專利名稱：一株鏈霉菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鏈霉菌NK49及其用于生產(chǎn)具有抗菌活性的氨基酸均聚物￡ -聚賴氨酸的用途和方法。
背景技術(shù)：
e -聚賴氨酸(e -Poly-L-Lysine, e -PL)是一種由25-30個(gè)L-賴氨酸單體通過
e -氨基和a -羧基脫水縮合形成的同型單體聚合物多肽，其結(jié)構(gòu)式為
NH2
H--HnzXvZNvZaNcO--OII
_J ne-聚賴氨酸常常由放線菌產(chǎn)生，對于革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌具有廣譜的抑菌活性，并且能夠承食品加工過程中的熱處理，可隨食品原料一同處理并加工。e -聚賴氨酸已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)可作為食品防腐。e -聚賴氨酸安全性高、水溶性強(qiáng)、在人體內(nèi)可分解為人體必需的氨基酸賴氨酸，是一種營養(yǎng)型防腐劑。我國e-聚賴氨酸的生產(chǎn)能力和水平較低，不能滿足人們?nèi)找嬖鲩L生活水平的需要。究其原因在于缺少e-聚賴氨酸合成能力強(qiáng)的具有知識產(chǎn)權(quán)的微生物菌種。因此，開展微生物法合成e-PL的研究，分離新的合成能力高的菌株，優(yōu)化e -聚賴氨酸發(fā)酵和分離與精制的方法，具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一株具有較強(qiáng)e-聚賴氨酸生產(chǎn)能力的鏈霉菌Streptomyces sp.NK49。本發(fā)明用于生產(chǎn)e-聚賴氨酸的鏈霉菌NK49，分離自遼寧省沈陽地區(qū)地的農(nóng)田土壤。菌株的16SrDNA序列分析利用16SrDNA通用引物，得到16SrDNA序列長度為1491bp ;其16SrDNA序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對后發(fā)現(xiàn)，該菌株與鏈霉菌屬具有100%同源性,結(jié)果顯示該菌株屬于鏈霉菌屬,命名為鏈霉菌Streptomyces sp.。鏈霉菌Sti^ptomyces sp. NK49的形態(tài)特征為在貝納特斜面上生長時(shí)初期呈凸起裝半球形白色菌落，形成的菌絲將菌落牢牢固定在培養(yǎng)基上，不易挑起，菌落生長初期呈白色，且具有放射狀褶皺，后期孢子逐漸成熟，菌落表面被灰黑色孢子覆蓋。菌體光鏡下呈絲狀，分生孢子絲呈螺旋狀，孢子橢圓形。該菌株于2012年3月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為=CGMCC No 5932。
鏈霉菌Streptomyces sp. NK49發(fā)酵培養(yǎng)特征為在利用碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵過
程中會(huì)產(chǎn)酸。
菌種的保藏條件為將孢子利用脫脂牛奶保護(hù)后真空干燥長期保藏，或制備砂土管對孢子進(jìn)行保藏；該菌平時(shí)保藏于貝納特斜面上，便于直接應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供鏈霉菌Streptomyces sp.NK49用于生產(chǎn)e _聚賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)方法。為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案和操作步驟(I)將保存于貝納特斜面上的鏈霉菌Streptomyces sp. NK49,挑取一環(huán)孢子接種在高氏一號培養(yǎng)基中作為種子進(jìn)行活化培養(yǎng)20_36h ；(2)將種子液以5-15%的接種量接種至以淀粉水解糖或淀粉水解糖與甘油為碳源的合成培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48-96h ；(3)發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液6000 IOOOOrpm離心處理10 20min去除菌體，收集上清，利用5M NaOH溶液將上清調(diào)整pH至8，過濾祛除沉淀的雜蛋白；(4)利用弱酸型陽離子交換樹脂吸附去除了雜蛋白的上清液中的e -聚賴氨酸分子，蒸餾水洗滌；利用0. 1-0. 7mol/L的稀鹽酸洗脫吸附的產(chǎn)物，洗脫液利用5M NaOH溶液將pH調(diào)整到中性；(5)將中性的洗脫液進(jìn)行透析，去除小分子雜質(zhì)，冷凍干燥，得到e -聚賴氨酸固體粉末；(6)利用HPLC對產(chǎn)物水解液進(jìn)行測定，利用1HNMR和13CNMR對產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，利用MODI-TOF MS對產(chǎn)物聚合度和分子量進(jìn)行測定。與現(xiàn)有￡-聚賴氨酸生產(chǎn)菌株相比較，本菌株合成聚賴氨酸能力較強(qiáng)、生長周期較短，且能利用淀粉糖或其水解糖，具有規(guī)模進(jìn)一步利用的潛力。賴氨酸產(chǎn)品的潛力。
具體實(shí)施例方式在下面的實(shí)施例中所用菌種均為鏈霉菌Streptomyces sp. NK49,實(shí)施例中所用各種培養(yǎng)基及溶液、試劑配方如下(I) 土壤稀釋液(/L) =NaH2PO4 2H20 12. 17g，蛋白胨 60g，SDS 0. 5g ；(2)初篩培養(yǎng)基平板(SGB平板)SG平板中添加0. 002%的亞甲基藍(lán)。(3) Dragendoff試劑溶液I與溶液2各取5ml置于IOOml棕色容量瓶中，蒸餾水定容至100ml,配制完成后使用有效期為半年；其中，溶液I :0. 8g五水硝酸秘溶于40ml蒸餾水和IOml冰乙酸的混合液中；溶液2 :8. Og碘化鉀溶于20ml蒸餾水中。(4)貝納特斜面培養(yǎng)基(/L):葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉lg，瓊脂15g，pH 7. 0 ；121°C 滅菌 20min。(5)高氏一號培養(yǎng)基(/L):可溶性淀粉 20，KNO3 1，MgSO4 7H20 0. 5，NaCl 0. 5，K2HPO4 0. 5，F(xiàn)e2(SO4)3 0. 01, pH 7. 4，121°C滅菌 20min。(6)淀粉水解糖合成培養(yǎng)基(/L) (NH4)2SO4 IOg,淀粉糖50g，酵母粉5g，KH2PO4
I.36g, K2HPO4 3H20 0. 8g, MgSO4 7H20 0. 5g, ZnSO4 7H20 0. 04g, FeSO4 7H20 0. 03g, NaOH調(diào)節(jié) pH 至 7. 0,115°C滅菌 30min。(7)淀粉水解糖和甘油混合碳源發(fā)酵培養(yǎng)基(/L) : (NH4)2SO4 10g，甘油25g，淀粉糖 25g,酵母粉 5g, KH2PO4 I. 36g, K2HPO4 3H20 0. 8g, MgSO4 7H200. 5g, ZnSO4 7H20 0. 04g,FeSO4 7H20 0. 03g, NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7. 0，115°C滅菌 30min。實(shí)施例I、分離鑒定鏈霉菌Streptomyces sp. NK49實(shí)驗(yàn)材料來自于遼寧省沈陽地區(qū)農(nóng)田土壤，具體步驟如下將取來的新鮮土樣放置于陰涼干燥處3天，后使用15%碳酸鈣混合均勻，再次置于陰涼處自然通風(fēng)干燥8天。取干燥過篩后的土樣Ig與9ml用于稀釋土壤的稀釋液振蕩混勻，取上清梯度稀釋，分別將稀釋100倍和1000倍的上清液涂布于添加了 50mg/L K2Cr2O7的高氏一號培養(yǎng)基平板用于e -聚賴氨酸生產(chǎn)菌種的分離；培養(yǎng)7天后挑選表面干燥致密的放線菌菌落，平板劃線到不含K2Cr2O7高氏一號培養(yǎng)基平板純化菌落，后挑取獨(dú)立菌落，接種于SG液體培養(yǎng)基試管中，37°C恒溫培養(yǎng)7天，再將團(tuán)狀菌落，挑取接于SGB培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)5天后陽性菌落就會(huì)在SGB平板上出現(xiàn)顏料排斥圈；再取陽性反應(yīng)的菌株原有的SG培養(yǎng)基，上清中滴入Dragendoff試劑進(jìn)行復(fù)篩，以確定生產(chǎn)e -聚賴氨酸的菌株。經(jīng)過16SrDNA基因序列分析，并參考伯杰氏手冊之后，鑒定該菌株為鏈霉菌，命名為鏈霉菌Streptomyces sp. NK49,該菌株 16SrDNAGenBank 注冊號為JQ768941。進(jìn)一步構(gòu)建該菌株的進(jìn)化樹，如圖I鏈霉菌Streptomyces sp. NK49進(jìn)化樹所示。實(shí)施例2、淀粉水解糖作為單一碳源的搖瓶法培養(yǎng)將保存于貝納特斜面上的鏈霉菌Streptomyces sp. NK49上挑取一環(huán)孢子接種到含IOOml種子培養(yǎng)基高氏一號培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，30°C，180rpm活化培養(yǎng)，活化24h ；將活化種子培養(yǎng)物以10%接種量接種至高氏一號培養(yǎng)基中(搖瓶發(fā)酵時(shí)采用500ml錐形瓶，裝液量為100ml)作為種子液30°C，180rpm培養(yǎng)24h ;將種子液以15%的接種量分別接種于10瓶淀粉水解糖合成培養(yǎng)基中(搖瓶發(fā)酵時(shí)采用500ml錐形瓶，裝液量為100ml)進(jìn)行發(fā)酵30°C, 180rpm培養(yǎng)80h ;發(fā)酵結(jié)束后,培養(yǎng)物進(jìn)行離心8000rpm離心處理20min,棄去菌體，收集上清；將上清利用D152弱酸型的陽離子交換樹脂進(jìn)行產(chǎn)物吸附，將e -聚賴氨酸分子吸附在樹脂上；棄去吸附過后的上清，利用蒸餾水洗滌樹脂，洗去未吸附的雜志；利用
0.2mol/L的稀鹽酸洗脫吸附的產(chǎn)物，洗脫液利用6M的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)到中性；取洗脫液，冷凍干燥濃縮，濃縮液利用透過量IOOODa的透析袋進(jìn)行處理，祛除無機(jī)鹽離子，透析液凍干后得到e -聚賴氨酸固體產(chǎn)物。e -聚賴氨酸產(chǎn)量為0. 8-1. 9g/L。進(jìn)一步利用1NMI^13C NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)檢測，采用MODI-TOF MS對產(chǎn)物聚合度和分子量進(jìn)行測定。如圖2產(chǎn)物的MODI-TOF MS檢測結(jié)果圖。實(shí)施例3、以淀粉水解糖和甘油作為混合碳源的搖瓶法培養(yǎng)(I)將保存于貝納特斜面上的鏈霉菌Streptomyces sp. NK49上挑取一環(huán)孢子接種到含IOOml種子培養(yǎng)基高氏一號培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，30°C，180rpm活化培養(yǎng)，活化24h;將活化種子培養(yǎng)物以10%接種量接種至高氏一號培養(yǎng)基中(搖瓶發(fā)酵時(shí)采用500ml錐形瓶，裝液量為100ml)作為種子液30°C，180rpm培養(yǎng)24h ;將種子液以15%的接種量分別接種于10瓶淀粉水解糖與甘油合成培養(yǎng)基中(搖瓶發(fā)酵時(shí)采用500ml錐形瓶，裝液量為100ml)作為種子液30 °C, 180rpm培養(yǎng)96h ;發(fā)酵結(jié)束后，培養(yǎng)物進(jìn)行離心8000rpm離心處理20min，棄去菌體，收集上清；將上清利用D152弱酸型的陽離子交換樹脂進(jìn)行產(chǎn)物吸附，將e -聚賴氨酸分子吸附在樹脂上；棄去吸附過后的上清，利用蒸餾水洗滌樹脂，洗去未吸 附的雜志；利用0. 2mol/L的稀鹽酸洗脫吸附的產(chǎn)物，洗脫液利用6M的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)到中性； 取洗脫液，冷凍干燥濃縮，濃縮液利用透過量IOOODa的透析袋進(jìn)行處理，祛除無機(jī)鹽離子，透析液凍干后得到e -聚賴氨酸固體產(chǎn)物。e -聚賴氨酸產(chǎn)量為0. 8-2. 4g/L。
權(quán)利要求
1.鏈霉菌Streptomyces sp. NK49 CGMCC No. 5932 ；
2.鏈霉菌Streptomycessp. NK49用于生產(chǎn)e _聚賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)方法,包括如下操作步驟 (1)將保存于貝納特斜面上的鏈霉菌Streptomycessp. NK49,挑取一環(huán)孢子接種在高氏一號培養(yǎng)基中作為種子進(jìn)行活化培養(yǎng)20-36h ； (2)將種子液以5-15%的接種量接種至以淀粉水解糖或淀粉水解糖與甘油為碳源的合成培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48-96h ； (3)發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液6000 IOOOOrpm離心處理10 20min去除菌體，收集上清，利用5MNa0H溶液將上清調(diào)整pH至8，過濾祛除沉淀的雜蛋白； (4)利用弱酸型陽離子交換樹脂吸附去除了雜蛋白的上清液中的e-聚賴氨酸分子，蒸餾水洗滌；利用0. 1-0. 7mol/L的稀鹽酸洗脫吸附的產(chǎn)物，洗脫液利用5M NaOH溶液將pH調(diào)整到中性； (5)將中性的洗脫液進(jìn)行透析，去除小分子雜質(zhì)，冷凍干燥，得到e-聚賴氨酸固體粉末； (6)利用HPLC對產(chǎn)物水解液進(jìn)行測定，利用1HNMR和13CNMR對產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，利用MODI-TOF MS對產(chǎn)物聚合度和分子量進(jìn)行測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株鏈霉菌Streptomyces sp.NK-49及其應(yīng)用，即利用該菌生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)物分離純化的方法。該方法包括以下步驟首先將保存于貝納特斜面上的鏈霉菌Streptomyces sp.NK49，挑取一環(huán)孢子接種在高氏一號培養(yǎng)基中作為種子進(jìn)行活化培養(yǎng)20-36h；將種子液以5-15％的接種量接種至以淀粉水解糖或淀粉水解糖與甘油為碳源的合成培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48-96h；發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液6000～10000rpm離心處理10～20min去除菌體，收集上清，利用5M NaOH溶液將上清調(diào)整pH至8，過濾祛除沉淀的雜蛋白；利用弱酸型陽離子交換樹脂吸附去除了雜蛋白的上清液中的ε-聚賴氨酸分子，蒸餾水洗滌；利用0.1-0.7mol/L的稀鹽酸洗脫吸附的產(chǎn)物，洗脫液利用5M NaOH溶液將pH調(diào)整到中性；將中性的洗脫液進(jìn)行透析，去除小分子雜質(zhì)，冷凍干燥，得到ε-聚賴氨酸固體粉末；本發(fā)明中分離到的鏈霉菌Streptomyces sp.NK49，具有工業(yè)化生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的潛力。
文檔編號C12N1/20GK102618465SQ20121008168
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月26日
發(fā)明者宋存江, 李毅翔, 楊超, 王曉萌, 王淑芳, 耿偉濤, 謝晨庚, 趙若竹 申請人:南開大學(xué)