在基于序列的搜索中獲得更高的靈敏度。例如，PS1-BLAST程序通過(guò)迭代的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索過(guò)程產(chǎn)生譜，并且能檢測(cè)關(guān)系較遠(yuǎn)的同源物(Atschul等，1997，NucleicAcids Res.25:3389-3402)。如果多肽家族或超家族在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中有一個(gè)或多個(gè)代表，則可以實(shí)現(xiàn)甚至更高的靈敏度。程序如GenTHREADER (Jones, 1999，J.Mo 1.Biol.287:797-815;McGuffin and Jones, 2003, Bioinformaticsl9:874-881)利用來(lái)自多種來(lái)源的信息(PS1-BLAST，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)構(gòu)比對(duì)譜，和溶解勢(shì))作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入，所述網(wǎng)絡(luò)可預(yù)測(cè)所查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊。類似地，可以使Gough et al., 2000, J.Mol.Biol.313:903-919的方法比對(duì)未知結(jié)構(gòu)的序列與SCOP數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的超家族模型。然后可以使用這些比對(duì)結(jié)果產(chǎn)生多肽的同源性模型，并且可以使用專門(mén)開(kāi)發(fā)的多種工具評(píng)價(jià)這類模型的精確度。
[0051]對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，有幾種工具和資源可用于獲取和產(chǎn)生結(jié)構(gòu)比對(duì)。例如，已經(jīng)比對(duì)了蛋白質(zhì)的SCOP超家族的結(jié)構(gòu)，并且這些比對(duì)結(jié)果是可以訪問(wèn)和下載的。可以使用多種算法，如距離比對(duì)矩陣(Holm和Sander, 1998, Proteins33:88-96)或組合延伸(Shindyalov 和 Bourne, 1998, Protein Eng.11:739-747)比對(duì)兩個(gè)或更多個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并且執(zhí)行這些算法還能用于查詢具有目的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)以發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如，Holm 和 Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567)。
[0052]在描述本發(fā)明的各種α -淀粉酶變體時(shí)，為便于提述，采用下述命名法。在所有情況下，應(yīng)用公認(rèn)的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫(xiě)。
[0053]取代。對(duì)于氨基酸取代，使用下述命名法:原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226用丙氨酸取代蘇氨酸表示為“Thr226Ala”或“Τ226Α”。多個(gè)突變用加號(hào)(“ + ”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在位置205和411的突變，分別用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，和用苯丙氨酸(F)取代絲氨酸(S)。
[0054]缺失。對(duì)于氨基酸缺失，使用下述命名法:原始氨基酸、位置*。因此，在位置195的甘氨酸的缺失表示為“Glyl95*”或“G195*”。多個(gè)缺失用加號(hào)(“ + ”)分隔，例如，“Glyl95*+Ser411*，或 “G195*+S411*，，。
[0055]插入。對(duì)于氨基酸插入，使用下述`命名法:原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此在位置195的甘氨酸后面插`入賴氨酸表示為“Glyl95GlyLys”或“G195GK”。多個(gè)氨基酸的插入表示為[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2 ;等]。例如，在位置195的甘氨酸后面插入賴氨酸和丙氨酸表示為“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。
[0056]在這種情況下，通過(guò)在插入氨基酸殘基前面的氨基酸殘基位置編號(hào)后加小寫(xiě)字母為插入的氣基酸殘基編號(hào)。因此在上述實(shí)例中序列為:
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種α淀粉酶變體，其在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 2的成熟多肽的位置128、143、141、192、20、76、123、136、142、165、219、224、265、383和410中的一個(gè)或多個(gè)位置上包含取代，其中所述變體具有α淀粉酶活性。
2.權(quán)利要求1的變體，其選自下組: a)與SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽； b)由在低嚴(yán)格條件下與(i)SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列、或(ii)⑴的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸所編碼的多肽； c)由與SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的多核苷酸所編碼的多肽；或 d)SEQ ID NO: 2的成熟多肽的片段，其具有α淀粉酶活性。
3.權(quán)利要求2的變體，其中所述變體α淀粉酶與SEQID NO:2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性。
4.權(quán)利要求2或3的變體，其中所述變體α淀粉酶由在低嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件、中-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、 或非常高嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或(ii) (i)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸所編碼。
5.權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體α淀粉酶由與SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列同一性的多核苷酸所編碼。
6.權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體α淀粉酶由在對(duì)應(yīng)于SEQID NO: 2的成熟多肽的位置 128、143、141、192、20、76、123、136、142、165、219、224、265、383 和 410 中的一個(gè)或多個(gè)位置上包含取代的SEQ ID NO: 2的成熟多肽組成，且其中所述變體具有α淀粉酶活性。
7.權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體α淀粉酶是SEQID NO: 2的成熟多肽的片段，其中所述片段具有α淀粉酶活性。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的變體，其是選自下組的親本α淀粉酶的變體: a)與SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%序列同一性的多肽； b)由與SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列有至少60%同一性的多核苷酸所編碼的多肽；或 c)SEQID NO:2的成熟多肽的片段，其具有α淀粉酶活性。
9.權(quán)利要求2-8中任一項(xiàng)的變體，其中所述親本α淀粉酶與SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%同一性、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、但少于100%序列同一性。
10.權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)的變體，其中所述親本與SEQID NO: 2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、和/或至少99%，但少于100%序列同一性。
11.前述任一權(quán)利要求的變體，其中SEQID ΝΟ:2的成熟多肽是SEQ ID ΝΟ:3的多肽。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的變體，其中改變的數(shù)目是1-20，例如1-10和/或1-5，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個(gè)改變。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的變體，其中所述變體還包含接頭和糖結(jié)合模塊。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置20的位置上包含取代。
15.權(quán)利要求14的變體，其中所述改變是用Ser取代。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置76的位置上包含取代。
17.權(quán)利要求16的變體，其中所述改變是用Gly取代。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置123的位置上包含取代。
19.權(quán)利要求18的變體，其中所述改變是用His取代。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置128的位置上包含取代。
21.權(quán)利要求20的變體，其中所述改變是用Asp取代。
22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置136的位置上包含取代。
23.權(quán)利要求22的變體，其中所述改變是用Phe取代。
24.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置141的位置上包含取代。
25.權(quán)利要求24的變體，其中所述改變是用Trp或Arg取代。
26.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置142的位置上包含取代。
27.權(quán)利要求26的變體，其中所述改變是用Asp取代。
28.權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置143的位置上包含取代。
29.權(quán)利要求28的變體，其中所述改變是用Asn取代。
30.權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置165的位置上包含取代。
31.權(quán)利要求30的變體，其中所述改變是用Met取代。
32.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置192的位置上包含取代。
33.權(quán)利要求32的變體，其中所述改變是用Arg取代。
34.權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置219的位置上包含取代。
35.權(quán)利要求34的變體，其中所述改變是用Cys取代。
36.權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置224的位置上包含取代。
37.權(quán)利要求36的變體，其中所述改變是用Ala或Arg取代。
38.權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置265的位置上包含取代。
39.權(quán)利要求38的變體，其中所述改變是用Cys取代。
40.權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置383的位置上包含取代。
41.權(quán)利要求40的變體，其中所述改變是用Arg取代。
42.權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置410的位置上包含取代。
43.權(quán)利要求42的變體，其中所述改變是用Ala取代。
44.權(quán)利要求1-43中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置20、76、123、128、136、141、142、.143、165、192、219、224、265、383和410中的任意位置的兩個(gè)位置上包含取代。
45.權(quán)利要求1-44中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置20、76、123、128、136、141、142、.143、165、192、219、224、265、383和410中的任意位置的三個(gè)位置上包含取代。
46.權(quán)利要求1-45中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置20、76、123、128、136、141、142、.143、165、192、219、224、265、383和410中的任意位置的四個(gè)位置上包含取代。
47.權(quán)利要求1-46中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置20、76、123、128、136、141、142、.143、165、192、219、224、265、383和410中的任意位置的五個(gè)位置上包含取代。
48.權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置20、76、123、128、136、141、142、143、165、192、219、224、265、383和410中的任意位置的六個(gè)位置上包含取代。
49.權(quán)利要求1-48中任一項(xiàng)的變體，其在對(duì)應(yīng)于位置20、76、123、128、136、141、142、143、165、192、219、224、265、383和410中的每一個(gè)位置上均包含取代。
50.權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的變體，其包含選自G20S、A76G、S123H、G128D、K136F、Y141W、Y141R、N142D、D143N、D165M、K192R、P219C、P224A、P224R、A265C、N383R、和 V410A 中的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))取代。
51.權(quán)利要求50的變體，其中所述變體包含下述取代或取代組合中的至少一個(gè): D165M ;或 Y141W ;或 Y141R ;或 K136F ;或 K192R ;或 P224A ;或 P224R ;或
S123H+Y141W ;或 G20S+Y141W ;或` A76G+Y141W ;或 G128D+Y141W ;或 G128D+D143N ;或 P219C+141W ;或 N142D+D143N ;或 Y141W+K192R ;或 Y141W+D143N ;或 Y141W+N383R ;或
Y141W+P219C+A265C ;或
Y141W+N142D+D143N ;或
Y141W+K192R+V410A ;或
G128D+Y141W+D143N ;或
Y141W+D143N+P219C ;或
Y141W+D143N+K192R ;或
G128D+D143N+K192R ;或
Y141W+D143N+K192R+P219C ;或
G128D+Y141W+D143N+K192R ;或
G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C。
52.權(quán)利要求13-51中任一項(xiàng)的變體，其中所述糖結(jié)合模塊是包含與選自下組的序列有至少60%同一性的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQID NO:30,SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQID NO:42、SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44。
53.權(quán)利要求52的變體，其中所述接頭和CBM來(lái)自羅耳阿太菌(Atheliarolfsii)，例如SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 36，或與其有60%同一性的序列。
54.權(quán)利要求52的變體，其中所述接頭和CBM來(lái)自黑曲霉(Aspergillusniger)，例如SEQ ID N0:21和SEQ ID NO:38，或與其有60%同一性的序列。
55.—種分離的多核苷酸,其編碼權(quán)利要求1-54中任一項(xiàng)的變體。
56.—種核酸構(gòu)建體,其包含權(quán)利要求55的多核苷酸。
57.—種表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求56的多核苷酸。
58.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求57的多核苷酸。
59.一種產(chǎn)生變體α淀粉酶的方法，包括: a)在適于該變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求57的宿主細(xì)胞；和 b)回收該變體。
60.一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求55的多核苷酸。
61.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1-54中任一項(xiàng)的變體的方法,包括: a)在有助于產(chǎn)生所述變體的條件下培養(yǎng)包含編碼所述變體的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和` b)回收所述變體。
62.一種從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括下述步驟: (a)利用權(quán)利要求1-54中任一項(xiàng)的變體α淀粉酶液化含淀粉材料； (b)使用葡糖淀粉酶糖化步驟(a)中獲得的經(jīng)液化的材料；和 (C)使用發(fā)酵微生物發(fā)酵該經(jīng)糖化的材料。
63.—種用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品的方法,包括: (a)在低于含淀粉材料的初始糊化溫度的溫度用權(quán)利要求1-54中任一項(xiàng)的變體α淀粉酶、以及糖淀粉酶糖化所述含淀粉材料， (b)使用發(fā)酵微生物進(jìn)行發(fā)酵。
64.權(quán)利要求62和63的方法，其中所述發(fā)酵微生物是酵母生物，具體地是酵母屬菌種(Saccharomyces spp.),更具體地是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
65.權(quán)利要求62-64中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇，具體地是乙醇。
66.一種產(chǎn)生酶改性的淀粉衍生物的方法，其包括使用權(quán)利要求1-54中任一項(xiàng)的具有α淀粉酶活性的變體來(lái)液化和/或糖化淀粉。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK103781910SQ201280043436
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月6日
【發(fā)明者】松井知子, A.托米基, G.科沃德-凱利 申請(qǐng)人:諾維信公司, 諾維信北美公司