專利名稱：一種檢測乳腺癌易感性的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其涉及一種檢測乳腺癌易感性的試劑盒，通過檢測CD155的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點來預測乳腺癌的易感性。
背景技術：
乳腺癌位列女性惡性腫瘤發(fā)生率第一位，我國乳腺癌發(fā)病率逐年增高。癌癥的發(fā)生是一個多因素，多階段，多基因變異的過程。作為NK細胞活化的關鍵分子，CD155參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個重要過程。大量的研究表明，腫瘤免疫調控相關基因的單核苷酸多態(tài)可以通過改變這些基因的表達水平的方式，影響這些基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。SNP (Single nucleotide polymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性，是人類基因組作圖的第三代遺傳標記，主要是指一類基于單堿基變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組最廣泛存在的一類多態(tài)性標記，已成為研究基因組多態(tài)性和識別、定位疾病相關的一種工具。1996年成功研制了 SNP檢測的實時熒光定量PCR技術，實現了 PCR從定性到定量的飛躍，還實現了判斷結果的自動性?？衫脽晒舛縋CR技術研發(fā)檢測疾病易感性的試劑盒。⑶155分子(其基因銀行的編號為NG_008781. 1)最初作為脊髓灰質炎病毒受體而被發(fā)現，隨后又發(fā)現CD155分子參與了細胞-細胞間、細胞-基質間黏附；與整合素 α νβ3分子相結合的⑶155分子在二聚體化后，可以通過與玻連蛋白、neCtin3的相互作用介導細胞間、細胞與細胞外基質間的黏附(參見=Mueller S，Wimmer E. Recruitment of nectin-3 to cell-cell junctions through trans-heterophi1ic interaction with CD155, a vitronectin and poliovirus receptor that localizes to alpha(v) beta3 integrin—containing membrane microdomains.J Biol Chem. 2003 Aug 15 ； 278 (33) : 31251-60)。另外，通過與其受體CD226分子相互作用，CD155也參與介導了 NK 細胞對腫瘤細胞的殺傷。研究還發(fā)現，在許多腫瘤細胞系和多種組織來源腫瘤如腦膠質瘤、結直腸肉瘤和造血系統(tǒng)的惡性腫瘤中，均可以檢測出CD155分子的表達水平明顯升高。嚙齒目動物中存在著CD155的同源分子Tage4，并被認為是人CD155的祖先基因，在嚙齒動物腫瘤中同樣也具有很高的表達水平(參見=Kakunaga S, Ikeda W, Shingai T, Fujito T, Yamada A, Minami Y, Imai T, Takai Y. Enhancement of serum- and platelet-derived growth factor-induced cell proliferation by Necl_5/Tage4/poliovirus receptor/CD155 through the Ras-Raf-MEK-ERK signaling. J Biol Chem. 2004 Aug 27;279(35):36419-25)。rs203713是位于第18號染色體CD155基因3，UTR區(qū)域的一個A>G多態(tài)。其在世界人群的頻率分布，T占0.62，G占0.38左右。中國人群的分布T占0.45，G占0.25左右?，F有技術中，并沒有⑶155基因3’ UTR區(qū)域的A>G多態(tài)與乳腺癌相關性的研究報道，也沒有通過檢測CD155的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點來預測乳腺癌的易感性的報道。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測乳腺癌的試劑盒。本發(fā)明的原理為發(fā)明人通過分子生物學研究表明，⑶155的rs203713位點上A>G 的替代可增加⑶巧5基因3’ UTR與核蛋白的結合，增加⑶155基因的表達；通過大規(guī)模人群的乳腺癌病例對照研究，⑶巧5基因3’UTR區(qū)域的A>G多態(tài)與乳腺癌發(fā)生相關，并且呈基因劑量-反應關系，即使在調整年齡、性別、吸煙、腫瘤家族史等多種混雜因素后，這種相關性仍然存在。因此這個SNP的多態(tài)可用于評估個體乳腺癌的易感性。為了實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是一種檢測乳腺癌易感性的試劑盒， 包括檢測CD155的rs203713號單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR的常規(guī)組件。上述技術方案中，所述特異性引物對包括有義引物序列SEQ ID No. 1和反義引物序列SEQ ID No. 2，具體如下所示
SEQ ID NO. 1 有義引物序歹Ij :5，-ACC CTC CCT CTG CAT TGC T _3，，Tm 值為 60 "C ； SEQ ID NO. 2 反義引物序列5，- CAG TCC CAA GTG GAT GT _3，，Tm 值為 58 "C。上述技術方案中，所述特異性熒光探針對包括野生型探針序列和突變型探針序列，具體如下所示
SEQ ID NO. 3 野生型探針序列5，-CAGAGTTGATCTGTAGAAT-3，，Tm 值為 66 "C ； SEQ ID NO. 4 突變型探針序列5，-TTAGACAGAGTTGATCTATAGA-3，，Tm 值為 67 "C。上述技術方案中，所述特異性引物是針對⑶155基因上的rs203713號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含針對⑶巧5基因上的rs203713號SNP位點的DNA引物對，本領域技術人員能理解，特異性引物對可用常規(guī)的合成技術合成。優(yōu)選的技術方案中，所述檢測乳腺癌的試劑盒包括具有SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示序列的引物對。本發(fā)明的引物不限于這對引物。上述技術方案中，所述特異性熒光探針是針對⑶155基因上的rs203713號SNP位點而設計，能特異性檢測rs203713這個乳腺癌一個基因型的DNA探針對；優(yōu)選地，本試劑盒包括具有SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4所示序列的熒光探針對。特異熒光引物對可用常規(guī)的合成技術合成。本領域技術人員能理解，本發(fā)明的引物不限于這對熒光探針。所有可用于熒光定量PCR檢測⑶155基因上的rs203713號SNP位點的探針均在本發(fā)明范圍內。上述技術方案中，所述熒光定量PCR的常規(guī)組件包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水；所述熒光定量PCR的常規(guī)組件的成分及其制備方法均為現有技術。具體地，一種檢測乳腺癌易感性的試劑盒，每10 μ 1的PCR體系中包括10 μ M特異性引物對兩條各0.225 μ 1，5 μ M特異性熒光探針兩條各0. 1μ 1 ； (5unit/y l)Taq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；25 mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ；5 X 熒光定量 PCR 反應緩沖液2 μ 1 ；去離子水補足；上述試劑盒的保存溫度為-20°C。本發(fā)明同時要求保護上述的試劑盒檢測通過熒光定量PCR法檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶4的rs203713號單核苷酸多態(tài)性位點基因型的應用。即當個體攜帶A等位基因時其罹患乳腺癌的風險將顯著增高。
采用上述檢測乳腺癌的試劑盒檢測待測DNA的⑶155基因上的rs203713號SNP 位點的基因型，其中，PCR反應條件為50 V 2 min, 95 V 10 min，再進行40 55個PCR循環(huán)92 V 15 s,60 V 1 min;反應結束后在；采用熒光定量PCR儀讀取熒光量，區(qū)分基因型被檢測DNA的⑶155基因上的rs203713號SNP位點攜帶有G時，為乳腺癌易感型。由于上述技術方案的使用，本發(fā)明和現有技術相比，具有以下優(yōu)點
由于本發(fā)明所述試劑盒中包含的特異性引物對是針對CD155基因上的rs203713號SNP 位點而設計，能特異性擴增出包含針對⑶155基因上的rs203713號SNP位點的DNA引物對；所述的特異性熒光探針是針對CD155基因上的rs203713號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含針對⑶155基因上的rs203713號SNP位點的DNA探針對；因此，可以檢測DNA 的⑶155基因上的rs203713號SNP位點的基因型，從而檢測個體乳腺癌的易感性。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明 實施例一
一種檢測乳腺癌的試劑盒，包括檢測⑶巧5基因上的rs203713號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgC12溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水；
所述檢測⑶155基因上的rs203713號SNP位點的特異性弓|物對的序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，有義引物序列的Tm值為60 °C，反義引物序列的Tm值為58 °C;所述檢測⑶155 基因上的rs203713號SNP位點的特異性熒光探針對的序列如序列表SEQ IDN0. 2所示，野生型探針序列的Tm值為66 °C，突變型探針序列的Tm值為67 °C ；具體如下所示SEQ ID NO. 1 有義引物序列5’ -ACC CTC CCT CTG CAT TGC T _3，，Tm 值為 60 °C;SEQ ID NO. 2 反義引物序列5，- CAG TCC CAA GTG GAT GT _3，，Tm 值為 58 "C。 所述的特異性引物，能特異性擴增出包含針對⑶155基因上的rs203713 號SNP位點的DNA引物對和DNA探針對，具體如下所示SEQ ID NO. 3野生型探針序列5，-CAGAGTTGATCTGTAGAAT-3，，Tm 值為 66 "C ；SEQ ID NO. 4 突變型探針序列 5，-TTAGACAGAGTTGATCTATAGA-3，，Tm 值為 67 "C。以供檢測一人份使用試劑盒為例，該試劑盒中各物質的含量為10μΜ特異性引物對兩條各0.225 μ 1，5 μ M特異性熒光探針兩條各0. 1μ 1 ； (5unit/y l)Taq DNA聚合酶 0. 02 μ 1 ； 20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；25 mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ；5Χ 熒光定量 PCR 反應緩沖液2μ 1 ；去離子水4. 1μ 1。在ABI 7900ΗΤ型熒光定量PCR儀中進行反應，反應條件為50 V 2 min, 95 V 10 min，再進行 40 55 個 PCR 循環(huán)92 "C 15 s，60 "C 1 min。反應結束后在 ABI 7900HT 型熒光定量PCR儀讀取熒光量。步驟3 基因型分析及確定基因型
采用 ABI 7900HT 型熒光定量PCR儀自帶軟件 SDSGequence Detection Systems)V2. 3 判讀基因型，自動分析結果。被檢測DNA的⑶155基因上的rs203713號SNP位點攜帶有G 時，為乳腺癌易感型。實施例二步驟1 :DNA的提取
對被檢測者進行服務前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習慣問卷表。 常規(guī)方法抽取被檢測者EDTA抗凝血5ml。用硅膠吸附法提取血液標本的基因組DNA。步驟2 基因分型檢測
使用實施例一所述試劑盒，對被檢測者DNA的⑶155基因上的rs203713號SNP位點進行熒光定量PCR檢測，確定該位點的基因型。步驟3 指導人們主動預防乳腺癌
通過對被檢測者基因型的分析，出具基因分型檢測報告和對被檢測者個體化健康指導報告?；蚍中蜋z測報告詳細說明了被檢測者乳腺癌易感程度的高低以及患病概率大小。 個體化健康指導報告以被檢測者的基因分型檢測結果為基礎，結合其生活飲食習慣問卷調查結果，評估被檢測這乳腺癌遺傳易感的相對風險。同時制定出針對被檢測者的個性化健康行動方案，包括在飲食習慣、生活方式生活的改進建議等，并為被檢測者普及預防乳腺癌的健康知識。實施例三
采用實施例一所述檢測乳腺癌的試劑盒，采用實施例二的檢測方法，對522例乳腺癌患者和712例正常對照進行基因分型，所得結果參見表一。表一顯示通過我們設計的方法對522例乳腺癌患者和712例正常對照進行基因分型后我們發(fā)現攜帶CD155 rs203713 AA基因型的個體比攜帶CD155 rs203713 GG基因型的個體罹患乳腺癌的風險要高2. 28倍，攜帶⑶155 rs203713 AG基因型的個體比⑶155 rs203713 GG基因型的個體罹患乳腺癌的風險要高1. 49倍(趨勢檢驗差異均具有顯著性# < 0.05)。表一、⑶155基因rs203713單核苷酸多態(tài)與乳腺癌風險
權利要求
1.一種檢測乳腺癌易感性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測CD155的 rs203713號單核苷酸多態(tài)性位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR的常規(guī)組件。
2.根據權利要求1所述檢測乳腺癌易感性的試劑盒，其特征在于，所述特異性引物對包括有義引物序列SEQ ID No. 1和反義引物序列SEQ ID No. 2，具體如下所示SEQ ID NO. 1 有義引物序歹Ij :5，-ACC CTC CCT CTG CAT TGC T _3，，Tm 值為 60 "C ；SEQ ID NO. 2 反義引物序列5，- CAG TCC CAA GTG GAT GT _3，，Tm 值為 58 "C。
3.根據權利要求1所述檢測乳腺癌易感性的試劑盒，其特征在于，所述特異性熒光探針對包括野生型探針序列和突變型探針序列，具體如下所示SEQ ID NO. 3 野生型探針序歹Ij :5，-CAGAGTTGATCTGTAGAAT-3，，Tm 值為 66 "C ；SEQ ID NO. 4 突變型探針序列5，-TTAGACAGAGTTGATCTATAGA-3，，Tm 值為 67 "C。
4.根據權利要求1所述檢測乳腺癌易感性的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的常規(guī)組件包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水。
5.根據權利要求1所述檢測乳腺癌易感性的試劑盒，其特征在于，每10μ1的PCR體系中包括10μΜ特異性引物對兩條各0. 225μ 1，5μΜ特異性熒光探針兩條各0. 1μ 1 ； 5unit/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ;25 mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ； 5 X熒光定量PCR反應緩沖液2 μ 1 ；去離子水補足。
6.權利要求1所述試劑盒檢測通過熒光定量PCR法檢測絲裂原活化蛋白激酶激酶4 的rs203713號單核苷酸多態(tài)性位點基因型的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其涉及一種檢測乳腺癌的試劑盒，通過檢測CD155的單核苷酸多態(tài)性位點來預測乳腺癌的易感性。所述試劑盒包括檢測CD155的rs203713號單核苷酸多態(tài)性位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR的常規(guī)組件。本發(fā)明所述試劑盒可以檢測DNA的CD155基因上的rs203713號SNP位點的基因型，從而檢測個體乳腺癌的易感性，也適用于對胃癌、前列腺癌及卵巢癌的預后檢測，更可廣泛應用于醫(yī)療研究。
文檔編號C12Q1/68GK102296125SQ20111028590
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權日2011年9月23日
發(fā)明者周翊峰, 姜嵐, 游永鶴, 鄧杰瓊, 鄭健 申請人:蘇州大學