一種轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法

專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)化水平不斷提高，其安全問(wèn)題已經(jīng)引起國(guó)際社會(huì)和各國(guó)政府的廣泛關(guān)注，并成為國(guó)家之間環(huán)境保護(hù)、國(guó)際貿(mào)易等合作的敏感議題，致使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問(wèn)題由學(xué)術(shù)觀點(diǎn)分歧，發(fā)展到環(huán)境問(wèn)題、經(jīng)濟(jì)問(wèn)題甚至政治問(wèn)題。為了加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因植 物的管理，世界各國(guó)紛紛制定了相應(yīng)的法律法規(guī)。其中，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度已成為國(guó)際公約。澳大利亞和新西蘭從2001年7月開始對(duì)所有轉(zhuǎn)基因食物實(shí)施標(biāo)識(shí)制度，閾值為每種成分的1%，即當(dāng)某一種成分內(nèi)的轉(zhuǎn)基因成分超過(guò)1%，則必須標(biāo)識(shí)為轉(zhuǎn)基因食物。巴西、以色列等國(guó)也把轉(zhuǎn)基因成分閾值定為1%。韓國(guó)和日本分別為3%和5%。建立健全轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)是關(guān)鍵。目前世界上常用的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法主要有兩種一種是基于核酸的檢測(cè)方法，一種是基于蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測(cè)方法。在轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品的檢測(cè)過(guò)程中，以DNA檢測(cè)為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)方法已經(jīng)成為最主要、最適用的轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品的檢測(cè)方法?；贒NA分子為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法經(jīng)歷了四個(gè)發(fā)展階段，即(I)針對(duì)啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因的篩選檢測(cè)；(2)目的基因特異性檢測(cè)；(3)基因構(gòu)建特異性檢測(cè)；(4)品系特異性(轉(zhuǎn)化事件)檢測(cè)。由于品系特異性檢測(cè)方法具有高度特異性，目前國(guó)際上對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法已逐步過(guò)渡到品系特異性基因片段的檢測(cè)方法。品系特異性檢測(cè)是通過(guò)分析外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實(shí)現(xiàn)的。由于每一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是單拷貝的，所以品系特異性檢測(cè)方法具有非常高的特異性和準(zhǔn)確性?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，品系特異性檢測(cè)已經(jīng)成為目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)研究的重點(diǎn)，并將為國(guó)際檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所采用。香石竹(Dianthus caryophyllus L.)又名康乃馨，為石竹科石竹屬多年生草本植物，是當(dāng)代世界最主要的切花品種之一，其生產(chǎn)面積和銷售量居切花品種之首。澳大利亞Florigene公司和日本Suntory公司從雜交矮牽牛中克隆到二氫黃酮醇_4_還原酶基因(Dihydroflavonol-4-Reductase，DFR)和類黃酮-3 ' ,5'-羥基化酶基因(Flavonoid-3 ' , 5 ' -Hydroxylase, F3’ 5’ H),構(gòu)建載體 pCGP1470 并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化花色為白色的香石竹品種，經(jīng)篩選獲得了花色呈藍(lán)紫色的轉(zhuǎn)基因香石竹。月之霓裳(Moonshade)是其中I個(gè)主要品系。轉(zhuǎn)基因香石竹是在我國(guó)進(jìn)行環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)的第一例觀賞植物，在轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全研究領(lǐng)域具有重要意義。所以研究開發(fā)靈敏度高、特異性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因香石竹品系特異性檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)，已成為一項(xiàng)重要而緊迫的任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種轉(zhuǎn)基因花色香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明利用LM-PCR技術(shù)分離、測(cè)序分析得到了外源基因插入位點(diǎn)的左邊界旁鄰序列，并設(shè)計(jì)了一系列特異性引物和探針序列，建立了適用于轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法，并驗(yàn)證了該檢測(cè)方法的特異性和靈敏度。本發(fā)明的原理為根據(jù)已知的外源插入載體，設(shè)計(jì)2條同向且退火溫度較高的特異性引物 MP1/MP2 與試劑盒 “LA_PCR in vitro Cloning” (TaKaRa BiotechnologyCo.，Ltd. Japan)提供的引物C1/C2結(jié)合，進(jìn)行LM-PCR反應(yīng)，得到外源基因插入香石竹基因組DNA位點(diǎn)的旁鄰序列。據(jù)此設(shè)計(jì)特異性引物和探針，并優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)對(duì)混合樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，建立適合于轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下 利用 Primer Express software version3. 0(Applied Biosystems, FosterCity, CA)設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針。特異性引物和探針的序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度參見表I。引物和探針由上海英駿公司(Invitrogen Co. , Ltd, Shanghai )合成。其中，采用ans基因作為香石竹的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。特異性引物MP1/MP2和試劑盒引物C1/C2用于LM-PCR擴(kuò)增。shadeClF/shadeClR用于品系特異性定性PCR擴(kuò)增。shadeRlF/shadeRIR和探針shade-Probe用于品系特異性定量PCR擴(kuò)增。ANS-F1/ANS-R1用于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因ans定性PCR擴(kuò)增。ANS-F2/ANS-R2和ANS-Probe用于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因ans定量PCR擴(kuò)增。GenomeClF/GenomeClR用于香石竹基因組DNA定性PCR擴(kuò)增。表I. PCR體系所用的特異性引物和探針
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟 1)轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade基因組DNA的提取； 2)轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade外源基因插入位點(diǎn)的左邊界旁鄰序列的分離和確認(rèn)利用LM-PCR方法分離得到包括如SEQ ID Nol所示的194bp未知序列和130bp的外源插入載體序列；根據(jù)該未知序列設(shè)計(jì)引物GenomeClF/GenomeClR進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增結(jié)果證明如SEQ ID Nol所示的序列為香石竹基因組序列，即轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade外源基因插入位點(diǎn)的左邊界旁鄰序列如SEQ ID Nol所示； 3)轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade的定性PCR檢測(cè)采用Moonshade品系特異性定性引物對(duì)shadeClF/shadeClR 進(jìn)行定性 PCR 擴(kuò)增； 4)轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade的定量PCR檢測(cè)由轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Moonshade品系特異性定量引物對(duì)shadeRlF/shadeRIR和探針shade-Probe進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，同時(shí)，采用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因ans特異性定量引物對(duì)ANS-F2/ANS-R2序列和探針ANS-Probe進(jìn)行內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定量PCR，并建立品系特異性定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因ans的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；再利用相對(duì)定量法對(duì)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)； 其中，引物GenomeClF/GenomeClR，其序列分別如SEQ ID No2和SEQ ID No3所示；引物對(duì) shadeClF/shadeClR序列分別如 SEQ ID No4 和 SEQ ID No5 所示；定量引物對(duì) shadeRlF/shadeRIR 和探針 shade-Probe 序列分別如 SEQ ID No6、SEQ ID No7 和 SEQ ID No8 所示；內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因ans特異性定量引物對(duì)ANS-F2/ANS-R2序列和探針ANS-Probe序列如SEQ IDNo9、SEQ ID NolO 和 SEQ ID Noll 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述LM-PCR方法的擴(kuò)增反應(yīng)體系為第I輪擴(kuò)增反應(yīng)總體積30iiL，3iiLlXPCR緩沖液，3u L2mM dNTPs，I y LlO y M引物Cl，I y LlO y M引物MP1，0. 3 y L5U LA-Taq DNA聚合酶，2 y LMoonshade DNA, 19. 7 u L 雙蒸水；第2 輪反應(yīng):總體積 30 u L,3u L I XPCR 緩沖液，3 u L 2mMdNTPs, I u L 10iiM$*MP2，liiL10iiM$*C2，0.3iiL5U Taq DNA 聚合酶，19. 7 y L 雙蒸7faP2iiL(25ng/iiL)第一輪PCR產(chǎn)物;其中，引物Cl的序列如SEQ ID Nol2所示，引物MPl的序列如SEQ ID Nol3所示，引物C2的序列如SEQ ID Nol4所示，引物MP2的序列如SEQID Nol5 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述定性PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為總體積25 ii L，5 ii L Moonshade DNA, 2. 5 u LlX PCR緩沖液，2. 5 ii L2mM dNTPs, 12. 7u L 雙蒸水，IOuM 定性引物對(duì) shadeClF/shadeClR 各 I y L 和0. 3 u L5U Taq DNA 聚合酶；反應(yīng)程序94°C,5min ；94°C, 30s, 58°C, 30s, 72°C, 30s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C，7min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為總體積25u L,2. 5u LI XPCR緩沖液，2. 5 u L2mM dNTPs, 5 u L25mMMgCl2, IOuM 定量引物對(duì) shadeRlF/shadeRIR # 0. 5 u L, I. 0 u LlO u M 探針 shade-Probe,0. 25 u L5U Taq DNA 聚合酶，5 y L DNA 和 7. 75 y L 雙蒸水；反應(yīng)程序50°C，2min ;95°C，IOmin ；95°C，30s, 60°C，45s，72°C，45S，45個(gè)循環(huán)，在60°C，45s的退火階段收集熒光信號(hào)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定量PCR的反應(yīng)條件為反應(yīng)體系總體積25 ii L，2. 5 ii LI XPCR緩沖液，2. 5 u L2mMdNTPs，5iiL25mM MgCl2，10iiM 弓 I 物對(duì) ANS-F2/ANS-R2 各 0. 5 y L，0. 5 y LlO y M 探針ANS-Probe, 0. 3 u L5U Taq DNA 聚合酶，5 y L DNA和 8. 2 y L雙蒸水；反應(yīng)程序50°C，2min ;.95°C，IOmin ；95°C，30s, 60°C，45s，72 V，45S，45 個(gè)循環(huán)，在 60°C，45s 的退火階段收集熒光信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟1)轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade基因組DNA的提取；2)轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade外源基因插入位點(diǎn)的左邊界旁鄰序列的分離和確認(rèn)；3)轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade定性PCR檢測(cè)；4)轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明建立了適用于轉(zhuǎn)基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法，并驗(yàn)證了該檢測(cè)方法的特異性和靈敏度，為轉(zhuǎn)基因香石竹的進(jìn)口檢測(cè)、監(jiān)管及環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供重要依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102719552SQ20121024481
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者唐雪明, 李鵬, 潘愛虎, 白藍(lán), 賈軍偉 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院