專利名稱：：一種利用畢赤酵母高效表達(dá)dna聚合酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)，特別是一種利用畢赤酵母高效表達(dá)DNA聚合酶的方法，是DNA聚合酶表達(dá)、生產(chǎn)的一種新思想、新途徑、新方法。
背景技術(shù)：
：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是現(xiàn)代分子生物學(xué)最重要的基本研究手段之一。此項(xiàng)技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的領(lǐng)域中。DNA聚合酶作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的重要工具之一，在PCR過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。直到1988年，Rand11KSaiki等(SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfS,etal.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science,1988,239487-491)從Thermusaquatics中分離純化獲得了TaqDNA聚合酶，并成功地將其應(yīng)用于PCR技術(shù)，大大簡(jiǎn)化了PCR流程，使PCR過(guò)程實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)連續(xù)循環(huán)，應(yīng)用領(lǐng)域逐漸拓寬。因此，如何進(jìn)一步提高DNA聚合酶的產(chǎn)量及各項(xiàng)酶學(xué)性能，并利用它實(shí)現(xiàn)方便、快捷、高效的PCR，以滿足不同科學(xué)研究及實(shí)際應(yīng)用的需要，已經(jīng)成為目前廣大分子生物學(xué)學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。由于大部分用于PCR的DNA聚合酶來(lái)源于古細(xì)菌，因此，人們傾向于用原核表達(dá)系統(tǒng)，而不是真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)DNA聚合酶。因此，目前國(guó)內(nèi)外眾多研究將編碼極端酶的基因在異源普通宿主菌(如大腸桿菌)中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)該方法表達(dá)的蛋白質(zhì)大多數(shù)都能維持原來(lái)的熱穩(wěn)定性，它們通常在低溫下折疊，并不被宿主的蛋白酶水解，因此可以通過(guò)熱變性的方法除去宿主蛋白而進(jìn)行純化，酶產(chǎn)量亦有所提高，是相對(duì)經(jīng)濟(jì)的方法，從一定程度上促進(jìn)了PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，并節(jié)約了PCR成本，但是在這個(gè)過(guò)程中仍然面臨著純化困難，成本較高等各禾中各樣的問(wèn)題(FrancoisBaneyxRecombinantproteinexpressioninEscherichiacoliCurrentOpinioninBiotechnologyVolume10,Issue5,IOctober1999,Pages411-421)。例如，如果培養(yǎng)溫度過(guò)高，生長(zhǎng)速度過(guò)快或生長(zhǎng)過(guò)度，外源基因表達(dá)的目的蛋白大多數(shù)容易形成包涵體，這就需要將其轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白，這個(gè)步驟不但繁瑣而且會(huì)降低酶活性。人們不斷嘗試對(duì)接種量、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)前細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間和誘導(dǎo)后細(xì)胞密度等因素做進(jìn)一步的優(yōu)化，以期待提高目的蛋白的表達(dá)量和比活性，甚至是某些酶學(xué)性能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種利用畢赤酵母高效表達(dá)DNA聚合酶的方法，提供了除大腸桿菌表達(dá)DNA聚合酶以外的新方法。具體做法如下1)設(shè)計(jì)一對(duì)5’端引入GTCA，3’端引入GGCCA堿基的引物，通過(guò)PCR的方法，將擴(kuò)增下的產(chǎn)物，在dTTP的保護(hù)下經(jīng)T4DNA聚合酶12°C處理20min后得到帶有CopI和NotI粘性末端的DNA聚合酶基因，與經(jīng)過(guò)CopI和NotI依次酶切的畢赤酵母分泌型表達(dá)載體PHBM905A連接，獲得重組的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒；2)將畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒用SalI酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至PichiapastorisGS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布組氨酸缺陷培養(yǎng)基MD(1.34%YNB,2%葡萄糖，1%(NH4)2S04，4XIO-5Biotin,1.5%Agar)平板，25°C_30°C培養(yǎng)2-4天，獲得重組轉(zhuǎn)化子；3)提取轉(zhuǎn)化子基因組，通過(guò)PCR的方法鑒定已經(jīng)正確插入DNA聚合酶基因的陽(yáng)性克?。?)接種鑒定驗(yàn)證正確的重組轉(zhuǎn)化子于50mLBMGY(2%Tryptone，1%Yeastextract，0.34%YNB,1%(NH4)2SO4,1OOmmo1/L磷酸鉀緩沖液pH6·0，甘油)培養(yǎng)基中，250C-300C150-250r/min培養(yǎng)40_50h，至0D_為6-10，于室溫離心3000_6000r/min，5min,收集菌體；將菌體轉(zhuǎn)移至25mLBMMY(2%Tryptone，1%Yeastextract，0.34%YNB,1%(NH4)2S04，100mmol/L磷酸鉀緩沖液pH6.0)培養(yǎng)基中，25°C_30°C，150_250r/min培養(yǎng)，每隔24h補(bǔ)加一次甲醇(加量為培養(yǎng)基體積的0.5%)；表達(dá)時(shí)間24h-96h5)取表達(dá)上清液分析表達(dá)水平，其中表達(dá)時(shí)間為72h時(shí)表達(dá)水平為最佳，所得上清液即為表達(dá)粗酶液。本發(fā)明表達(dá)的DNA聚合酶基因，包括DNA依賴性DNA聚合酶基因和RNA依賴性DNA聚合酶基因。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)DNA聚合酶基因表達(dá)的載體是所有畢赤酵母表達(dá)載體，包括胞內(nèi)表達(dá)載體和胞外表達(dá)載體。本發(fā)明與現(xiàn)有的通過(guò)大腸桿菌表達(dá)聚合酶的方法相比具有的優(yōu)勢(shì)一、本發(fā)明提出的DNA聚合酶表達(dá)方法，操作簡(jiǎn)單、成本低廉。相比大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)而言，畢赤酵母菌營(yíng)養(yǎng)需求水平低、生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)基價(jià)格低廉，進(jìn)一步節(jié)約了成本。二、本發(fā)明提出的DNA聚合酶表達(dá)方法，純化步驟簡(jiǎn)單。畢赤酵母表達(dá)載體的啟動(dòng)子為醇氧化酶(AOXl)基因啟動(dòng)子，能夠?qū)ν庠吹鞍椎谋磉_(dá)進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控，本發(fā)明通過(guò)該系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白可以分泌到胞外，內(nèi)源蛋白分泌量極少，避免了支原體污染，利于外源蛋白的分離與純化，而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白，背景高，分離純化耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，操作步驟繁瑣。三、本發(fā)明提出的DNA聚合酶表達(dá)方法，所表達(dá)的DNA聚合酶酶學(xué)性能表現(xiàn)更加優(yōu)異。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)比較，通過(guò)該方法表達(dá)的聚合酶PCR產(chǎn)量、熱穩(wěn)定性有明顯的提高，聚合酶的保真性有了小幅度提高。四、本發(fā)明提出的DNA聚合酶表達(dá)方法，便于進(jìn)行規(guī)?；?、工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)過(guò)多年的不斷發(fā)展與完善，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的高密度發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)發(fā)展的比較成熟，利于DNA聚合酶規(guī)?；a(chǎn)，極大程度上滿足不斷增長(zhǎng)的研究及應(yīng)用需求。圖1為本發(fā)明畢赤酵母重組表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程。首先，通過(guò)引物設(shè)計(jì)使用高保真酶擴(kuò)增目的基因片段后(①)，回收，然后在dTTP存在的條件下，用T4DNA聚合酶于12°C處理該片段20min(②)，生成粘性末端，同時(shí)將pHBM905A質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶CopI和NotI依次酶切，產(chǎn)生兩個(gè)帶有固定堿基的單鏈粘性末端(③)，瓊脂糖膠回收目的片段。最后，將雙酶切后的載體和T4DNA聚合酶處理后片段經(jīng)SolutionI連接酶16°C連接2h后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOii菌株，氨芐青霉素抗性LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒大小比對(duì)、PCR鑒定以及酶切鑒定獲得完整的重組質(zhì)粒。圖2為畢赤酵母表達(dá)RKOD酶SDS-PAGE檢測(cè)。泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記，泳道1為GS-905A空載體誘導(dǎo)后樣品，泳道2-5分別為酵母重組菌株GS-RKOD誘導(dǎo)24h、48h、72h、96h的樣品。圖3大腸桿菌表達(dá)RKOD酶與酵母表達(dá)RKOD酶的SDS-PAGE檢測(cè)對(duì)比。泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記，泳道1為酵母重組菌株GS-RKOD誘導(dǎo)72h樣品，泳道2為30a_RK0D誘導(dǎo)破菌后上清樣品，泳道3為30a-RK0D誘導(dǎo)后鎳珠純化后樣品。圖4為酵母RKOD酶DNAse活性分析。泳道Ml為λDNA-EcoT14marker,泳道M2為λDNA-HindIIImarker；泳道3為pET30a質(zhì)粒；泳道1、2、4分別為IOU的粗酶液與λDNA-EcoT14,λDNA-HindIII、SupercoiledpET30aDNA37°C孵育24小時(shí)后樣品。圖5為大腸桿菌表達(dá)RKOD酶與酵母表達(dá)RKOD酶的PCR擴(kuò)增效率分析。a)圖中，泳道M為AEcoT14DNAMarker，泳道1_4分別為大腸桿菌表達(dá)RKOD酶、酵母表達(dá)RKOD酶、TaqDNA聚合酶和primerstarDNA聚合酶的擴(kuò)增樣品(目的片段大小1.8kb)；b)圖中，泳道M為λEcoT14DNAMarker,泳道1_2為大腸桿菌表達(dá)RKOD酶的擴(kuò)增樣品，泳道3_5為酵母表達(dá)RKOD酶的擴(kuò)增樣品(目的片段大小2.5kb)。圖6為大腸桿菌表達(dá)RKOD酶與酵母表達(dá)RKOD酶的熱穩(wěn)定性對(duì)比研究。泳道M為λEcoT14DNAMarker,泳道1_3為大腸桿菌表達(dá)RKOD酶100°C熱處理Ih后三個(gè)片段的PCR產(chǎn)物，泳道4-6為畢赤酵母表達(dá)RKOD酶100°C熱處理Ih后三個(gè)片段的PCR產(chǎn)物，泳道7_9為畢赤酵母表達(dá)RKOD酶1處理100°C熱處理2h后三個(gè)片段的PCR產(chǎn)物，泳道10-12為大腸桿菌表達(dá)RKOD酶100°C熱處理2h后三個(gè)片段的PCR產(chǎn)物，泳道13-15為畢赤酵母表達(dá)RKOD酶處理100°C熱處理3h后三個(gè)片段的PCR產(chǎn)物，泳道16-18為大腸桿菌表達(dá)RKOD酶100°C熱處理3h后三個(gè)片段的PCR產(chǎn)物。具體實(shí)施例方式下面以實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1利用本發(fā)明方法在酵母中表達(dá)本實(shí)驗(yàn)室合成的來(lái)源于Thermococcuskodakarensis菌種的DNA聚合酶基因，以后統(tǒng)稱為RK0D。首先，將pHBM905A質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶CopI和NotI依次酶切，產(chǎn)生帶有兩個(gè)固定堿基單鏈粘性末端的載體，瓊脂糖膠回收該載體。其次，根據(jù)已知基因序列，采用GeneTool軟件設(shè)計(jì)RK0D_905aF:5‘GTCAATGATCCTCGACACTGACTACATAACCG3'和RK0D_905aR5'GGCCATATTTTTTCTGTTTTTCCAGCATCTGC3'兩條引物，使用primerstarDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到RKOD(2.5kb)基因片段，將該片段瓊脂糖膠回收后，在dTTP存在的條件下，用T4DNA聚合酶12°C處理20min，生成與PHBM905A載體相配對(duì)的粘性末端，回收片段。然后將載體和片段經(jīng)SolutionI酶16°C連接2個(gè)小時(shí)后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHlOβ感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒大小比對(duì)、PCR鑒定及酶切鑒定獲得重組質(zhì)粒(見(jiàn)圖1)。隨機(jī)挑選重組質(zhì)粒送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒分別命名為905A-RK0D。接著，將重組質(zhì)粒905A-RK0D用SalI酶切線性化，將回收后的酶切產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化至PichiapastorisGS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布組氨酸缺陷培養(yǎng)基MD平板，28°C培養(yǎng)3天，獲得重組轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)提取轉(zhuǎn)化子基因組，以其為模板，RK0D-905AF/RK0D-905AR為引物進(jìn)行PCR鑒定，故擴(kuò)增得到2.5kb產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子即為陽(yáng)性克隆，將驗(yàn)證正確的重組克隆命名為GS-RK0D。最后，將鑒定驗(yàn)證正確的重組轉(zhuǎn)化子GS-RKOD接種于50mLBMGY培養(yǎng)基中，28°C、200r/min培養(yǎng)48h，至OD6tltl為6_9，于室溫離心5000r/min，5min,收集菌體，隨后，將菌體轉(zhuǎn)移至25mLBMMY培養(yǎng)基中，28°C、200r/min培養(yǎng)，每隔24h補(bǔ)加一次甲醇(加量為培養(yǎng)基體積的0.5%)，GS-RKOD陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，分別取24h，48h，72h，96h表達(dá)上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析不同時(shí)段的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例2通過(guò)大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)本實(shí)驗(yàn)室合成的來(lái)源于Thermococcuskodakarensis菌種的DNA聚合酶基因(RK0D基因)，作為實(shí)施例1的對(duì)比，以驗(yàn)證通過(guò)酵母表達(dá)DNA聚合酶這種方法的優(yōu)越性。首先，根據(jù)已知基因序列，通過(guò)GENET00L軟件，設(shè)計(jì)引物(正向引物5'ATGATCCTCGACACTGACTACATAACCG3'；反向引物5，TTATTTTTTCTGTTTTTCCAGCATCTGC3’)擴(kuò)增RKOD基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有清晰條帶后，瓊脂糖膠回收該片段。然后將pET-30a質(zhì)粒經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoRV37°C酶切2小時(shí)，形成線性平末端載體。然后將載體和片段經(jīng)SolutionI酶16°C連接2個(gè)小時(shí)后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHlOβ感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒大小比對(duì)、PCR鑒定及酶切鑒定獲得重組質(zhì)粒。隨機(jī)挑選重組質(zhì)粒送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒分別命名為30a-RK0D。然后將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒30a_RK0D轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株，挑單菌落接種于卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12小時(shí)，轉(zhuǎn)接入IOOmL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基，37°C、200rpm培養(yǎng)至OD6tltl為0.5-0.6時(shí)，加入IMIPTG50μL，16°C、200rpm誘導(dǎo)12小時(shí)。然后于4°C、6000rpm離心收集菌體5min，加入5mLPBS，混勻，超聲波破菌，4°C、12000rpm離心2min取上清，鎳珠純化，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析表達(dá)水平(見(jiàn)圖3)。實(shí)施例1與實(shí)施例2的結(jié)果分析經(jīng)過(guò)對(duì)初酶液蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定，通過(guò)酵母分泌表達(dá)的RKOD酶最佳誘導(dǎo)時(shí)間為48h-72h，表達(dá)量在誘導(dǎo)至72h時(shí)可達(dá)到181mg/L，活性濃度為15U/mL，比活力為63.5U/mg；DNase活性分析表明，酵母初酶液DNase活性較低(見(jiàn)圖4)。通過(guò)對(duì)兩種分別在大腸桿菌和酵母里面表達(dá)的聚合酶的擴(kuò)增性能分析發(fā)現(xiàn)，酵母表達(dá)的聚合酶PCR產(chǎn)量與商品化的高保真聚合酶PCR的產(chǎn)量相當(dāng)(見(jiàn)圖5a)，但是明顯高于大腸桿菌表達(dá)聚合酶的PCR產(chǎn)量(見(jiàn)圖5b)，；SDS-PAGE檢測(cè)表明，與大腸桿菌表達(dá)的聚合酶相比，雜蛋白少，純度高(見(jiàn)圖3)；與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的聚合酶酶相比，酵母表達(dá)的聚合酶的熱穩(wěn)定性明顯提高(見(jiàn)圖6)；通過(guò)DNA聚合酶保真性分析表明，與大腸桿菌表達(dá)的聚合酶相比，酵母表達(dá)的聚合酶擴(kuò)增忠實(shí)性略微提高(大腸桿菌表達(dá)的聚合酶錯(cuò)配率約為1.38X10_6，酵母表達(dá)的聚合酶錯(cuò)賠率約為1.lX10"6,TaqDNA聚合酶錯(cuò)配率約為1X1(T5，primerstarDNA聚合酶錯(cuò)配率約為1X10-6)。本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DHlOβ購(gòu)置于Invitrogen公司，PichiapastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞和ρΗΒΜ905Α質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存，限制性內(nèi)切酶(CopI、EcoRV、NotI、SalI等)購(gòu)自Promega公司，primerstarDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、6T4DNA聚合酶、SolutionI酶、鎳珠均購(gòu)于TaKaRa公司，所有引物均由上海捷瑞生物公司合成。權(quán)利要求一種利用畢赤酵母高效表達(dá)DNA聚合酶的方法，其特征在于1)設(shè)計(jì)一對(duì)5’端引入GTCA，3’端引入GGCCA堿基的引物，通過(guò)PCR的方法，將擴(kuò)增下的產(chǎn)物，在dTTP的保護(hù)下經(jīng)T4DNA聚合酶12℃處理20min后得到帶有CopI和NotI粘性末端的DNA聚合酶基因，與經(jīng)過(guò)CopI和NotI依次酶切的畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pHBM905A連接，獲得重組的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒；2)將畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒用SalI酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至PichiapastorisGS115酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布組氨酸缺陷培養(yǎng)基MD平板，25℃-30℃培養(yǎng)2-4天，獲得重組轉(zhuǎn)化子；培養(yǎng)基MD組成為1.34％YNB，2％葡萄糖，1％(NH4)2SO4，4×10-5％Biotin，1.5％Agar；3)提取轉(zhuǎn)化子基因組，通過(guò)PCR的方法鑒定獲得已經(jīng)正確插入DNA聚合酶基因的陽(yáng)性克??；4)接種鑒定驗(yàn)證正確的重組轉(zhuǎn)化子于50mLBMGY培養(yǎng)基中，25℃-30℃150-250r/min培養(yǎng)40-50h，至OD600為6-10，于室溫離心3000-6000r/min，5min，收集菌體；將菌體轉(zhuǎn)移至25mLBMMY培養(yǎng)基中，25℃-30℃，150-250r/min培養(yǎng)，，每隔24h補(bǔ)加一次為培養(yǎng)基體積0.5％的甲醇，表達(dá)時(shí)間24h-96h；BMGY培養(yǎng)基為2％Tryptone，1％Yeastextract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸鉀緩沖液pH6.0，1％甘油；BMMY培養(yǎng)基為2％Tryptone，1％Yeastextract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸鉀緩沖液pH6.0；5)取表達(dá)上清液分析表達(dá)水平，其中表達(dá)時(shí)間為72h時(shí)表達(dá)水平為最佳。2.根據(jù)權(quán)利1要求所述的一種利用畢赤酵母高效表達(dá)DNA聚合酶的方法，其特征是表達(dá)DNA聚合酶基因，包括DNA依賴性DNA聚合酶基因和RNA依賴性DNA聚合酶基因。3.根據(jù)權(quán)利1要求所述的一種利用畢赤酵母高效表達(dá)DNA聚合酶的方法，其特征在于用于實(shí)現(xiàn)DNA聚合酶基因表達(dá)的載體是所有畢赤酵母表達(dá)載體，包括胞內(nèi)表達(dá)載體和胞外表達(dá)載體。全文摘要本發(fā)明提出了一種利用畢赤酵母高效表達(dá)DNA聚合酶的方法。表達(dá)步驟為1)將DNA聚合酶基因克隆至巴斯德畢赤酵母分泌型表達(dá)載體中，獲得畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒；2)將此重組表達(dá)質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母宿主菌GS115，經(jīng)MD平板和PCR鑒定篩選陽(yáng)性克?。?)挑取陽(yáng)性克隆利用0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明能夠用于表達(dá)DNA聚合酶基因。通過(guò)驗(yàn)證，與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，該方法能夠明顯提高DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性等性能，且能夠降低生產(chǎn)成本，縮短工藝流程，簡(jiǎn)化純化步驟。文檔編號(hào)C12N15/54GK101886087SQ201010229160公開(kāi)日2010年11月17日申請(qǐng)日期2010年7月13日優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日發(fā)明者余曉嵐,卞璐,趙慧,馬立新申請(qǐng)人:湖北大學(xué)