專利名稱：一種用昆蟲卵建立細(xì)胞系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，尤其涉及一種用昆蟲卵建立細(xì)胞系的方法。
背景技術(shù)：
自1965年第一株昆蟲細(xì)胞系成功建立后至今，近40年的時間內(nèi)，已經(jīng)建 立的昆蟲細(xì)胞系超過500種。昆蟲細(xì)胞系作為研究材料， 一直是生理學(xué)、發(fā)育 生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)等科學(xué)研究的重要工具，而且昆 蟲細(xì)胞作為桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的重要組成部分，表達(dá)了大量的具有重大經(jīng) 濟意義或科學(xué)意義的外源蛋白質(zhì)；同時作為生物反應(yīng)器，擴增昆蟲桿狀病毒用 作生物殺蟲劑，特別是擴增含有外源基因的重組桿狀病毒殺蟲劑，昆蟲細(xì)胞也 發(fā)揮了重要的作用。
大量的來源于鱗翅目昆蟲商品化的細(xì)胞系已得到人們廣泛的應(yīng)用。鱗翅目 的細(xì)胞系來源于很多組織，包括卵巢、胚胎、血細(xì)胞、脂肪體等。對于每一株 細(xì)胞系，無論是來自同一種昆蟲甚至同一個體，同一器官組織，在細(xì)胞系的建 立和細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，都會出現(xiàn)不同程度的變異，其細(xì)胞生物學(xué)特性，對特 定桿狀病毒的感受性都有可能不同。因而科學(xué)家們根據(jù)研究的需要或某些商業(yè) 目的，會嘗試從不同種昆蟲，同一昆蟲不同器官組織中，建立和篩選各種類型 的細(xì)胞系，以滿足不同的需求。
傳統(tǒng)的昆蟲細(xì)胞系的建立方法，帶有很大的隨機性和不確定性。多將相應(yīng) 的昆蟲器官或組織剪碎，或用胰蛋白酶把昆蟲組織消化，釋放出單個或成團的 細(xì)胞，放入特定的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并定時更換培養(yǎng)液。昆蟲胚胎細(xì)胞系的 建立方法，多是將多個昆蟲卵粒用勻衆(zhòng)器研碎過濾后培養(yǎng)，對胚胎細(xì)胞傷害很 大。因此，細(xì)胞系建立成功與否隨機性很強，有很大的不確定性，多數(shù)情況下以失敗告終，而且這個過程很長， 一般一個細(xì)胞系建立成功需要1.5-2年甚至 更長時間。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用昆蟲卵建立細(xì)胞系的方法，其能夠快速、有效、 可重復(fù)地建立昆蟲細(xì)胞系。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下方法-
一種用昆蟲卵建立細(xì)胞系的方法，方法步驟如下
1) 將產(chǎn)下90—100小吋的昆蟲卵受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸 泡5—10分鐘后用無菌水清洗，再將卵粒用乙醇溶液消毒后用生理鹽水 Ringer' s清洗；
2) 將上述步驟處理后的卵粒倒入昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，逐 一 輕擠壓卵粒釋放出胚
胎；
3) 將歩驟2)得到的胚胎剪碎成組織塊，轉(zhuǎn)入密閉培養(yǎng)瓶中，放入25 28。C無光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 30小時；
4) 加入細(xì)胞培養(yǎng)液，使胚胎的組織塊完全或超半部分浸沒在該培養(yǎng)液中， 在與步驟3)同樣條件下培養(yǎng)；
5) 每7—15天更換培養(yǎng)液，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細(xì)胞充滿 了整個培養(yǎng)瓶；
6) 從培養(yǎng)瓶中吸出半量的細(xì)胞培養(yǎng)液，其中含有新增殖出的單個細(xì)胞， 放入新培養(yǎng)瓶中，并加入等量的新細(xì)胞培養(yǎng)液；而原培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量 同樣多新的細(xì)胞培養(yǎng)液；將兩個培養(yǎng)瓶再放回培養(yǎng)箱中與歩驟3)同樣條件下培 養(yǎng)；得到昆蟲卵胚胎第一代傳代細(xì)胞，細(xì)胞系建立成功；
整個過程都是在無菌條件下進行的。
所述的昆蟲卵尤指鱗翅目昆蟲卵，如可以是楊扇舟蛾卵或美國白蛾卵、
春尺蠖卵。
本發(fā)明所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液是常規(guī)采用的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細(xì)胞培養(yǎng)液pH在6. 2-6.6之間。昆蟲細(xì)胞培 養(yǎng)液可以是各種商品化的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)瓶如1M-FH， Grace' s， TC_100， IPL-41， ExKMl 405等等。
本發(fā)明所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液中青霉素與鏈霉素的含量各為50 100 U/mL; 動物血清含量為細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為5% 15%。
本發(fā)明的積極效果是本發(fā)明方法可以在短期內(nèi)建立需要研究或生產(chǎn)用的 昆蟲細(xì)胞系，能夠提供大量的昆蟲細(xì)胞種類的來源，并供使用者篩選，使建立 細(xì)胞系成為實驗室的常規(guī)實驗方法成為可能。
具體實施例方式
本發(fā)明用昆蟲卵建立細(xì)胞系的方法具體步驟如下
(1) 將產(chǎn)下約四天(90— 100小時)的受精卵片放入10ral試管中，然后 用10%次氯酸鈉溶液浸沒約2-5分鐘并輕振蕩，倒掉次氯酸鈉溶液并用無菌水 清洗卵粒，倒掉無菌水后用75%乙醇溶液消毒卵粒10-20分鐘，期間不斷輕輕 振蕩，倒掉乙醇后用Ringer' s清洗卵粒; (2) 將卵粒倒入或用移液器移入裝有1-2nd的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，在解 剖鏡下用彎頭眼科鑷逐一輕擠卵粒釋放出胚胎；
(3) 用移液器輕輕轉(zhuǎn)移胚胎入另一裝有0. 5mL昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿 中，用眼科剪將胚胎剪碎，長度約l-2mm。用移液器將胚胎組織塊轉(zhuǎn)入含有0. 5mL 細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗過的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27'C無光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)24小時；
(4) 加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養(yǎng)液中， 在與步驟(3)同樣條件下培養(yǎng)；
(5) 每7—15天吸出半量的培養(yǎng)液，并同時換入半量新的細(xì)胞培養(yǎng)液， 直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細(xì)胞充滿了整個培養(yǎng)瓶；
(6) 把含有新增殖出的單個細(xì)胞，連同全部的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出放入新培 養(yǎng)瓶中，并加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液，而原含有組織塊的培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量同樣多新的細(xì)胞培養(yǎng)液，兩個培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞開始傳代，細(xì)胞 系建立成功；
整個過程都是在無菌條件下進行的。
本發(fā)明方法所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液是昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素和胎 牛血清的混合物，配成的細(xì)胞培養(yǎng)液pH在6.2-6. 6之間。其中所述的昆蟲細(xì) 胞培養(yǎng)液選自商品化的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液TNM-FH， Grace， s， TC-100， IPL-41， 或Ex-Cell 405中的任何一種，優(yōu)選TNM-FH;青霉素含量為50— 100U/mL，優(yōu) 選100U/mL;鏈霉素含量為50— 100U/mL，優(yōu)選100U/mL;胎牛血清含量為細(xì)胞 培養(yǎng)液的5 — 20 '。(體積比)，優(yōu)選10%。
以下可以通過實驗來說明優(yōu)選方案的確立
① 選取TNM-FH， Grace' s， TC-100， IPL-41, Ex-Cell 405五種細(xì)胞培 養(yǎng)液進行楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞原代培養(yǎng)，每種培養(yǎng)液培養(yǎng)三瓶，用TNM-FH培養(yǎng) 的三瓶比用其他幾種培養(yǎng)液較快游離出細(xì)胞，并且成功建立成系。其他幾種培 養(yǎng)液在最初三個月有生長，但沒有成功建立成系。
② 加5%胎牛血清時組織中細(xì)胞游離出來較慢(一個月左右)；加10%胎牛 血清時組織中細(xì)胞游離出來較快(一周左右)，而且較快建成細(xì)胞系。加15% 胎牛血清時培養(yǎng)液容易結(jié)晶，不利細(xì)胞生長。
相對于傳統(tǒng)的細(xì)胞系建立方法，本發(fā)明方法的細(xì)胞系建立過程由通常的耗 時1.5-2年縮減到1-3個月，其優(yōu)勢非常明顯，而且重復(fù)性很強，用同樣方法 建立同樣昆蟲組織的細(xì)胞系，在預(yù)定的時間內(nèi)可以使細(xì)胞傳代，因而大大提高 了昆蟲細(xì)胞系建立的效率。第一次傳代以后，根據(jù)細(xì)胞生長增殖的情況，用傳 統(tǒng)培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞系的方法對細(xì)胞進行分瓶傳代處理。根據(jù)不同細(xì)胞系的特性， 細(xì)胞系的生長將在第一次傳代l-3個月后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。此時可以定期傳代， 并用傳統(tǒng)細(xì)胞凍存的方法對一定代次的部分細(xì)胞進行凍存處理，保存細(xì)胞的種 資，其它細(xì)胞用于常規(guī)的細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定，并進行相應(yīng)的科學(xué)實驗和生產(chǎn) 應(yīng)用。下面以具體實施例詳細(xì)說明
實施例l:楊扇舟蛾細(xì)胞系的實現(xiàn)
在無菌操作臺內(nèi)(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經(jīng)過滅菌或 消毒處理)將產(chǎn)下約四天的楊扇舟蛾(Gosfera s/ sc/ orfs Fabricius)受精 卵片放入10ml試管中，然后用10%次氯酸鈉溶液浸沒約2-5分鐘并輕振蕩， 倒掉次氯酸鈉溶液并用無菌水清洗卵粒，倒掉無菌水后用75。/。乙醇溶液消毒卵 粒10-20分鐘，期間不斷輕輕振蕩，倒掉乙醇后用Ringer' s清洗卵粒；將卵 粒倒入或用移液器移入裝有1-2ml的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中(以T畫-FH為主，含 100U/mL的青霉素，100U/mL的鏈霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH=6. 3)，在 解剖鏡下用彎頭眼科鑷逐一輕擠卵粒釋放出胚胎；用移液器輕輕轉(zhuǎn)移胚胎入另 一裝有0. 5mL昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將胚胎剪碎，長度約 1-2mm。用移液器將胚胎組織塊轉(zhuǎn)入含有0. 5mL細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗過的25cn^細(xì)胞 培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27卩無光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；加入適 量的細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養(yǎng)液中，放入同樣條件下 培養(yǎng)。
該方法成功建立細(xì)胞系的關(guān)鍵是選取產(chǎn)下四天左右的受精卵；擠出的 胚胎要剪成卜2mm;瓶中裝適量培養(yǎng)液，使組織塊緊貼在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，勿使 組織塊懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)液中。以后每7-10天左右吸出半量的培養(yǎng)液，并同時 換入半量的新培養(yǎng)液。在此操作第7-10天后可以觀察到組織塊周圍游離出大 量單個的細(xì)胞，并逐漸向外圍擴展。第20天后見到細(xì)胞不斷增殖并充滿整個 培養(yǎng)瓶，把含有新增殖出的細(xì)胞的培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，并加入等量 (l-2mL)新的細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞系建立初步成功。在細(xì)胞開始傳代的第7天 后開始第二次分瓶傳代，以后傳代時間逐漸縮短，傳到第5代時，細(xì)胞生長開 始穩(wěn)定，最終該細(xì)胞系被命名為Clan I 。并于2008年7月11日保藏在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 2579。實施例2:美國白蛾細(xì)胞系的實現(xiàn)
在無菌操作臺內(nèi)(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經(jīng)過滅菌或 消毒處理)將產(chǎn)下約四天的美國白蛾(份/ 力朋m'a Drury)受精卵片放
入10ml試管中，然后用10%次氯酸鈉溶液浸沒約2-5分鐘并輕振蕩，倒掉次 氯酸鈉溶液并用無菌水清洗卵粒，倒掉無菌水后用75%乙醇溶液消毒卵粒 10-20分鐘，期間不斷輕輕振蕩，倒掉乙醇后用Ringer， s清洗卵粒將卵粒 倒入或用移液器移入裝有1-2ml的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中(以TNM-FH為主，含 100'J/mL的青霉素，100U/mL的鏈霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH=6.5)，在 解剖鏡下用彎頭眼科鑷逐一輕擠卵粒釋放出胚胎；用移液器輕輕轉(zhuǎn)移胚胎入另 一裝有0. 5mL昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將胚胎剪碎，長度約 l-2mm。用移液器將胚胎組織塊轉(zhuǎn)入含有0. 5mL細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗過的25cn^細(xì)胞 培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27'C無光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；加入適 量的細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養(yǎng)液中，放入同樣條件下 培養(yǎng)。以后每7-10天左右吸出半量的培養(yǎng)液，并同時換入半量的新培養(yǎng)液。 在此操作第10天后可以觀察到組織塊周圍游離出大量單個的細(xì)胞，并逐漸向 外圍擴展。第25天后見到細(xì)胞不斷增殖并充滿整個培養(yǎng)瓶，把含有新增殖出 的細(xì)胞的培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，并加入等量(1-2mL)新的細(xì)胞培養(yǎng)液。 細(xì)胞系建立初步成功。在細(xì)胞開始傳代的第7天后開始第二次分瓶傳代，以后 傳代時間逐漸縮短，傳到第8代時，細(xì)胞生長開始穩(wěn)定，最終該細(xì)胞系被命名 為Hycu I 。
實施例3:春尺蠖細(xì)胞系的實現(xiàn)
在無菌操作臺內(nèi)(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經(jīng)過滅菌或 消毒處理)將產(chǎn)下約四天的春尺蠖c/y7ersn7AS Erschoff)受精 卵片放入10ml試管中，然后用10%次氯酸鈉溶液浸沒約2-5分鐘并輕振蕩， 倒掉次氯酸鈉溶液并用無菌水清洗卵粒，倒掉無菌水后用75%乙醇溶液消毒卵 粒10-20分鐘，期間不斷輕輕振蕩，倒掉乙醇后用Ringer' s清洗卵粒；將卵粒倒入或用移液器移入裝有1-2ml的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中(以T畫-FH為主，含 100U/mL的青霉素，100U/mL的鏈霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH=6. 5)，在 解剖鏡下用彎頭眼科鑷逐一輕擠卵粒釋放出胚胎；用移液器輕輕轉(zhuǎn)移胚胎入另 一裝有0.5mL昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將胚胎剪碎，長度約 l-2mm。用移液器將胚胎組織塊轉(zhuǎn)入含有0. 5mL細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗過的250012細(xì)胞 培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27"C無光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；加入適 量的細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養(yǎng)液中，放入同樣條件下 培養(yǎng)。以后每7-10天左右吸出半量的培養(yǎng)液，并同時換入半量的新培養(yǎng)液。 在此操作第15天后可以觀察到組織塊周圍游離出大量單個的細(xì)胞，并逐漸向 外圍擴展。第35天后見到細(xì)胞不斷增殖并充滿整個培養(yǎng)瓶，把含有新增殖出 的細(xì)胞的培養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，并加入等量(l-2mL)新的細(xì)胞培養(yǎng)液。 細(xì)胞系建立初步成功。在細(xì)胞開始傳代的第10天后開始第二次分瓶傳代，以 后傳代時間逐漸縮短，傳到第8代時，細(xì)胞生長開始穩(wěn)定，最終該細(xì)胞系被命 名為Apci I 。
上述各實施例可在不脫離本發(fā)明的范圍下加以若干變化，而非用以限制本 發(fā)明的申請專利范圍。
權(quán)利要求
1、一種用昆蟲卵建立細(xì)胞系的方法，方法步驟如下1)將產(chǎn)下90—100小時的昆蟲受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡5一10分鐘后用無菌水清洗，再將卵粒用乙醇溶液消毒后用生理鹽水Ringer’s清洗；2)將上述步驟處理后的卵粒倒入昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，逐一輕擠壓卵粒釋放出胚胎；3)將步驟2)得到的胚胎剪碎成組織塊，轉(zhuǎn)入密閉培養(yǎng)瓶中，放入25～28℃無光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～30小時；4)加入細(xì)胞培養(yǎng)液，使胚胎的組織塊完全或超半部分浸沒在該培養(yǎng)液中，在與步驟3)同樣條件下培養(yǎng)；5)每7—15天更換培養(yǎng)液，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細(xì)胞充滿了整個培養(yǎng)瓶；6)從培養(yǎng)瓶中吸出半量的細(xì)胞培養(yǎng)液，其中含有新增殖出的單個細(xì)胞，放入新培養(yǎng)瓶中，并加入等量的新細(xì)胞培養(yǎng)液；而原培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量同樣多新的細(xì)胞培養(yǎng)液；將兩個培養(yǎng)瓶再放回培養(yǎng)箱中與步驟3)同樣條件下培養(yǎng)；得到昆蟲胚胎第一代傳代細(xì)胞，細(xì)胞系建立成功；整個過程都是在無菌條件下進行的。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于繼續(xù)得到昆蟲卵胚胎后一 代傳代細(xì)胞的方法步驟如下周期重復(fù)權(quán)利要求2所述的步驟5)及步驟6)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中用5% — 20% 的次氯酸鈉溶液浸泡昆蟲受精卵片2-15分鐘，或用0.2°/。一1%的甲醛溶液浸泡 10-30分鐘，用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡及用乙醇溶液消毒期間均可不斷 輕輕振蕩。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于胚胎剪碎成卜2mm組織塊， 所述步驟5)中更換培養(yǎng)液的具體方法是每7—15天吸出半量的培養(yǎng)液，并同時換入半量新的細(xì)胞培養(yǎng)液。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的細(xì)胞培養(yǎng)液是昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細(xì)胞培養(yǎng)液pH 在6. 2-6. 6之間，其中細(xì)胞培養(yǎng)液中的青霉素與鏈霉素的總含量不超200U/mL; 胎牛血清的體積容量占細(xì)胞培養(yǎng)液體積容量的5 % — 15 % 。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于其中細(xì)胞培養(yǎng)液中的青霉 素與鏈霉素的含量分別為0 100U/mL;胎牛血清的體積容量占細(xì)胞培養(yǎng)液體積容量的5% 15%。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于其中所述的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液選自商品化的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液T麗-FH， Grace， s， TC-100， IPL-41，或Ex-Cell 405。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的昆蟲細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于對得 到的昆蟲卵胚胎后一代傳代細(xì)胞進行凍存處理，以保存細(xì)胞的種資供使用時再復(fù)蘇。
9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于其中所述 的昆蟲卵可以是楊扇舟蛾卵或美國白蛾卵、春尺蠖卵。
全文摘要
一種用昆蟲卵建立細(xì)胞系的方法，步驟如下1)將產(chǎn)下90～100小時的昆蟲受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡后再消毒；2)處理后的卵粒倒入昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，逐一擠壓卵粒釋放出胚胎；3)將胚胎剪碎成組織塊放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4)加入細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；5)定時更換培養(yǎng)液，直至增殖的細(xì)胞充滿整培養(yǎng)瓶；6)吸出半量的細(xì)胞培養(yǎng)液，其中含有新增殖出的單個細(xì)胞，放入新培養(yǎng)瓶中并加入等量的新細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；7)周期重復(fù)步驟5)及6)，細(xì)胞開始傳代，細(xì)胞系建立成功；整過程在無菌下進行。所述的昆蟲卵可以是鱗翅目昆蟲卵；本發(fā)明方法由傳統(tǒng)耗時1.5-2年縮減到1-3個月，優(yōu)勢非常明顯，且重復(fù)性很強。
文檔編號C12N5/06GK101423817SQ200810118629
公開日2009年5月6日 申請日期2008年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月20日
發(fā)明者張永安, 曲良建, 溫發(fā)園, 王文歡, 王玉珠 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所