專利名稱：一種產(chǎn)堿桿菌及利用其制備d-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)堿桿菌及其用途，更具體地說(shuō)是涉及一種產(chǎn)堿桿菌以及利用該產(chǎn)堿桿菌制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法。
背景技術(shù)：
D-對(duì)羥基苯甘氨酸是一種重要的醫(yī)藥原料，用于合成內(nèi)酰胺類抗菌素類藥物，如羥氨芐青霉素、頭孢克羅、頭孢立新、頭孢拉定等抗菌藥物。這些藥物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、弓形體、螺旋體等均有殺滅作用，在臨床醫(yī)學(xué)上被廣泛應(yīng)用，對(duì)很多常見(jiàn)病的治療起著重要的作用。已有技術(shù)制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸方法有兩種化學(xué)合成法和酶法?；瘜W(xué)合成法的缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜、成本高、對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。酶法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸與化學(xué)合成法相比具有工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品收率高、能源消耗少、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，是目前最經(jīng)濟(jì)的工業(yè)生產(chǎn)方法。生物酶法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸可以分為酶拆分法和酶轉(zhuǎn)化法兩種方法。酶拆分法以化學(xué)法制備的乙?；疍L-HPG為底物，利用氨基?；高M(jìn)行拆分。酶轉(zhuǎn)化法以DL-對(duì)羥基苯海因?yàn)榈孜?，利用海因酶將底物轉(zhuǎn)化為D-對(duì)羥基苯甘氨酸。酶拆分法的缺點(diǎn)是1、產(chǎn)物收率低，最高不超過(guò)50%;2、必須事先合成消旋的乙?；疍L-HPG底物， 工藝復(fù)雜。酶轉(zhuǎn)化法制備D-對(duì)羥基-苯甘氨酸是利用微生物體內(nèi)產(chǎn)生的D-海因酶DHase 將DL-對(duì)羥基苯海因水解成為N-氨甲酰對(duì)羥基苯甘氨酸NC-D-p-HPG，然后用化學(xué)法或氨甲酰水解酶將NC-D-p-HPG水解脫去氨甲?；玫紻-對(duì)羥基-苯甘氨酸。酶轉(zhuǎn)化法理論上能將底物100%地轉(zhuǎn)化為單一對(duì)映體的氨基酸，但是現(xiàn)在能夠以高產(chǎn)率和高光學(xué)純度實(shí)現(xiàn)上述轉(zhuǎn)化制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的微生物菌種還很少。所以發(fā)明一種能夠促進(jìn)酶轉(zhuǎn)化法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的微生物菌種和利用該微生物菌種制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法是十分必要的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)酶轉(zhuǎn)化法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的微生物新菌種和利用該微生物新菌種制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種產(chǎn)堿桿菌 Alcaligenes sp. SHNUO1，菌種保存號(hào) CGMCC NO. 3872。采用上述產(chǎn)堿桿菌作為催化劑制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，包括下列步驟(1)取產(chǎn)堿桿菌 Alcaligenes sp. SHNUOl，CGMCC NO. 3872 細(xì)胞置于 pH 值為 6 10的磷酸鉀緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液中；(2)向步驟⑴緩沖溶液中加入濃度為10 200mM的消旋體海因，反應(yīng)溫度20 50°C，反應(yīng)時(shí)間3 96小時(shí)，得N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸；(3)將步驟(2)反應(yīng)液與NaNO2反應(yīng)后分離、純化得D-對(duì)羥基苯甘氨酸。步驟(1)中所述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞濃度為濕重5 100g/L。步驟O)中所述消旋體海因?yàn)閷?duì)羥基苯海因。
本發(fā)明的要點(diǎn)是從土壤中分離并經(jīng)過(guò)多輪篩選后獲得的新的產(chǎn)堿桿菌，該產(chǎn)堿桿菌菌種于2010年5月M日在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC3872 ； 并利用該產(chǎn)堿桿菌的催化作用選擇性水解反應(yīng)制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸。本發(fā)明的具體實(shí)施方法是1、菌種的富集富集將取自各地的土樣加入到IOml無(wú)菌水中，均勻攪拌，待部分沉降后取約ImL 上部混合液加入富集培養(yǎng)基中，于，200r/min恒溫振蕩培養(yǎng)約48h。分離將經(jīng)富集培養(yǎng)得到的菌液稀釋適當(dāng)濃度，各取0. 2mL涂布于分離培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)直到長(zhǎng)出足夠大的菌落。純化挑取生長(zhǎng)良好、菌落大小、形態(tài)、顏色不一的菌落劃線接種于普通細(xì)菌培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化；挑取典型單菌落，反復(fù)純化，得到純種。2、菌種的篩選雙層瓊脂法篩選將分離得到的各菌株點(diǎn)種于普通細(xì)菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)21h，覆蓋一薄層45°C 左右的含有底物及15g/L瓊脂的Tris-HCl，pH8. 0，作為上層，待凝固后于培養(yǎng)Mh。直接在菌落上滴加一滴濃度為100g/L的PDAB，對(duì)二甲氨基苯甲醛6mol/L HCl配制，5_10s內(nèi)呈特異的黃色者為陽(yáng)性菌株。微孔快速篩選法復(fù)篩將上述得到的陽(yáng)性菌株接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基斜面上二8°C培養(yǎng)21h。配制含底物 D-p-HPH的9g/L的Tris-HCl緩沖液，pH9. 0。在每個(gè)微孔內(nèi)加入底物液100 μ L，同時(shí)在另一孔內(nèi)加入不含底物的ΡΗ9. 0的Tris-HCl緩沖液作為空白對(duì)照。從斜面上各挑少許等量菌體分別加入2孔內(nèi)，混勻，37°C下反應(yīng)0.證，然后在各孔中加入100g/L對(duì)二甲氨基苯甲醛 15μ L，5-10s出現(xiàn)特異黃色而對(duì)照無(wú)色者為陽(yáng)性菌株。產(chǎn)物的薄層色譜測(cè)定用pH8. 0,0. 2mol/L的磷酸鈉鹽緩沖液配制DL-對(duì)羥基苯海因溶液，將50mL 6%的 DL-對(duì)羥基苯海因溶液，加入到各個(gè)含有陽(yáng)性菌株的錐形瓶中，于37°C 150r/min振蕩反應(yīng) 42-4 ι。離心取上清液，滴加HCL調(diào)節(jié)pH至3，振蕩反應(yīng)池。用毛細(xì)管取轉(zhuǎn)化液點(diǎn)樣于薄層層析板上，同時(shí)分別以DL-對(duì)羥基苯海因，D-對(duì)羥基苯甘氨酸溶液點(diǎn)樣作對(duì)照，用正丁醇冰醋酸水體積比為4 1 1配制的層析劑展開，待溶劑展開到距頂端約IOmm時(shí)取出，在紫外燈下有D-對(duì)羥基苯甘氨酸條帶出現(xiàn)者確定為產(chǎn)海因酶的菌株，從中優(yōu)選一株活性和選擇性最高的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)和生理生化鑒定確定其屬于產(chǎn)堿桿菌。本發(fā)明制備的產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp. ) SHNUOl，在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心保藏號(hào)為CGMCC NO. 3872。采用上述產(chǎn)堿桿菌做為催化劑制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，包括下列步驟(1)培養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp. ) SHNUO1, CGMCC N0. 3872，然后取上述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞置于緩沖溶液中；(2)向上述緩沖溶液中加入消旋體對(duì)羥基苯海因，經(jīng)催化水解產(chǎn)生D-N-氨甲酰-對(duì)羥基苯甘氨酸，經(jīng)亞硝酸鈉處理后得到D-對(duì)羥基苯甘氨酸；
(3)反應(yīng)液經(jīng)分離、純化得到目標(biāo)產(chǎn)物光學(xué)純D-對(duì)羥基苯甘氨酸。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，反應(yīng)體系中產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞濃度為5 IOOg(濕重)/L。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，反應(yīng)體系中消旋體海因的濃度為10 200mM。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，反應(yīng)溫度控制為20 50°C，反應(yīng)時(shí)間為3 96 小時(shí)。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，緩沖溶液為PH值為6 8的磷酸鉀緩沖溶液或 Tris-HCl緩沖溶液。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，反應(yīng)體系中可加入質(zhì)量為反應(yīng)體系質(zhì)量0. 2% 10 %的有機(jī)助溶劑，所述有機(jī)助溶劑選自甲醇、乙醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺中的一種或一種以上的混合物。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，消旋體海因?yàn)閷?duì)羥基苯海因。本發(fā)明采用新的產(chǎn)堿桿菌做為催化劑對(duì)消旋體海因進(jìn)行對(duì)映選擇性水解反應(yīng)結(jié)合化學(xué)處理制備出> 99%的高光學(xué)純度D-對(duì)羥基苯甘氨酸。該催化劑易于制備、反應(yīng)條件溫和，具有工業(yè)應(yīng)用開發(fā)前景。在實(shí)施例中D-對(duì)羥基苯甘氨酸產(chǎn)率可達(dá)90%，對(duì)映體過(guò)量值大于99%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、產(chǎn)堿桿菌選育方法簡(jiǎn)單，易于制備。2、采用本發(fā)明產(chǎn)堿桿菌催化效果好，制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸產(chǎn)率高達(dá)90 %，D-對(duì)羥基苯甘氨酸成本低。3、制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸無(wú)污染物排放，有利于保護(hù)環(huán)境。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp. ) SHNUO1, CGMCC NO. 3872是一種屬于細(xì)菌類桿菌屬的菌株，該菌株是從土壤中分離，并經(jīng)過(guò)多輪篩選后獲得的，于2010 年5月M日在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC3872。本發(fā)明的菌種具有如下的微生物學(xué)特征該菌株在普通細(xì)菌固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落，外觀溫潤(rùn)，顏色乳白色，邊緣處為細(xì)致的不規(guī)則小鋸齒狀，側(cè)面觀為圓滑的大弧度凸起。該菌株在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)形成菌環(huán)，說(shuō)明其為好氧細(xì)菌。在10xl00(油鏡)倍的光學(xué)顯微鏡下，可分辨出該菌為單個(gè)的桿菌。經(jīng)革蘭氏染色，顯示該菌株為革蘭氏陰性菌。根據(jù)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，該細(xì)菌與產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)的同源性為 99%。采用上述產(chǎn)堿桿菌作為催化劑制備光學(xué)純手性N-氨甲酰-氨基酸的方法，包括下列步驟a.培養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.) SHNUO1，CGMCC NO. 3872，然后取上述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞置于緩沖溶液中；b.向上述緩沖溶液中加入消旋體對(duì)羥基苯海因，經(jīng)催化對(duì)映選擇性水解產(chǎn)生相應(yīng)的D-N-氨甲酰-對(duì)羥基苯甘氨酸，之后在酸性條件下加入亞硝酸鈉將D-N-氨甲酰-對(duì)羥基苯甘氨酸轉(zhuǎn)化為D-對(duì)羥基苯甘氨酸；c.反應(yīng)液經(jīng)分離、純化得到目標(biāo)產(chǎn)物光學(xué)純D-對(duì)羥基苯甘氨酸。反應(yīng)體系中所述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞濃度為5 IOOg(濕重)/L。反應(yīng)體系中所述所述消旋體海因的濃度為10 200mM。步驟b的反應(yīng)溫度控制為 20 50°C，反應(yīng)時(shí)間為3 96小時(shí)。所述緩沖溶液為pH值為6 8的磷酸鉀緩沖溶液或 Tris-HCl緩沖溶液。實(shí)施例1 細(xì)菌培養(yǎng)基配方為甘油10. Og/L，酵母膏 10. Og/L, KH2PO4 2. Og/L, MgSO4 0. 5g/ L，pH 7.0。取4°C保存的產(chǎn)堿桿菌斜面菌種，挑取一環(huán)接種至裝有50ml培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在30°C下，160rpm振搖培養(yǎng)Mh，離心收獲細(xì)胞。發(fā)酵液酶活力約為10 20U/L，細(xì)胞濃度濕重5 10g/L，單位細(xì)胞的酶活力為2U/g濕細(xì)胞。細(xì)胞活力單位的定義為在30°C， PH 7.0的條件下，每分鐘催化對(duì)羥基苯海因水解生成1.0 μ mol N-氨甲酰對(duì)羥基苯甘氨酸所需的酶量。實(shí)施例2 取濕重1. Og的上述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞，懸浮于9. 5ml磷酸鈉鹽緩沖溶液中(0. 1M，pH 8. 5)，加入200mg對(duì)羥基苯海因和0. 5ml 二甲基亞砜，反應(yīng)混合物在30°C、160r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，間歇取樣用液相色譜(色譜柱為Chromasil C18色譜柱)分析對(duì)羥基苯海因和N-甲酰對(duì)羥基苯甘氨酸含量，反應(yīng)12小時(shí)后，N-甲酰對(duì)羥基苯甘氨酸的分析產(chǎn)率為 95%。實(shí)施例3 取濕重20. Og的上述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞，懸浮于190ml磷酸鈉鹽緩沖溶液中(0. 1M，pH 8. 5)，加入4g對(duì)羥基苯海因和IOml 二甲基亞砜，反應(yīng)混合物在30°C、160r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，將反應(yīng)18-20hr的反應(yīng)液離心，取上清，在冰水浴中緩慢滴加濃鹽酸(6mol/ L)，將pH值調(diào)為pH 3.0左右。然后，用現(xiàn)配制的10%的NaNO2溶液，繼續(xù)在冰水浴的條件下緩慢滴加:3hr，其中，濃鹽酸與10%的NaNO2溶液的體積比大約為4 5。滴加完畢后，繼續(xù)反應(yīng)air。采用國(guó)產(chǎn)732陽(yáng)離子交換樹脂純化產(chǎn)物，最終得到D-對(duì)羥基苯甘氨酸收率為 90%, [a ]D20(C = 1，lmol/1 HCl) = 160. 5(文獻(xiàn)值-155 -161)。以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說(shuō)明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)堿桿菌 Alcaligenes sp. SHNUO1，菌種保藏號(hào) CGMCCN0. 3872。
2.一種利用產(chǎn)堿桿菌制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，包括以下步驟(1)取產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp. SHNUOLCGMCC NO. 3872 細(xì)胞置于 pH 值為 6 10 的磷酸鉀緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液中；(2)向步驟(1)緩沖溶液中加入濃度為10 200mM的消旋體海因，反應(yīng)溫度20 50°C，反應(yīng)時(shí)間3 96小時(shí)，得N-氨甲酰-D-氨基酸；(3)將步驟(2)產(chǎn)物與NaNO2反應(yīng)后分離、得D-對(duì)羥基苯甘氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用產(chǎn)堿桿菌制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于步驟(1)中所述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞濃度為濕重5 100g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用產(chǎn)堿桿菌制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于步驟O)中所述消旋體海因?yàn)閷?duì)羥基苯海因。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)堿桿菌及其用途，一種產(chǎn)堿桿菌以及利用其制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法。已有技術(shù)制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸方法的缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜、成本高、對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。本發(fā)明從土壤中分離并篩選后獲得菌種保存號(hào)CGMCC No.3872的產(chǎn)堿桿菌。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法為取產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞置于磷酸鉀緩沖溶液中；向緩沖溶液中加入消旋體海因，反應(yīng)溫度20～50℃，時(shí)間3～96小時(shí)；將反應(yīng)液與NaNO2反應(yīng)后分離、純化得D-對(duì)羥基苯甘氨酸。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)堿桿菌選育方法簡(jiǎn)單；制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸效果好，產(chǎn)率高達(dá)90％；D-對(duì)羥基苯甘氨酸成本低；無(wú)污染物排放，有利于保護(hù)環(huán)境。
文檔編號(hào)C12R1/05GK102399709SQ201110240379
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者孫婧, 徐毅, 陳建波 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)