專利名稱：一種鐵皮石斛組培菌根化種苗生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛種苗生產(chǎn)方法，尤其涉及一種鐵皮石斛組培菌根化種苗 生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛iPendrobium officinale Kimura et Migo)屬珍稀瀕危高附加值藥材， 其養(yǎng)生保健治療效果確切，在《道藏》、《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》、《現(xiàn)代中藥大辭典》、2010 年版《中華人民共和國(guó)藥典》等醫(yī)藥典籍中均有記載。唐開元年道家經(jīng)典著作《道藏》收錄 中華九大仙草(鐵皮石斛、天山雪蓮、三兩重人參、百二十年首烏、花甲之茯苓、蓯蓉、深山 靈芝、海底珍珠、冬蟲夏草)，因鐵皮石斛滋陰補(bǔ)虛效果顯著，被列為“中華九大仙草”之首 位。李時(shí)珍《本草綱目》記載“強(qiáng)陰益精。久服，厚腸胃，補(bǔ)內(nèi)絕不足，平胃氣，長(zhǎng)肌肉，逐皮 膚邪熱痱氣，腳膝疼冷痹弱，定智除驚，輕身延年。益氣除熱，健陽(yáng)，逐皮膚風(fēng)痹，骨中久冷， 補(bǔ)腎益力。治發(fā)熱自汗，癰疽排膿內(nèi)塞。”在2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部中單列， 與其它環(huán)草石斛、馬鞭石斛、黃草石斛、金釵石斛和鼓槌石斛等普通石斛種類區(qū)分，其功能 與主治“益胃生津，滋陰清熱。用于陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后虛熱，目暗不明?！?br>
因?qū)贋l危、珍稀、高附加值的資源性藥材，鐵皮石斛被列入《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材 物種名錄》(1987年)、《中國(guó)植物紅皮書》(1992年)、《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》 (CITES)附錄II。2010年，鐵皮石斛生產(chǎn)技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化再次被列入國(guó)家重點(diǎn)新產(chǎn)品計(jì)劃和 國(guó)家火炬計(jì)劃的優(yōu)先發(fā)展技術(shù)領(lǐng)域。鐵皮石斛作為一種常用中藥材，市場(chǎng)需求量較大，如何 解決需求與資源之間的矛盾惟一的途徑是人工栽培，采用植物組培技術(shù)。隨著組織培養(yǎng)技 術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，鐵皮石斛的組培技術(shù)已經(jīng)基本成熟，但是組培無(wú)菌苗移入自然條件下成 活率低，易染雜菌，這些都和缺少與之共生的菌根真菌有關(guān)。在自然狀態(tài)下，蘭科植物要與 真菌共生形成菌根，才能使蘭科植物健壯的生長(zhǎng)。根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)，我們自1992年開始從事 鐵皮石斛菌根真菌的分離、培養(yǎng)及鐵皮石斛組培苗的菌根化方法的研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種鐵皮石斛組培菌根化種苗生產(chǎn)方法，使用該方法不僅促 進(jìn)鐵皮石斛組培種苗生長(zhǎng)，而且組培苗明顯粗壯，種植成活率高。本發(fā)明采用的方法是先分別培養(yǎng)菌根真菌和細(xì)菌，再將菌根真菌及細(xì)菌與鐵皮石 斛莖誘導(dǎo)出的原球莖小芽共生培養(yǎng)，具體方法如下
(1)菌根真菌的培養(yǎng)
將菌根真菌LPl菌株自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，接于PDA平皿中，于 23^280C (優(yōu)選M 26°C)恒溫培養(yǎng)1(T15 d (優(yōu)選1廣13 d)，在菌落邊緣打孔成菌片(優(yōu)選 Φ =8 mm)，并以小塊接入固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基；菌根真菌LPl為毛殼菌屬ijOhaetomium 印.)，該菌種保藏于中國(guó)藥用微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CPCC 480286 ；
菌根真菌的固體培養(yǎng)基含有木質(zhì)素、纖維素、碳、氮等營(yíng)養(yǎng)素，由選自原料棉籽殼、木屑、碎玉米芯、闊葉樹鋸末、麥麩中的一種或幾種組成，加水，水量為原料的15(T200 wt%(優(yōu) 選16(T180 wt%)；高壓滅菌后分別接入經(jīng)培養(yǎng)所得菌根真菌LP1，每100 g培養(yǎng)基接2 3片 菌片；真菌用試管、錐形瓶或培養(yǎng)瓶等器皿靜置暗培養(yǎng)，待菌絲大部分或全部長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí) 取出備用；
菌根真菌的液體培養(yǎng)基含有葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽類成分和天然添加物；菌根真菌的液體培 養(yǎng)基用水配制，其中葡萄糖If 22 g/L(優(yōu)選20 g/L)，KH2PO4 18^22 g/L(優(yōu)選20 g/L)， MgSO4 1.2 1.8 g/L(優(yōu)選1.5 g/L)，維生素B1 8 12 mg/L(優(yōu)選10 mg/L)，天然物麥麩 25 35 g/L (優(yōu)選30 g/L)(煮汁)或馬鈴薯180 220 g/L (優(yōu)選200 g/L)(使用其浸出 液)，培養(yǎng)基PH值為5.6飛.5(優(yōu)選？!1=6.0)；高壓滅菌后接入經(jīng)培養(yǎng)所得菌根真菌LPl，每 100 mL培養(yǎng)基接入廣2片菌片；真菌用三角瓶或其他容器通氣暗培養(yǎng)，盛裝量為50%，置于 23 25°C振蕩，轉(zhuǎn)速10(T120 rpm，培養(yǎng)2(T30 d后收獲；培養(yǎng)結(jié)束后得到液態(tài)菌根真菌，可 直接使用或用勻漿機(jī)打碎培養(yǎng)產(chǎn)物備用； (2)菌根細(xì)菌的培養(yǎng)
配制無(wú)氮培養(yǎng)基葡萄糖8 12g/L (優(yōu)選10 g/L)，NaCl 0. 18 0. 22 g/L (優(yōu)選0. 2 g/ L)，KH2PO4 0. 18 0. 22 g/L (優(yōu)選 0. 2 g/L)，CaSO4 · 2H20 0. 08 0. 12g/L (優(yōu)選 0. 1 g/L)， MgSO4 0. 18 0. 22g/L (優(yōu)選 0. 2g/L)，CaCO3 4 6 g/L (優(yōu)選 5 g/L)，其余為水；調(diào)節(jié) pH 值為 6.纊7.2(優(yōu)選7.0)，于120°C高壓滅菌20 min后，放入4°C冰箱備用，保存不超過(guò)半年；
將菌根細(xì)菌DP6自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，接于上述配制的無(wú)氮培養(yǎng)基中， 20 30°C水浴靜止培養(yǎng)16 h，或者20 30°C (優(yōu)選25°C )水浴搖床，轉(zhuǎn)速100 120 rpm 培養(yǎng)8 10 h (優(yōu)選9 h)；菌根細(xì)菌DP6為固氮菌(Azotobacter印.)，保藏于中國(guó)林業(yè)微生 物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CFCC1605 ； (3)鐵皮石斛組培苗培養(yǎng) 本步驟在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度為23 27°C，采用組培特定光譜節(jié)能燈(紅光波長(zhǎng) 640^650 nm，藍(lán)光波長(zhǎng)450 460 nm)作為光源，每天光照10 14 h (優(yōu)選12 h)；取野生 的生長(zhǎng)一年的鐵皮石斛的莖進(jìn)行滅菌處理，將滅菌的石斛莖切成帶有莖節(jié)的段，接種于誘 導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L，誘導(dǎo)莖節(jié)發(fā)芽；將芽接種于培養(yǎng)基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)出大量原球莖；將原球莖接種于培養(yǎng)基(1/2_1)N6+BA 1.5 mg/ L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁，誘導(dǎo)原球莖分化成小芽；將小芽接種于培養(yǎng)基(1/2-1) N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7. 5 wt%香蕉汁中，在此培養(yǎng)基中同時(shí)加入備好的液體菌 根真菌1.5 3.0 mL/L或固體菌根真菌1.5 3.0 g/L，以及細(xì)菌培養(yǎng)液廣2 mL/L，在此培養(yǎng) 基中小芽生長(zhǎng)成小植株；再加入培養(yǎng)液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖 3 wt%+液體菌根真菌1. 5 3. 0 mL/L或固體菌根真菌1. 5 3. 0 g/L+細(xì)菌培養(yǎng)液廣2 mL/L, 其pH=5. 8，待小芽生長(zhǎng)成中植株；最后加入培養(yǎng)液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12. 5% wt香 蕉汁+3 wt%蔗糖+液體菌根真菌1.5 3.0 mL/L或固體菌根真菌1.5 3.0 g/L+細(xì)菌培養(yǎng) 液廣2 mL/L，其pH=5. 8，待中植株生長(zhǎng)成大植株； (4)組培苗的水培煉苗
營(yíng)養(yǎng)液由以下組分構(gòu)成硝酸鉀1. 0 1. 2 wt%o (優(yōu)選1. 1 wt%o)，硫酸銨0. 18 0. 22 wt% (優(yōu)選 0. 2 wt% )，硝酸銨 0. 08 0. 12 wt%。(優(yōu)選 0. 1 wt%。)，硫酸鎂 0. 1 0. 14 wt% (優(yōu)選 0. 12 wt% )，磷酸二氫鉀 0. 08 0. 12 wt%。(優(yōu)選 0. 10 wt%。)，氯化鈣0. 04 0. 08 wt% (優(yōu)選 0. 06 wt% )，硫酸錳 0. 01 0. 03 wt%。(優(yōu)選 0. 02 wt%。)，硫 酸亞鐵 0. 02 0. 04 wt% (優(yōu)選 0. 03 wt% )，硫酸鋅 0. 004 0. 006 wt%。(優(yōu)選 0. 005 wt%。)，其余為水；
將得到的鐵皮石斛培養(yǎng)苗取出，用15 20°C (優(yōu)選17°C)的清水沖洗，浙去多余水分， 栽種于架在營(yíng)養(yǎng)液槽上的打好小孔的泡沫板的孔隙中，將營(yíng)養(yǎng)液注入營(yíng)養(yǎng)液槽中，使?fàn)I養(yǎng) 液浸沒(méi)根系的40飛0%，開動(dòng)營(yíng)養(yǎng)液槽的循環(huán)水泵，流速4飛m/s;通風(fēng)，風(fēng)速0.3 0.5 m/s, 進(jìn)行種苗煉化；1壙22 d后，鐵皮石斛種苗根系發(fā)達(dá)，再生根增多，莖長(zhǎng)長(zhǎng)增粗，葉片變綠，變 厚，即可以拔出進(jìn)行大田移栽。采用本發(fā)明提供的鐵皮石斛組培菌根化苗的生產(chǎn)方法，不僅促進(jìn)鐵皮石斛組培種 苗生長(zhǎng)，而且組培苗明顯粗壯。移栽后，成活率可達(dá)95%以上，生長(zhǎng)量大，新芽分蘗多且長(zhǎng)勢(shì) 迅猛，抗逆性強(qiáng)。與不接菌根真菌和細(xì)菌組培的鐵皮石斛苗對(duì)照組相比，接菌的鐵皮石斛苗 比對(duì)照植株根系發(fā)達(dá)，植株節(jié)間明顯膨大，鮮重有所提高，一般提高1(Γ20%。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1
(1)菌根真菌的培養(yǎng)
本實(shí)施例采用菌根真菌LPl自低溫保藏的斜面試管菌種活化一次后，轉(zhuǎn)接與PDA平皿 中，25°C恒溫培養(yǎng)12 d時(shí)，用Φ=8 mm的打孔器分別在平皿中的菌落邊緣打孔成菌片，以小 塊接入固體培養(yǎng)基；
真菌菌株培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)，菌根真菌的固體培養(yǎng)基原料采用棉籽殼與闊葉樹鋸末按 重量比1:1混合，加水量為原料的170 wt%;高壓滅菌后分別接入上述真菌，每100 g培養(yǎng) 基接2片菌片(Φ=8 mm)；真菌用錐形瓶靜置暗培養(yǎng)，待菌絲大部分或全部長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí)取 出，得到固體菌根真菌；
(2)菌根細(xì)菌的培養(yǎng)
配制無(wú)氮培養(yǎng)基葡萄糖 10 g/L，NaCl 0. 2 g/L，KH2PO4 0. 2 g/L，CaSO4 · 2H20 0. 1 g/ L，MgSO4 0. 2 g/L, CaCO3 5 g/L，其余為水，調(diào)節(jié)pH值為7. 0，于120°C高壓滅菌20 min后， 放入4°C冰箱備用，保存不超過(guò)半年；
將菌根細(xì)菌DP6自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，接于上述配制的無(wú)氮培養(yǎng)基中， 25°C水浴搖床，轉(zhuǎn)速120 rpm，培養(yǎng)9 h ；菌根細(xì)菌DP6為固氮菌(Azotobacter印.)，目前 保藏于中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CFCC1605 ；
(3)鐵皮石斛組培菌根化苗的生產(chǎn)
本步驟在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度為25士 1°C，采用組培特定光譜節(jié)能燈(紅光波長(zhǎng)645 nm，藍(lán)光波長(zhǎng)455 nm)作為光源，每天光照12 h ；取野生的生長(zhǎng)一年的鐵皮石斛的莖進(jìn)行 滅菌處理，將滅菌的石斛莖切成帶有莖節(jié)的段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2-1)Ν6+ΒΑ 2.5 mg/ L，誘導(dǎo)莖節(jié)發(fā)芽；將芽接種于培養(yǎng)基(1/2-1)N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)出大量 原球莖；將原球莖接種于培養(yǎng)基(1/2-1) N6+BA 1.5 mg/L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁，誘 導(dǎo)原球莖分化成小芽；將小芽接種于培養(yǎng)基(1/2-1)N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7. 5 wt%香蕉汁中，在此培養(yǎng)基中同時(shí)加入備好的固體菌根真菌2. 0 g/L,以及細(xì)菌培養(yǎng)液2. 0mL/L，在此培養(yǎng)基中小芽生長(zhǎng)成小植株；再加入培養(yǎng)液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖3 wt%+固體菌根真菌2. 0 g/L+細(xì)菌培養(yǎng)液2. 0 mL/L,其pH=5. 8，待小芽 生長(zhǎng)成中植株；最后加入培養(yǎng)液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12. 5% wt香蕉汁+3 wt%蔗糖 +固體菌根真菌2. 0 g/L+細(xì)菌培養(yǎng)液2. 0 mL/L，其pH=5. 8，待中植株生長(zhǎng)成大植株； (4)組培苗的水培煉苗
按如下比例配制營(yíng)養(yǎng)液硝酸鉀1. 1 wt%。，硫酸銨0. 2 wt%。，硝酸銨0. 1 wt%。，硫酸鎂 0. 12 wt%。，磷酸二氫鉀0. 10 wt%。，氯化鈣0. 06 wt%。，硫酸錳0. 02 wt%。，硫酸亞鐵0. 03 wt%。，硫酸鋅0. 005 wt%。，其余為水；
將得到的鐵皮石斛培養(yǎng)苗取出，用17士 1°C的清水沖洗，浙去多余水分，栽種于架在營(yíng) 養(yǎng)液槽上的打好小孔(Φ=5 mm)的泡沫板(厚5 mm)的孔隙中，將營(yíng)養(yǎng)液注入營(yíng)養(yǎng)液槽中， 使?fàn)I養(yǎng)液浸沒(méi)根系的50%，開動(dòng)營(yíng)養(yǎng)液槽的循環(huán)水泵，流速5米/秒；通風(fēng)，風(fēng)速0.4 m/s，進(jìn) 行種苗煉化；19 d后，鐵皮石斛種苗根系發(fā)達(dá)，再生根增多，莖長(zhǎng)長(zhǎng)增粗，葉片變綠，變厚，即 可以拔出進(jìn)行大田移栽。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和接菌組，對(duì)照組植株生長(zhǎng)過(guò)程不添加菌根真菌和細(xì)菌，其余所 有步驟與接菌組相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。實(shí)施例2
本實(shí)施例基本操作同實(shí)施例1，不同之處是
1、本實(shí)施例用的菌株LPl真菌菌株，不采用DP6細(xì)菌菌株。2、菌根真菌采用液體培養(yǎng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的配制用水配制，葡萄糖20 g/L,KH2PO4 20 g/L, MgSO4 1. 5 g/L，維生素 B1 10 mg/L，天然物麥麩 30 g/L (煮汁)，培養(yǎng)基 pH=6. 0。 高壓滅菌后接入上述真菌，每100 mL培養(yǎng)基接入2片菌片(φ=8 mm)。真菌用三角瓶振蕩 通氣暗培養(yǎng)，三角瓶裝量50%，轉(zhuǎn)速100 rpm，25°C培養(yǎng)25 d收獲。培養(yǎng)結(jié)束后用勻漿機(jī)打 碎培養(yǎng)產(chǎn)物，得到液體菌根真菌。鐵皮石斛組培菌根化苗的生產(chǎn)過(guò)程中菌根真菌添加為液體菌根真菌2 mL/L。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和接菌組，對(duì)照組植株生長(zhǎng)過(guò)程不添加菌根真菌和細(xì)菌，其余所 有步驟與接菌組相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1
權(quán)利要求
1. 一種鐵皮石斛組培菌根化種苗生產(chǎn)方法，其特征在于步驟如下(1)菌根真菌的培養(yǎng)將菌根真菌LPl菌株自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，接于PDA平皿中，于23l8°C 恒溫培養(yǎng)1(T15 d，在菌落邊緣打孔成菌片，并以小塊接入固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基；菌根 真菌LPl為毛殼菌屬ifhaetomium印.)，該菌種保藏于中國(guó)藥用微生物菌種保藏管理中 心，保藏編號(hào)為CPCC 480286 ；菌根真菌的固體培養(yǎng)基含有木質(zhì)素、纖維素、碳、氮等營(yíng)養(yǎng)素，由選自原料棉籽殼、木 屑、碎玉米芯、闊葉樹鋸末、麥麩中的一種或幾種組成，加水，水量為原料的15(Γ200襯％;高 壓滅菌后分別接入經(jīng)培養(yǎng)所得菌根真菌LP1，每100 g培養(yǎng)基接2 3片菌片；真菌用試管、 錐形瓶或培養(yǎng)瓶等器皿靜置暗培養(yǎng)，待菌絲大部分或全部長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí)取出備用；菌根真菌的液體培養(yǎng)基含有葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽類成分和天然添加物；菌根真菌的液體培 養(yǎng)基用水配制，其中葡萄糖If 22 g/L(優(yōu)選20 g/L)，KH2PO4 18^22 g/L(優(yōu)選20 g/L)， MgSO4 1.2 1.8 g/L(優(yōu)選1.5 g/L)，維生素B1 8 12 mg/L(優(yōu)選10 mg/L)，天然物麥麩 25 35 g/L (優(yōu)選30 g/L)(煮汁)或馬鈴薯180 220 g/L (優(yōu)選200 g/L)(使用其浸出 液)，培養(yǎng)基PH值為5.6飛.5(優(yōu)選？!1=6.0)；高壓滅菌后接入經(jīng)培養(yǎng)所得菌根真菌LPl，每 100 mL培養(yǎng)基接入廣2片菌片；真菌用三角瓶或其他容器通氣暗培養(yǎng)，盛裝量為50%，置于 23 25°C振蕩，轉(zhuǎn)速10(T120 rpm，培養(yǎng)2(T30 d后收獲；培養(yǎng)結(jié)束后得到液態(tài)菌根真菌，可 直接使用或用勻漿機(jī)打碎培養(yǎng)產(chǎn)物備用；(2)菌根細(xì)菌的培養(yǎng)配制無(wú)氮培養(yǎng)基葡萄糖 8 12g/L，NaCl 0. 18 0. 22 g/L, KH2PO4 0. 18^0. 22 g/L, CaSO4 · 2H20 0. 08 0. 12g/L, MgSO4 0. 18 0. 22g/L, CaCO3 4 6 g/L，其余為水；調(diào)節(jié) pH 值為 6. 9^7. 2，于120°C高壓滅菌20 min后，放入4°C冰箱備用，保存不超過(guò)半年；將菌根細(xì)菌DP6自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，接于上述配制的無(wú)氮培養(yǎng)基中， 20 30°C水浴靜止培養(yǎng)16 h，或者20 30°C水浴搖床，轉(zhuǎn)速100 120 rpm培養(yǎng)8 10 h ； 菌根細(xì)菌DP6為固氮菌(Azotobacter印.)，保藏于中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保 藏編號(hào)為CFCC1605 ；(3)鐵皮石斛組培苗培養(yǎng) 本步驟在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度為23 27°C，采用組培特定光譜節(jié)能燈(紅光波長(zhǎng) 640^650 nm，藍(lán)光波長(zhǎng)450 460 nm)作為光源，每天光照10 14 h (優(yōu)選12 h)；取野生 的生長(zhǎng)一年的鐵皮石斛的莖進(jìn)行滅菌處理，將滅菌的石斛莖切成帶有莖節(jié)的段，接種于誘 導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L，誘導(dǎo)莖節(jié)發(fā)芽；將芽接種于培養(yǎng)基(1/2-1) N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)出大量原球莖；將原球莖接種于培養(yǎng)基(1/2_1)N6+BA 1.5 mg/ L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁，誘導(dǎo)原球莖分化成小芽；將小芽接種于培養(yǎng)基(1/2-1) N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7. 5 wt%香蕉汁中，在此培養(yǎng)基中同時(shí)加入備好的液體菌 根真菌1.5 3.0 mL/L或固體菌根真菌1.5 3.0 g/L，以及細(xì)菌培養(yǎng)液廣2 mL/L，在此培養(yǎng) 基中小芽生長(zhǎng)成小植株；再加入培養(yǎng)液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖 3 wt%+液體菌根真菌1. 5 3. 0 mL/L或固體菌根真菌1. 5 3. 0 g/L+細(xì)菌培養(yǎng)液廣2 mL/L, 其pH=5. 8，待小芽生長(zhǎng)成中植株；最后加入培養(yǎng)液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12. 5% wt香 蕉汁+3 wt%蔗糖+液體菌根真菌1.5 3.0 mL/L或固體菌根真菌1.5 3.0 g/L+細(xì)菌培養(yǎng)液廣2 mL/L，其pH=5. 8，待中植株生長(zhǎng)成大植株；(4)組培苗的水培煉苗營(yíng)養(yǎng)液由以下組分構(gòu)成硝酸鉀1. 0 1. 2 wt%o (優(yōu)選1. 1 wt%o)，硫酸銨0. 18 0. 22 wt% (優(yōu)選 0. 2 wt% )，硝酸銨 0. 08 0. 12 wt%。(優(yōu)選 0. 1 wt%。)，硫酸鎂 0. 1 0. 14 wt% (優(yōu)選 0. 12 wt% )，磷酸二氫鉀 0. 08 0. 12 wt%。(優(yōu)選 0. 10 wt%。)，氯化鈣 0. 04 0. 08 wt% (優(yōu)選 0. 06 wt% )，硫酸錳 0. 01 0. 03 wt%。(優(yōu)選 0. 02 wt%。)，硫 酸亞鐵 0. 02 0. 04 wt% (優(yōu)選 0. 03 wt% )，硫酸鋅 0. 004 0. 006 wt%。(優(yōu)選 0. 005 wt%。)，其余為水；將得到的鐵皮石斛培養(yǎng)苗取出，用15 20°C (優(yōu)選17°C )的清水沖洗，浙去多余水分， 栽種于架在營(yíng)養(yǎng)液槽上的打好小孔的泡沫板的孔隙中，將營(yíng)養(yǎng)液注入營(yíng)養(yǎng)液槽中，使?fàn)I養(yǎng) 液浸沒(méi)根系的40飛0%，開動(dòng)營(yíng)養(yǎng)液槽的循環(huán)水泵，流速4飛m/s;通風(fēng)，風(fēng)速0.3 0.5 m/s, 進(jìn)行種苗煉化；1壙22 d后，鐵皮石斛種苗根系發(fā)達(dá)，再生根增多，莖長(zhǎng)長(zhǎng)增粗，葉片變綠，變 厚，即可以拔出進(jìn)行大田移栽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產(chǎn)方法，其特征在于所述將菌根 真菌管經(jīng)菌種活化后，接于PDA平皿中，于M 26°C恒溫培養(yǎng)1廣13 d。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產(chǎn)方法，其特征在于所述菌根真 菌的固體培養(yǎng)基的加水量為原料的16(T180 wt%0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產(chǎn)方法，其特征在于所述菌根真 菌的液體培養(yǎng)基用水配制，其中葡萄糖20 g/L, KH2PO4 20 g/L,MgSO4 1.5 g/L，維生素B1 10 mg/L，天然物麥麩30 g/L(煮汁)或馬鈴薯200 g/L(使用其浸出液)，培養(yǎng)基pH值為6.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產(chǎn)方法，其特征在于所述配制 無(wú)氮培養(yǎng)基葡萄糖 10 g/L, NaCl 0. 2 g/L, KH2PO4 0. 2 g/L, CaSO4 · 2H20 0. 1 g/L, MgSO4 0. 2g/L，CaCO3 5 g/L，其余為水，調(diào)節(jié)pH值為7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產(chǎn)方法，其特征在于所述菌根細(xì) 菌DP6自低溫保藏的斜面試管菌種活化后于無(wú)氮培養(yǎng)基中水浴搖床培養(yǎng)時(shí)，溫度為25°C， 培養(yǎng)9 h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產(chǎn)方法，其特征在于所述鐵皮石 斛組培苗培養(yǎng)時(shí)，每天光照12 h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產(chǎn)方法，其特征在于所述營(yíng)養(yǎng)液 由以下組分構(gòu)成硝酸鉀1. 1 wt%。，硫酸銨0. 2 wt%。，硝酸銨0. 1 wt%。，硫酸鎂0. 12 wt%0, 磷酸二氫鉀0. 10 wt%。，氯化鈣0. 06 wt%。，硫酸錳0. 02 wt%。，硫酸亞鐵0.03 wt%。，硫酸鋅 0.005 wt%。，其余為水。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產(chǎn)方法，其特征在于所述組培 苗的水培煉苗時(shí)，將前述步驟得到的鐵皮石斛培養(yǎng)苗取出，用17°C的清水沖洗，浙去多余水 分。
全文摘要
一種鐵皮石斛組培菌根化種苗生產(chǎn)方法，其步驟分為(1)采用固體或液體培養(yǎng)基對(duì)菌根真菌進(jìn)行培養(yǎng)，菌根真菌采用菌根真菌LP1為毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)；(2)菌根細(xì)菌的培養(yǎng)，菌根細(xì)菌DP6為固氮菌(Azotobactersp.)；(3)鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)；(4)組培苗的水培煉苗。采用本發(fā)明提供的鐵皮石斛組培菌根化苗的生產(chǎn)方法，不僅促進(jìn)鐵皮石斛組培種苗生長(zhǎng)，而且組培苗明顯粗壯。移栽后，成活率可達(dá)95%以上，生長(zhǎng)量大，新芽分蘗多且長(zhǎng)勢(shì)迅猛，抗逆性強(qiáng)。與不接菌根真菌和細(xì)菌組培的鐵皮石斛苗對(duì)照組相比，接菌的鐵皮石斛苗比對(duì)照植株根系發(fā)達(dá)，植株節(jié)間明顯膨大，鮮重提高10~20%。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102144540SQ201010581919
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者吳維佳, 崔曉娟, 張?zhí)K鋒, 李 杰, 梁經(jīng)軍, 趙興兵, 高正龍, 黃生云 申請(qǐng)人:梁經(jīng)軍