一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法

專利名稱：一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于干細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究領(lǐng)域，涉及一種誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的方法，尤其是一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一組以血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病，主要是由于胰島素分泌相對或絕對不足或胰島素受體作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂性疾病。糖尿病死亡率僅次于心腦血管和腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命和健康。隨著其發(fā)病率的逐年上升，糖尿病對人類健康的危害還將進(jìn)一步加重。世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界有I. 8億人患有糖尿病，這一數(shù)字很可能到2030年將翻番一倍以上。在糖尿病治療方面，傳統(tǒng)的治療無外乎促進(jìn)β細(xì)胞胰島素的分泌、增加外周組織對胰島素的敏感性及使用外源胰島素幾個方面，然而這些治療策略顯然未能使糖尿病患者得到根治；胰腺移植和胰島移植又難以克服供體不足和免疫排斥這兩大問題，使其臨床應(yīng)用和效果也受到極大影響。因此迫切需求治愈糖尿病的新方法。干細(xì)胞以其極強(qiáng)自我更新和多向分化潛能，已成為人們尋找替代患者自身免疫系統(tǒng)破壞的胰島細(xì)胞的最佳種子細(xì)胞來源，以干細(xì)胞移植為主的再生治療為糖尿病的根治帶來了新的希望。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs),是目前最有應(yīng)用優(yōu)勢的種子細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有非常強(qiáng)的自我增殖能力和分化的多潛能性，國內(nèi)外的研究表明能根據(jù)特定的環(huán)境分化為胰島素分泌細(xì)胞，并且間充質(zhì)干細(xì)胞具有其它干細(xì)胞所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如取材方便、增殖和分化能力強(qiáng)、移植無免疫原性，同時也避免了胚胎干細(xì)胞移植所面臨的倫理問題。目前對于間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方案可以歸為以下兩類多數(shù)為集中神經(jīng)生長因子及活化素的聯(lián)合應(yīng)用，如bFGF、EGF等；另一種方法是轉(zhuǎn)染胰島細(xì)胞發(fā)育、胰島素分泌過程中的關(guān)鍵基因，如roX-l、Ngn3等轉(zhuǎn)錄因子。但是現(xiàn)有研究誘導(dǎo)分化方案有很大局限性，分化效率不高，應(yīng)用時效果不理想。血清反應(yīng)因子(SRF)是一種高度保守且廣泛存在于多種生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它可以與多個基因啟動子上CArG box位點(diǎn)特異性結(jié)合，進(jìn)而特異性上調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。目前發(fā)現(xiàn)其主要功能是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)骨架肌動蛋白和其他一些支架蛋白的基因轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而參與多種哺乳動物生理過程，例如肌原纖維發(fā)育及其分化為骨骼肌、平滑肌等過程。最新的研究發(fā)現(xiàn)胰島素基因啟動子上含有SRF的結(jié)合位點(diǎn)CArG box,并且SRF和PDX-I可以協(xié)同促進(jìn)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，但是利用SRF與生長因子組合共同誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化尚未見報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，本方法利用SRF基因修飾與多種生長因子協(xié)同誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟
(I)構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒；(2)誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向Nestin+細(xì)胞分化當(dāng)步驟(I)中細(xì)胞至70_80%融合時，去除原有培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基I培養(yǎng)5 6小時；所述步驟⑵中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為含有5mmol/L β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖；(3)誘導(dǎo)Nestin+細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化在步驟(2)獲得細(xì)胞中，去除步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基II培養(yǎng)7 8天；步驟(3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II為含有5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2% B27、0. 1% β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖；(4)誘導(dǎo)胰腺始祖細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化在步驟(3)獲得細(xì)胞中，去除步驟
(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基III，同時轉(zhuǎn)染步驟(I)中的SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，培養(yǎng)7 8天；步驟⑷中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基III為含有5 20nmol/L Exendin_4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。而且，步驟(I)中構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，真核表達(dá)載體為pEGFP、pcDNA3. I 或 pCMV。而且，步驟(2)中所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血或脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。而且，步驟(4)中所述的SRF真核表達(dá)質(zhì)粒為去內(nèi)毒素的質(zhì)粒，質(zhì)粒超螺旋帶型清晰，A260/A280 = I. 8 2. O。而且，所述步驟(3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II為含有10nmol/L bFGFUOnmoI/L EGF、2% B27.0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。而且，所述步驟(4)中所述的誘導(dǎo)液培養(yǎng)基III為含有10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下I、本發(fā)明首次將SRF用作誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化過程中的修飾基因，并首次將轉(zhuǎn)染SRF和多種生長因子組合共同誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化。2、本發(fā)明利用生長因子組合誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰腺始祖細(xì)胞(此時細(xì)胞高表達(dá)rox-i)，同時對細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，上調(diào)細(xì)胞中的SRF表達(dá)，并輔以生長因子和活性物質(zhì)將可能獲得分泌胰島素的細(xì)胞，此方法的建立對于研發(fā)基于干細(xì)胞移植治療為主的“再生醫(yī)學(xué)”具有重要意義和實(shí)用價值。3、本發(fā)明所述的Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率高，并且安全性好。4、本發(fā)明可為間充質(zhì)干細(xì)胞的向胰島素分泌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化和其臨床應(yīng)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為與之相關(guān)的藥物開發(fā)和篩選提供了新的模型。


圖I為本發(fā)明利用SRF的上、下游引物對SRF基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，M為分子量marker，I代表擴(kuò)增PCR產(chǎn)物片段；圖2為本發(fā)明所構(gòu)建的SRF質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，M為分子量marker，I為所構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后的電泳圖。圖3為本發(fā)明利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的細(xì)胞形態(tài)圖，其中，圖3-1代表未誘導(dǎo)組的間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)；圖3-2代表利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基I誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為nestin+細(xì)胞的形態(tài)變化情況；圖3_3代表利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基II誘導(dǎo)nestin+細(xì)胞分化為胰腺始祖細(xì)胞的形態(tài)變化情況；圖3_4代表利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基III誘導(dǎo)胰腺始祖細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的形態(tài)變化情況。圖4為本發(fā)明利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化后，利用雙硫腙染色檢測胰島素分泌細(xì)胞團(tuán)，其中，圖4-1代表未誘導(dǎo)組的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行雙硫腙染色；圖4-2代表利用生長因子誘導(dǎo)后雙硫腙染色，說明利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合誘導(dǎo)后出現(xiàn)表達(dá)胰島素的細(xì)胞團(tuán)。圖5為本發(fā)明利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法與轉(zhuǎn)錄因子SRF共同誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化后，利用RT-PCR檢測分化后細(xì)胞表達(dá)胰島素基因mRNA水平，其中A代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，胰島素基因mRNA水平；B代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法與轉(zhuǎn)錄因子SRF共同誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，胰島素基因mRNA水平。說明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合與轉(zhuǎn)錄因子SRF共誘導(dǎo)之后胰島素的mRNA水平較聞。圖6為本發(fā)明利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法與轉(zhuǎn)錄因子SRF共同誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化后，利用ELISA方法檢測培養(yǎng)基中胰島素的分泌情況，其中A代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，培養(yǎng)基中胰島素的分泌情況；B代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法與轉(zhuǎn)錄因子SRF共同誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，培養(yǎng)基中胰島素的分泌情況。說明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合與轉(zhuǎn)錄因子SRF共誘導(dǎo)之后胰島素分泌顯著升高。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明中沒有具體指明單位的百分比均為重量百分比。本發(fā)明未詳細(xì)說明的方法均為本領(lǐng)域公知技術(shù)或公知實(shí)驗(yàn)方法，不具有特殊性。本發(fā)明提供一種由多種誘導(dǎo)物組合而成的分3步誘導(dǎo)的新方法，其中SRF基因修飾是間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化中首次采用的方法，該方法能將人間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，并具有較高的胰島素分泌量，具體包括以下步驟(I)間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血、脂肪等組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
(2)構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，含有SRF基因的真核表達(dá)質(zhì)粒的制備方法是本領(lǐng)域常用的構(gòu)建真核表達(dá)載體的方法。具體的是選擇合適的載體，載體可以是pcDNA3. I、pCMV等真核表達(dá)載體。根據(jù)SRF基因全長序列與所選載體設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，利用PCR或人工合成的方法獲得SRF基因全長，利用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后用連接酶將酶切后的SRF基因片段和載體連接，進(jìn)一步通過瓊脂糖凝膠電泳、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定、PCR鑒定及測序的方法對獲得的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，獲得SRF真核表達(dá)質(zhì)粒。
(3)誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向Nestin+細(xì)胞分化將步驟(I)中細(xì)胞種入6孔板中，待生長至70-80%融合時，去除原有DiffiM和10%胎牛血清培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基I 2mL培養(yǎng)5 6小時，誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為含有5mmol/Lβ -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基加入量與使用培養(yǎng)板大小有關(guān)，如用6孔板，則加2ml，如用24孔板，則加lmL。(4)誘導(dǎo)Nestin+細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化在步驟(3)獲得細(xì)胞中，去除步驟(3)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基II 2mL培養(yǎng) 7 8 天，誘導(dǎo)培養(yǎng)基 II 為含有 5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2% B27.0. 1%β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基。(5)誘導(dǎo)胰腺始祖細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化在步驟⑷獲得細(xì)胞中，去除步驟⑷中誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基III 2mL，同時轉(zhuǎn)染步驟(2)中的SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，培養(yǎng)7 8天，誘導(dǎo)培養(yǎng)基III為含有5 20nmol/LExendin-4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基。(6)分化后細(xì)胞的鑒定利用細(xì)胞形態(tài)觀察、RT-PCR、雙硫腙染色等方法對分化后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。實(shí)施例I一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，本實(shí)施例采用的是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，步驟如下I.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)從健康志愿者髖骨分離獲取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-80%融合時，用PBS清洗后，用胰酶消化，然后加入含有10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基(5. 6mM葡萄糖)終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清，再用含有10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基(5. 6mM葡萄糖)重新懸浮細(xì)胞；然后傳代培養(yǎng)；2.含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建(I)小鼠基因組的提取提取小鼠的心臟組織，將組織置于冰塊上，同時注意無菌操作。使用PH值為7. 4的PBS，將心臟組織濕潤。用眼科剪將心臟組織剪為O. 5cm X O. 5cm的小塊，將剪碎的心臟組織放入勻漿器中，在10-20mg心臟組織加入I毫升Trizol，至于冰上研磨5分鐘，離心取上清，利用傳統(tǒng)方法(氯仿/異丙醇)提取RNA。(2)根據(jù)NCBI中Genebank數(shù)據(jù)庫中SRF的全長序列信息和所用pcDNA3. I載體信息設(shè)計(jì)引物，引物序列如下上游引物I :5’ -CATGGATCCCCATGTTACCGACCCAAGCT-3’
下游引物1 :5’ -GGTCTCGAGGTTCACCACCTGTAGCTCGG-3’PCR反應(yīng)體系
基因組模板Ιμ
正向引物Ιμ
反向引物Ιμ dNTP4μL
IOxbuffer5 μι
EasyTaq 聚合酶Ιμ
總體積5(^L利用EasyTaq 聚合酶在 94°C 5min, (94°C lmin,53°C 30s，72°C 3min) 35 個循環(huán)，72°C IOmin的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物于I %的TBE瓊脂糖凝膠中電泳(如圖I)，利用瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒純化回收獲得SRF基因片段。(3)將SRF基因和pcDNA3. I質(zhì)粒用BamHI和XhoI雙酶切后，經(jīng)T4DNA連接酶(Promega)連接，取連接產(chǎn)物10 μ I加入到感受態(tài)細(xì)胞(常規(guī)CaCl2法制備Ε. coliDH5 α感受態(tài)細(xì)胞)中，輕敲管壁使內(nèi)容物混勻，冰浴30min，42°C水浴熱擊90s，迅速轉(zhuǎn)置冰浴2min，加入500 μ ILB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，將300 μ I轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)12h后挑取單克隆，分別接種于3ml含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。利用質(zhì)粒小提試劑盒(Solarbio)提取質(zhì)粒，用BamHI和XhoI雙酶切驗(yàn)證(如圖2)，瓊脂糖凝膠電泳檢測有I. 6kb左右的SRF目的片段，進(jìn)一步將含有pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒的DH5a菌液送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果在Genebank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，證明閱讀框完全正確，pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒中含有SRF全長基因。(4)質(zhì)粒DNA的大量提取，將pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，取菌液30 μ 1，接種到3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C水浴搖床上震蕩培養(yǎng)過夜，利用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(Solarbio)操作步驟純化提取pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒備用。提取后的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，質(zhì)粒超螺旋帶型清晰。同時利用核酸蛋白測定儀(美國Bio-Rad公司)對核酸進(jìn)行定量分析，A260/A280 = I. 8 2. O為最佳。3.誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化待分離獲得長期培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞生長至70 80%，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基I (5mmol/L β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基)，放入37V,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 6小時，將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為Nestin+細(xì)胞；吸去舊培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基II (I Onmo I/L bFGF U Onmo I/L EGF,2% B27.0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基)，放入37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h首次半量換液，之后每3天全量換液一次，培養(yǎng)7天。4.在胰腺始祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SRF真核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)其向胰島素分泌細(xì)胞分化按照Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將SRF基因轉(zhuǎn)染入胰腺始祖細(xì)胞，具體操作步驟如下在24孔板中預(yù)先加入O. 5mL含血清但不含抗生素的DMEM低糖培養(yǎng)基，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前匯合度達(dá)到60-70%，將培養(yǎng)基吸去，加入PBS漂洗一次后，加入O. 25%胰酶消化細(xì)胞，離心收獲細(xì)胞，并用不含Ca2+和Mg2+的PBS漂洗細(xì)胞，離心去上清，加入重懸緩沖液R重懸細(xì)胞，使其終濃度為I. O X IO7個細(xì)胞/mL。將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至I. 5mL無菌微量離心管中，按I μ g/每孔分別將不含SRF基因的pcDNA3. I質(zhì)粒和含有SRF的pcDNA3. 1-SRF表達(dá)質(zhì)粒加入到細(xì)胞懸液中，輕輕混勻。打開Neon 儀器開關(guān)，在Neon 管中加入3mL電解緩沖液，然后將它插入Neon 移液器吸頭架中，用Neon 移液器夾取一個Neon 吸頭，確保移液器與吸頭無縫隙。將Neon 吸頭浸入細(xì)胞-質(zhì)粒混合物中，吸取IO uL混合物。然后將移液器垂直插入位于Neon 移液器吸頭架上的Neon 管中。在顯示屏上設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)為電壓990V，脈沖時間40ms，點(diǎn)擊次數(shù)I次，然后按下START鍵。當(dāng)觸摸屏顯示Complete，說明電轉(zhuǎn)完成。將移液器取下，并吸頭中的樣品轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基III (10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2%B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基)孵育的孔板中。輕輕晃動培養(yǎng)板，確保細(xì)胞分布均勻。將培養(yǎng)板置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時，進(jìn)行半量換液，之后每3天全量換液一次，誘導(dǎo)其向胰島素分泌細(xì)胞分化。5.檢測分化后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化在誘導(dǎo)分化過程中，順序利用誘導(dǎo)培養(yǎng)液I、誘導(dǎo)培養(yǎng)液II、誘導(dǎo)培養(yǎng)液III同時進(jìn)行SRF基因修飾誘導(dǎo)細(xì)胞分化，經(jīng)歷Nestin+細(xì)胞、胰腺始祖細(xì)胞、胰島素分泌細(xì)胞三個階段，利用倒置相差顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖3所示，細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生明顯變化，變圓并形成細(xì)胞簇。6.利用雙硫腙染色方法鑒定胰島素分泌細(xì)胞首先配置雙硫腙染色劑，50mg雙硫腙(DTZ)加入5mL DMSO溶解作為儲備液，用PBS稀釋終濃度為0. lmg/mL，抽濾除菌，配制為染色液。對于誘導(dǎo)分化的細(xì)胞和未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，用PBS漂洗2次，加入染色液，37°C溫育15min后鏡檢。結(jié)果如圖4所示，誘導(dǎo)分化后細(xì)胞著色較深，呈棕紅色。實(shí)施例2一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，本實(shí)施例使用的是pCMV-Tag2B作為載體，具體方法如下I.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)，同實(shí)施例I。2.構(gòu)建pCMV-SRF真核表達(dá)質(zhì)粒(I)以實(shí)施例I中構(gòu)建好的pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒為模版，以pCMV_Tag2B作為載體，采用PCR的方法從pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒中擴(kuò)增SRF基因片段，根據(jù)SRF的全長序列信息和所用pCMV載體信息設(shè)計(jì)引物，引物序列如下上游引物2 :5 ’ -ATCGGGATCCATGTTACCGACCCAAGCT-3 ’下游引物2 :5 ’ -GGTCTCGAGGTTCACCACCTGTAGCTCGG-3 ’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠純化方法純化回收獲得SRF基因片段。(2)將SRF基因和pCMV_Tag2B質(zhì)粒用BamHI和XhoI雙酶切后，經(jīng)T4DNA連接酶(Promega)連接，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例I)，將300 μ I轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)12h后挑取單克隆，分別接種于3ml含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。利用質(zhì)粒小提試劑盒(Solarbio)提取質(zhì)粒,用BamHI和XhoI雙酶切驗(yàn)證,瓊脂糖凝膠電泳檢測有I. 6kb左右的SRF目的片段，進(jìn)一步將含有pCMV-SRF質(zhì)粒的DH5 α菌液送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果在Genebank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，證明閱讀框完全正確，pCMV-SRF質(zhì)粒中含有SRF全長基因(3)pCMV-SRF質(zhì)粒的大量提取方法，同實(shí)施例I。3.誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化，同實(shí)施例I。4.在胰腺始祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SRF真核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)其向胰島素分泌細(xì)胞分化轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為pCMV-SRF質(zhì)粒，其他同實(shí)施例I。5.利用雙硫腙染色方法鑒定胰島素分泌細(xì)胞，同實(shí)施例I。6.利用RT-PCR的方法檢測胰島素分泌細(xì)胞特異性基因insulin的mRNA表達(dá)情況。誘導(dǎo)分化后，利用Trizol法提取培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，提取的總RNA用核酸定量儀檢測并定量。以mRNA為模板，采用Oligo (dT)為引物，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)insulin的引物，由Invitrogen生物技術(shù)公司合成。引物序列如下正向引物3 :5 ’ -CAGCCGCAGCCTTTGTGAA-3 ’反向引物3 :5 ’ -TCCACAATGCCACGCTTCTG-3 ’利用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板在95 V 5min, 32個循環(huán)擴(kuò)增(95 V 30s、55. I0C 45s, 72 °C 60s)，72。。延伸IOmin的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖5所示(A)代
表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，胰島素基因mRNA水平；(B)代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法與轉(zhuǎn)錄因子SRF共同誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，胰島素基因mRNA水平。結(jié)果說明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合與轉(zhuǎn)錄因子SRF共誘導(dǎo)之后胰島素的mRNA水平較高。實(shí)施例3一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，本實(shí)施例采用的是人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，具體步驟如下I.人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)，同實(shí)施例I。取抗凝臍血和等體積的PBS混勻，利用Ficoll分離液分離單個核細(xì)胞層，PBS清洗，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2X IO7細(xì)胞密度接種，置于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于貼壁2小時后更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)80%融合時以O(shè). 25%胰酶和O. 02%EDTAl I混合笑話，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2.含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，同實(shí)施例I。3.誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化，同實(shí)施例I。4.在胰腺始祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SRF真核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)其向胰島素分泌細(xì)胞分化轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為pcDNA-SRF質(zhì)粒，同實(shí)施例I。5.利用RT-PCR的方法檢測胰島素分泌細(xì)胞特異性基因insulin的mRNA表達(dá)情況，同實(shí)施例I。6.利用胰島素(INS)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)實(shí)驗(yàn)檢測培養(yǎng)基中胰島素分泌量誘導(dǎo)分化完成之后，吸取誘導(dǎo)培養(yǎng)基，PBS輕洗3遍，換用無血清H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h。收集培養(yǎng)基上清，-80°C保存?zhèn)錅y。
利用胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(R&D)檢測步驟如下 (I)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和加樣在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 μ L，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ L，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 μ L分別加到第三孔、第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ L，混勻；然后在第三、第四孔中先各取50 μ L棄掉,再各取50 μ L分別加到第五、第六孔中，再分別加入50 μ L標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 μ L分別加入到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50yL，混勻；混勻后從第七第八空中各取50 μ L分別加到第九、第十空中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ L混勻；混勻后各取50yL棄掉。(稀釋后沒孔加樣量都為50μ 1，濃度分別為12mU/L，8mU/L，4mU/L，2，mU/L,ImU/L),其余步驟與下面相同,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)加樣分別設(shè)空白孔(空白孔不加樣品和酶標(biāo)試劑，其余步驟相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μ L，然后再加待測樣品10 μ L。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，混勻。(3)溫育用封板膜封板后置于37°C,30min。(4)配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。(5)洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，加滿洗滌液，靜置30s后棄去，重復(fù)5次。(6)加酶每孔加入酶標(biāo)試劑50 μ L，空白孔除外。(7)溫育同 3。(8)洗滌同 5。(9)顯色每孔先加入顯色劑Α50 μ L，再加入顯色劑B 50 μ L，輕輕混勻，37°C避光顯色15min。(10)終止每孔加終止液50 μ L，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。(11)測定以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測定各孔吸光度。(12)計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每孔樣品的胰島素含量。結(jié)果如圖6所示，利用本發(fā)明方法所誘導(dǎo)分化的細(xì)胞能夠產(chǎn)生胰島素，并且，與只利用三種誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化組相比，同時對細(xì)胞進(jìn)行SRF基因修飾后的分化細(xì)胞產(chǎn)生胰島素量顯著升高，從5. 64±1. 04mU/L上升至12. 98±1. 86mU/L。
權(quán)利要求
1.一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒； (2)誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向Nestin+細(xì)胞分化當(dāng)步驟(I)中細(xì)胞至70-80%融合時，去除原有培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基I培養(yǎng)5 6小時； 所述步驟⑵中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為含有5mmol/L β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖； (3)誘導(dǎo)Nestin+細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化在步驟(2)獲得細(xì)胞中，去除步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基II培養(yǎng)7 8天； 步驟(3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II為含有5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2%B27、0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖； (4)誘導(dǎo)胰腺始祖細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化在步驟(3)獲得細(xì)胞中，去除步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基III，同時轉(zhuǎn)染步驟(I)中的SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，培養(yǎng)7 8天； 步驟⑷中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基III為含有5 20nmol/L Exendin_4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(I)中構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，真核表達(dá)載體為pEGFP、pcDNA3. I 或 pCMV。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于步驟(2)中所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血或脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于步驟(4)中所述的SRF真核表達(dá)質(zhì)粒為去內(nèi)毒素的質(zhì)粒，質(zhì)粒超螺旋帶型清晰，A260/A280 = I. 8 2. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟⑶中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II為含有10nmol/L bFGF、10nmol/L EGF,2%B27、0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟⑷中所述的誘導(dǎo)液培養(yǎng)基III為含有10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的方法，技術(shù)方案構(gòu)建SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，真核表達(dá)載體包括是pEGFP、pcDNA或pCMV；將人間充質(zhì)干細(xì)胞首先預(yù)誘導(dǎo)為nestin+細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)為胰腺始祖細(xì)胞，然后將含有SRF基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到上述細(xì)胞中，最后誘導(dǎo)為胰島素分泌細(xì)胞。本發(fā)明可為糖尿病的細(xì)胞治療提供新的種子細(xì)胞來源，為間充質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞和其臨床應(yīng)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為與之相關(guān)的藥物開發(fā)和篩選提供了新的模型。
文檔編號C12N5/10GK102618500SQ20121007625
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者俞如發(fā), 張同存, 王楠 申請人:天津科技大學(xué)