專利名稱：豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)是圓環(huán)病毒屬的代表種，它是一種小而 無(wú)囊膜、二十面體對(duì)稱、共價(jià)閉合、環(huán)狀、單股DNA病毒，病毒粒子直徑平均為17nm，是目前 獸醫(yī)學(xué)上發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列的不同，可將 PCV分為豬圓環(huán)病毒1型(PCVl)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)兩個(gè)型。PCVl對(duì)豬無(wú)致病性， 為非致病性PCV。PCV2對(duì)豬有致病性，可引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome, PMWS)，又稱 PMWS 相關(guān) PCV。Hamel 等通過(guò)對(duì) PCV 基因組 分析，發(fā)現(xiàn)PCVl和PCV2均可能含有11個(gè)開(kāi)放閱讀框(Openreading frame, 0RF)。PCV2閱 讀框中，ORFl和開(kāi)放閱讀框2(0RF2)為主要閱讀框?，F(xiàn)已證實(shí)ORFl編碼與病毒復(fù)制相關(guān) 的R印蛋白，0RF2全長(zhǎng)702bp，編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白及病毒核衣殼蛋白(Cap)。PCV2在 細(xì)胞上的增值滴度很低，很難應(yīng)用傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗。新型的疫苗如DNA疫苗，免 疫效率并不高；而亞單位疫苗比DNA疫苗有更好的免疫力?，F(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)了利用昆蟲細(xì)胞的一個(gè)便利和多用途的桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng) (Baculovirus Expression Systems)。桿狀病毒的特征是通常包含在包涵體(也稱為多角 體)的桿狀病毒顆粒。桿狀病毒科可以分為兩個(gè)亞科真桿狀病毒，有兩個(gè)包涵體病毒屬， 即核多角體病毒(NPV)和顆粒體病毒(GV)；和包括非包涵體病毒的亞科裸桿狀病毒。許多 蛋白質(zhì)已經(jīng)在編碼該蛋白質(zhì)的重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)提 供了生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的有力工具。昆蟲細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)十分成熟，昆蟲細(xì)胞的 微載體培養(yǎng)技術(shù)和懸浮培養(yǎng)技術(shù)為大規(guī)模制備重組蛋白提供了條件。我國(guó)每年因豬圓環(huán)病 毒2型的爆發(fā)給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，利用桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì) 胞中大量表達(dá)重組0RF2蛋白，研制出具有良好免疫效果的亞單位疫苗，對(duì)于豬圓環(huán)病毒相 關(guān)病毒的防制具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的制備方 法，包括以下步驟(1).克隆豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因并引入信號(hào)肽基因序列，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移載體，獲得 包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的轉(zhuǎn)移載體；(2).包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化入含有穿梭載體的大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的穿梭載體，再將該穿梭載體 轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞中，獲得重組桿狀病毒；(3).重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)；(4).由重組桿狀病毒的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型重組
30RF2蛋白，收獲和純化豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白；(5).利用豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白，輔以佐劑，經(jīng)乳化，制備豬圓環(huán)病毒2型 亞單位疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟(1)中豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因序列包含序列表中的SEQ ID NOl。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟(1)中信號(hào)肽基因序列包括蜂毒素信號(hào)肽核苷酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的蜂毒素信號(hào)肽核苷酸序列包含序列表中的SEQ ID N02。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟(2)中所述重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因的表達(dá)受多角體啟 動(dòng)子的控制。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟(4)中所述的重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白序列包含序列表 中的 SEQ ID N03。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白是下面任意一種多肽i)選自序列表中SEQ ID N03序列的多肽；ii)與i)所述多肽至少80%同源的多肽；iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟(5)中所述的佐劑為水性佐劑或油性佐劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面為使用本發(fā)明方法制備的豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)方面為使用本發(fā)明方法制備的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗包含至少1微克/頭份的豬圓 環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白。發(fā)明效果(1)目的蛋白表達(dá)的高效性選用蜂毒素分泌信號(hào)對(duì)目的基因進(jìn)行分泌表達(dá)，使 目的蛋白在桿狀病毒_昆蟲細(xì)胞中獲得高效表達(dá)。(2)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前頗受歡迎的一種表達(dá)系統(tǒng)，他可以進(jìn)行多種翻譯后 修飾作用，包括糖基化、脂肪酸?；?、氨基末端乙?；?、羧基末端酰胺化和信號(hào)肽切割、轉(zhuǎn) 運(yùn)，所表達(dá)蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與天然蛋白比較接近。重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)的 重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白進(jìn)行了多種翻譯后加工和修飾作用，具有較高的生物學(xué)活 性。(3)生物安全性桿狀病毒具有高度的種屬特異性，僅感染昆蟲，對(duì)脊椎動(dòng)物無(wú)感 染性，其表達(dá)產(chǎn)物安全可靠。(4)制備方便，成本低廉重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞能分泌表達(dá)重組豬圓環(huán) 病毒2型0RF2蛋白，只需經(jīng)過(guò)超濾純化、滅活等簡(jiǎn)單處理程序即可以直接應(yīng)用于畜禽疾病 的臨床應(yīng)用。(5)疫苗免疫保護(hù)效果較好通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)該亞單位疫苗效果，免疫保護(hù)率 在80%以上。
圖1為PCR擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型0RF2序列的結(jié)果；圖2為鑒定豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的SDS-PAGE電泳圖3為豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的Western blotting圖；圖4為豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的表達(dá)量測(cè)定；圖5為重組病毒vBac-P2構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例中采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bae Baculovirus Expression System, Invitrogen)對(duì)豬圓環(huán)病毒2型的0RF2基因進(jìn)行全基因擴(kuò)增，并在 5'端引入蜂毒素信號(hào)肽核苷酸序列，構(gòu)建含有蜂毒素信號(hào)肽核苷酸序列和豬圓環(huán)病毒2 型0RF2序列的開(kāi)放閱讀框的重組桿狀病毒，感染昆蟲細(xì)胞，表達(dá)具有高效豬圓環(huán)病毒2型 抗原性的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白，制備成含有豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的亞 單位疫苗。通過(guò)仔豬攻毒試驗(yàn)，驗(yàn)證該亞單位疫苗具有良好的免疫保護(hù)作用。本發(fā)明實(shí)施例中利用豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白，輔以佐劑，并使用本領(lǐng)域常 用的乳化方法，制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。其他本領(lǐng)域常用的佐劑，包括油性佐劑或 水性佐劑，其他本領(lǐng)域常用的疫苗乳化劑、穩(wěn)定劑，其他本領(lǐng)域常用的疫苗制備手段，都可 利用本發(fā)明之PCV2重組0RF2蛋白進(jìn)行疫苗的制備。本發(fā)明實(shí)施例中PCV2重組0RF2蛋白為含序列SEQ ID N03的多肽；使用本發(fā)明之 方法還可生產(chǎn)如下重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白與含序列表中SEQ ID N03序列的多肽至 少80%同源的多肽及含上述多肽的免疫原性部分的多肽。制備上述多肽的實(shí)施例方法與過(guò) 程與本發(fā)明實(shí)施例相同，下面不再累述。本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)選了疫苗成品PCV2重組0RF2蛋白的含量為0. 2微克/頭份、1 微克/頭份、2微克/頭份、4微克/頭份、8微克/頭份、16微克/頭份和40微克/頭份。 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，當(dāng)劑量大于0. 1微克/頭份時(shí)即可以對(duì)豬產(chǎn)生良好的免疫效果。制備 好的疫苗經(jīng)粘度檢測(cè)、離心檢測(cè)、劑型檢測(cè)、穩(wěn)定性檢測(cè)后，各項(xiàng)指標(biāo)均符合規(guī)定。疫苗保存 于4°C。每頭份為2ml。本發(fā)明術(shù)語(yǔ)頭份的含義為一般情況下，免疫一頭牲畜所需的疫苗用 量。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例1豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的制備方法1、克隆豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因并引入蜂毒素信號(hào)肽基因序列，轉(zhuǎn)入pMD-18T載 體，獲得包含豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因的重組載體 首先設(shè)計(jì)弓 I 物 Spe-ATG (5 ‘ -cgactagtatgacgtatccaaggaggcgt-3 ‘)禾口弓 I 物 H ind-TAA (5 ‘ -gcaagctttattcattaagggttaagttggg-3 ‘)，以保藏號(hào)為 CGMCC No. 2389 的 PCV2-SH株的基因組DNA為模板，擴(kuò)增PCV20RF2基因，并將擴(kuò)增的0RF2基因克隆入pMD_18T 載體中，獲得重組載體PT-0RF2。PCR產(chǎn)物大小約730bp，結(jié)果見(jiàn)附圖1。其中，第1孔為DNA Marker2000 ；第2孔為PCV2 0RF2擴(kuò)增產(chǎn)物；第3孔為PCR陰性對(duì)照。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè) 序，由電泳及測(cè)序結(jié)果可知，重組載體PT-0RF2含序列表中的SEQ ID NOl序列。
設(shè)計(jì)四條引物，以pT-0RF2為模板，通過(guò)融合PCR方法在0RF2基因序列5、端引入 蜂毒素信號(hào)肽核苷酸序列和限制性酶Spe I和Hind III酶切位點(diǎn)。引物如下
HBM-Fl5‘ _tttcttacatctatgcgacgtatccaaggaggcgt_3‘HBM-Rl5‘ -ggcaacgttgactaagaatttcatactagtatcgtccac-3‘HBM-F25‘ -ttatggtcgtatacatttcttacatctatgcg-3‘HBM-R25‘ _aaacaagggcaacgttgactaagaatttc_3‘通過(guò)Spe I和Hind III雙酶切帶有蜂毒素信號(hào)肽核苷酸序列的0RF2序列，并將其 克隆入轉(zhuǎn)移載體pFastBaCTMl (Invitrogen)，構(gòu)成包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的載 體pFastBaCP2。用PCR擴(kuò)增并測(cè)序，由測(cè)序結(jié)果可知，重組轉(zhuǎn)移載體pFastBaCP2含蜂毒素 信號(hào)肽核苷酸序列，即含序列表中的SEQ ID N02序列。2、包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化入含有穿梭載體的大腸桿 菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的穿梭載體，再將該穿梭載體轉(zhuǎn) 染入昆蟲細(xì)胞中，獲得重組桿狀病毒vBac-P2 ；將pFastBacP2轉(zhuǎn)化含有病毒穿梭質(zhì)粒Bacmid的大腸桿菌DHlOBac (購(gòu)自 Invitrogen公司)，獲得重組質(zhì)粒Bacmid-P2 ；PCR篩選，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，制備陽(yáng)性重組質(zhì)粒 Bacmid-P2DNA0 采用Cellfectin Reagent 轉(zhuǎn)染 Sf9 細(xì)胞(購(gòu)自 Invitrogen 公司)，待細(xì)胞 出現(xiàn)病變后，進(jìn)行重組病毒噬斑純化和病毒擴(kuò)增，然后通過(guò)通用引物M13F和M13R進(jìn)行PCR 驗(yàn)證目的重組0RF2基因。純化獲得重組桿狀病毒，命名為vBac-P2，重組病毒構(gòu)建的過(guò)程和 方法參見(jiàn)圖5。擴(kuò)增重組桿狀病毒vBac-P2作為種毒，通過(guò)噬斑法進(jìn)行效價(jià)滴定后于4°C保 存?zhèn)溆谩?、重組桿狀病毒vBac-P2感染昆蟲細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)將vBac-P2重組桿狀病毒感染懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞High Five (購(gòu)自Invitrogen 公司)。在含有200 350ml的EXPRESS FIVE SFM培養(yǎng)基的500ml轉(zhuǎn)瓶中無(wú)菌懸浮培養(yǎng) High Five 細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為0.3 0.6X IO6個(gè)細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到IXlO6 個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)，用重組病毒vBac-P2接種各轉(zhuǎn)瓶，接種到各轉(zhuǎn)瓶中的重組桿狀病毒具有不 同的感染復(fù)數(shù)(M. 0. I.)，分別是0. 01,0. 1、1。接種重組桿狀病毒后，以26 28°C，轉(zhuǎn)速為 lOOrpm，培養(yǎng)4天。4、重組桿狀病毒的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2 蛋白，收獲和純化豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白；①豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的表達(dá)在以步驟(3)中所述培養(yǎng)條件培養(yǎng)的High Five 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種后每12小 時(shí)對(duì)各瓶取樣，即48h、60h、72h、84h和96h取樣。各樣品以10，OOOg離心20分鐘，分離上 清液和沉淀。上清液通過(guò)1 μ m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后進(jìn)行SDS-PAGE電泳和紫外分光光 度計(jì)測(cè)定上清液中的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白及其含量。結(jié)果見(jiàn)附圖4，其中，橫坐標(biāo)表示重組病毒以不同的M.O. I.感染High Five 細(xì)胞 后不同的取樣時(shí)間點(diǎn)，縱坐標(biāo)為不同的取樣時(shí)間點(diǎn)樣品中重組蛋白的含量。由結(jié)果可知，在 重組病毒感染細(xì)胞72小時(shí)后上清中重組蛋白含量達(dá)到60微克/毫升以上。結(jié)果說(shuō)明重組 病毒感染細(xì)胞后，培養(yǎng)至少72h后回收培養(yǎng)上清，能夠顯著提高豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2 蛋白的產(chǎn)率。②豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白的鑒定采用Western blotting鑒定表達(dá)的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白。分別收集重組桿狀病毒感染的High Five 細(xì)胞，經(jīng)3，000r/min離心IOmin取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電 泳，結(jié)果見(jiàn)圖2 ；其中，第1孔為蛋白質(zhì)Marker ；第2孔為細(xì)胞陰性對(duì)照；第3孔為vBac-P2 感染48h后收獲的培養(yǎng)上清；第4孔為vBac-P2感染72h后收獲的培養(yǎng)上清。SDS-PAGE蛋 白質(zhì)電泳凝膠觀察到大小約為28. 2KDa的特異性條帶，即為重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋 白。將目的蛋白進(jìn)行測(cè)序，由電泳及測(cè)序結(jié)果可知，重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白序列含 序列表中的SEQ ID N03序列。SDS-PAGE電泳后，再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉液封 閉后，加上針對(duì)豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的單抗，再加上帶有標(biāo)記物的二抗。然后判定重 組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白的表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)附圖3，其中，第1孔為藍(lán)色預(yù)染低分子量蛋 白質(zhì)Marker ；第2孔為vBac-P2表達(dá)蛋白；第3孔為陰性對(duì)照。用Westernblotting分析 表達(dá)的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白。用豬的抗豬圓環(huán)病毒2型高免血清對(duì)重組豬圓環(huán) 病毒2型0RF2蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在硝酸纖維素膜上僅觀察到一條分子量大小與預(yù) 期大小一致的特異性條帶，說(shuō)明表達(dá)的重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白能夠與豬圓環(huán)病毒2 型抗體特異性結(jié)合，說(shuō)明重組豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白具有特異的豬圓環(huán)病毒2型免疫原 性。③收獲和純化豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白將培養(yǎng)物經(jīng)IOOOOg離心20分鐘，分離沉淀和上清液，上清液通過(guò)1 μ m的濾膜進(jìn) 行過(guò)濾，然后通過(guò)超濾濃縮純化，超濾膜孔徑為10000 (切割分子量)，純化后的樣品溶液經(jīng) 7mM 二乙烯亞胺(BEI)滅活重組桿狀病毒載體，36 48小時(shí)，加入等量的硫代硫酸鈉中和。 然后通過(guò)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。5、利用豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白，輔以佐劑，制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫
田ο準(zhǔn)備不同濃度的抗原稀釋物，并與油佐劑ISA206佐劑混合乳化。ISA206佐劑 經(jīng)12rC、60min高壓濕熱滅菌，按照抗原/佐劑體積比例46 54混合。使用德國(guó)產(chǎn)IKA 2000/4型乳化機(jī)，先將佐劑加入乳化機(jī)料筒內(nèi)，在攪拌狀態(tài)下(lOOr/min)緩緩將抗原水相 滴入佐劑中，滴完后，繼續(xù)攪拌5min。用乳化機(jī)5000r/min，循環(huán)乳化4min，得到亞單位疫苗成品。優(yōu)選地，疫苗成品重組0RF2蛋白的的含量為0. 2微克/頭份、1微克/頭份、2微 克/頭份、4微克/頭份、8微克/頭份、16微克/頭份和40微克/頭份。制備好的疫苗經(jīng) 粘度檢測(cè)、離心檢測(cè)、劑型檢測(cè)、穩(wěn)定性檢測(cè)后，各項(xiàng)指標(biāo)均符合規(guī)定。疫苗保存于4°C。每 頭份為2ml。本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白抗原還可以與其他的油性佐劑、水性佐劑或其他佐劑混合 使用，如本領(lǐng)域常見(jiàn)的白油佐劑、鋁膠佐劑、弗氏佐劑等等。實(shí)施例2 PCV2亞單位疫苗的效力檢測(cè)對(duì)洛陽(yáng)某豬場(chǎng)的豬進(jìn)行主要病原和相關(guān)抗體檢測(cè)，選用10-14日齡的豬圓環(huán)病 毒、豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬細(xì)小病毒等主要病原陰性豬。將符合條件的仔豬隨機(jī)分為9組，每組10頭，7組給予包含不同量重組0RF2蛋白 的亞單位疫苗(分別包含重組0RF2蛋白0. 2微克/頭份、1微克/頭份、2微克/頭份、4微 克/頭份、8微克/頭份、16微克/頭份和40微克/頭份)，1組做為攻毒對(duì)照，另1組做為陰性對(duì)照。其中，第1組給予包含重組0RF2蛋白0. 2微克/頭份的亞單位疫苗；第2組給 予包含重組0RF2蛋白1微克/頭份的亞單位疫苗；第3組給予包含重組0RF2蛋白2微克/ 頭份的亞單位疫苗；第4組給予包含重組0RF2蛋白4微克/頭份的亞單位疫苗；第5組給 予包含重組0RF2蛋白8微克/頭份的亞單位疫苗；第6組給予包含重組0RF2蛋白16微克 /頭份的亞單位疫苗；第7組給予包含重組0RF2蛋白40微克/頭份的亞單位疫苗；第8組 做為攻毒對(duì)照組，不給予任何包含重組0RF2蛋白的亞單位疫苗。第1 7組進(jìn)行兩次免疫， 間隔2周。在第二次免疫后21天對(duì)第1 8組進(jìn)行病毒攻擊，毒株選用PCV2-SH株(CGMCC No. 2389) (106 0TCID50/ml)，每頭豬滴鼻1ml，頸部肌肉注射2ml，隔離飼養(yǎng)。攻毒后第4、7天 分別在兩腋下和兩臀部注射弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白(4mg/ml，0.5ml)和腹 腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基10ml。在第11天和19天腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基10ml。攻毒后 25天進(jìn)行剖殺。第9組做為陰性對(duì)照組，單獨(dú)隔離飼養(yǎng)，在第1 8組攻毒后25天進(jìn)行剖 殺。所有豬只在第1次免疫前、攻毒前和剖殺前收集血樣。在第1次免疫前、攻毒前和剖殺前對(duì)所有豬只收集血樣，通過(guò)ELISA法進(jìn)行PCV2 血清抗體分析。攻毒后25天剖檢全部豬只，觀察各組織器官病理變化、拍照記錄。符合以 下3項(xiàng)中的任何2項(xiàng)，即可判為發(fā)病。A.臨床癥狀仔豬體溫升高(彡400C )，應(yīng)至少持續(xù) 3日，出現(xiàn)明顯食欲減退、精神沉郁、被毛粗亂、消瘦和生長(zhǎng)速度減緩；B.病理變化腹股溝 和氣管淋巴結(jié)水腫、肺臟輕度水腫，腎臟發(fā)黃或有點(diǎn)狀壞死。組織學(xué)病變?yōu)榱馨徒Y(jié)有明顯淋 巴細(xì)胞侵入，或有多核巨細(xì)胞；C.病毒檢測(cè)用PCR檢測(cè)淋巴結(jié)組織，檢測(cè)到PCV2。結(jié)果本實(shí)施例結(jié)果如下。表1是各組試驗(yàn)豬在第1次在第1次免疫前、攻毒前和剖殺前對(duì)所有豬只收集的 血樣進(jìn)行ELISA檢測(cè)血清中PCV2特異性抗體的結(jié)果。表1.各組試驗(yàn)豬PCV2血清抗體分析結(jié)果
組別PCV2抗體陽(yáng)性率(％)第1次免疫前攻毒前剖殺前第1組090100第2組0100100第3組0100100第4組0100100第5組0100100第6組0100100第7組0100100第8組00100第9組000
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表2.是各組試驗(yàn)動(dòng)物在剖殺前觀察臨床表現(xiàn)和剖殺后進(jìn)行病理變化檢測(cè)和淋巴 結(jié)PCR檢測(cè)病毒的試驗(yàn)結(jié)果。表2.各組試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病判定結(jié)果 結(jié)果分析根據(jù)試驗(yàn)動(dòng)物臨床癥狀、剖檢病理變化檢測(cè)和病原的PCR檢測(cè)判斷結(jié) 果，其中第8組攻毒對(duì)照組仔豬全部發(fā)病。第1組試驗(yàn)動(dòng)物有5只發(fā)病，亞單位疫苗保護(hù)率 為50%，第2組試驗(yàn)動(dòng)物有1只發(fā)病，保護(hù)率為90%，第3 7組試驗(yàn)動(dòng)物均沒(méi)有發(fā)病，保 護(hù)率均為100%。第2組亞單位疫苗效果明顯好于第1組，臨床上認(rèn)為當(dāng)大約80%或更多 的動(dòng)物被保護(hù)時(shí)，畜群即獲得了保護(hù)，可以推斷必須包含PCV2重組0RF2蛋白1微克/頭份 或者更多蛋白的亞單位疫苗可以給動(dòng)物提供保護(hù)，以能有效的保護(hù)畜群對(duì)抗PCV2。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1).克隆豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因并引入信號(hào)肽基因序列，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移載體，獲得包含豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2基因的轉(zhuǎn)移載體；(2).包含豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2基因的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化入含有穿梭載體的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得包含豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2基因的穿梭載體，再將該穿梭載體轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞中，獲得重組桿狀病毒；(3).重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)；(4).由重組桿狀病毒的豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2基因表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2蛋白，收獲和純化豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2蛋白；(5).利用豬圓環(huán)病毒2型重組ORF2蛋白，輔以佐劑，經(jīng)乳化，制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中豬圓環(huán)病毒2型0RF2 基因序列包含序列表中SEQ ID NOl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中信號(hào)肽基因序列包括蜂 毒素信號(hào)肽核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的蜂毒素信號(hào)肽核苷酸序列包含序 列表中SEQ ID N02。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中所述重組豬圓環(huán)病毒2 型0RF2基因的表達(dá)受多角體啟動(dòng)子的控制。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中所述的重組豬圓環(huán)病毒2 型0RF2蛋白序列包含序列表中的SEQ IDN03。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中所述的重組豬圓環(huán)病毒2 型0RF2蛋白是下面任意一種多肽i)含有序列表中SEQ ID N03序列的多肽； )與i)所述多肽至少80%同源的多肽；iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中所述的佐劑為水性佐劑或 油性佐劑。
9.由權(quán)利要求1 7任意一項(xiàng)方法制備的豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白。
10.由權(quán)利要求1 8任意一項(xiàng)方法制備的豬圓環(huán)病毒2型0RF2蛋白亞單位疫苗。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗，其特征在于，所述疫苗包含至 少1微克/頭份的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白。
全文摘要
本發(fā)明的主要目的在于提供一種PCV2亞單位疫苗及其制備方法，具體地說(shuō)是，利用桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中大量表達(dá)重組ORF2蛋白，研制出具有良好免疫效果的亞單位疫苗。采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac Baculovirus ExpressionSystem)對(duì)豬圓環(huán)病毒2型的ORF2基因進(jìn)行全基因擴(kuò)增，并在5′端引入蜂毒素信號(hào)肽核苷酸序列，構(gòu)建含有蜂毒素信號(hào)肽核苷酸序列和PCV2ORF2基因序列的開(kāi)放閱讀框的重組桿狀病毒，感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)出具有高效良好PCV2抗原性的重組ORF2蛋白，制備成含有PCV2重組ORF2蛋白的亞單位疫苗。通過(guò)仔豬攻毒試驗(yàn)，驗(yàn)證該亞單位疫苗具有良好的免疫保護(hù)作用。
文檔編號(hào)C12N15/34GK101884787SQ20101023663
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進(jìn)忠, 張?jiān)S科 申請(qǐng)人:洛陽(yáng)普萊柯生物工程有限公司