專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用精液蛋白基因檢測(cè)昆蟲(chóng)卵孵化率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用精液蛋白基因檢測(cè)昆蟲(chóng)卵孵化率的方法。
背景技術(shù)：
害蟲(chóng)生物防治在農(nóng)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著不可替代的重要作用。天敵昆蟲(chóng)的大量生產(chǎn)更是生物防治中最基礎(chǔ)也是最重要的環(huán)節(jié)。捕食性天敵昆蟲(chóng)躅蝽(Armachinensis)可以控制來(lái)自鱗翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、膜翅目等多種農(nóng)林害蟲(chóng)，尤其是它還可以控制重大外來(lái)入侵害蟲(chóng)馬鈴薯甲蟲(chóng)和美國(guó)白蛾，因此躅蝽是一種應(yīng)用前景很好的天敵昆蟲(chóng)商品。作為商品，大量減少生產(chǎn)成本是人們追求利潤(rùn)最大化的一個(gè)途徑。在天敵昆蟲(chóng)躅蝽生產(chǎn)中就可以應(yīng)用不同的食物來(lái)生產(chǎn)躅蝽，例如，不同的昆蟲(chóng)獵物、含昆蟲(chóng)成分的人工飼料和不含昆蟲(chóng)成分的人工飼料，進(jìn)而減少生產(chǎn)成本。但是應(yīng)用不同的食物生產(chǎn)出來(lái)的躅蝽的生物學(xué)特性參差不齊，有些釋放后能達(dá)到很好的控制害蟲(chóng)的作用，有的則在釋放后效果不顯著。由于不同食物飼喂的躅蝽在表型上很難區(qū)分，因此這些天敵昆蟲(chóng)在釋放前是很難評(píng)估它們的生物學(xué)特性的。躅蝽成蟲(chóng)的卵孵化率是評(píng)價(jià)天敵昆蟲(chóng)生物學(xué)特性的一個(gè)很重要的指標(biāo)。有較高卵孵化率的躅蝽種群繁殖快，倍增時(shí)間短，可以在短期內(nèi)迅速控制住害蟲(chóng)。這可以大大減少防治害蟲(chóng)的成本，增加利潤(rùn)率。相反，卵孵化率較低的躅蝽由于卵孵化少、繁殖慢，倍增時(shí)間延長(zhǎng)，因此控制住害蟲(chóng)的時(shí)間會(huì)相對(duì)滯后，這就大大增加了防治成本，減少了利潤(rùn)。目前，對(duì)于不同食物來(lái)源或不同商家的商品躅蝽卵孵化率的檢測(cè)方法仍舊是在產(chǎn)卵期或人為規(guī)定的時(shí)間內(nèi)測(cè)試其卵孵 化率的多少，這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢(qián)。因此需要一種快速檢測(cè)天敵昆蟲(chóng)商品生物學(xué)特性-卵孵化率的方法。昆蟲(chóng)體內(nèi)，精液蛋白(seminal fluid protein CSSFP066)產(chǎn)生于雄蟲(chóng)附腺中，它可以刺激精子的儲(chǔ)存、延遲精子的替代和競(jìng)爭(zhēng)、顯著地增加雄蟲(chóng)的適切性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)精液蛋白CSSFP066編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)用途。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)精液蛋白CSSFP066編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)在檢測(cè)昆蟲(chóng)卵孵化率中的應(yīng)用；所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述應(yīng)用中，所述昆蟲(chóng)為昆蟲(chóng)個(gè)體或昆蟲(chóng)種群；所述昆蟲(chóng)種群具體為取食不同物質(zhì)昆蟲(chóng)種群；所述取食不同物質(zhì)昆蟲(chóng)種群進(jìn)一步具體為取食人工飼料的昆蟲(chóng)種群或取食獵物的昆蟲(chóng)種群；所述精液蛋白CSSFP066編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-312位核苷酸。所述昆蟲(chóng)具體為躅蝽。上述人工飼料按照如下方法制備生豬肝60g、大豆粉10g、水100ml、雞蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VCO. 2g、氯化膽堿0. 4g、泛酸韓8mg、葉酸0. lmg、煙酰胺0. 2mg、慶大霉素
3.9mg ;具體飼喂方法見(jiàn)實(shí)施例2 ；上述獵物為昨蠶(Antheraea pernyi)蛹；具體飼喂方法見(jiàn)實(shí)施例2。上述應(yīng)用中，所述用于檢測(cè)精液蛋白CSSFP066編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)為如下I) -3)中任意一種I)引物對(duì)A :所述引物對(duì)由引物I和引物2組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4 ；2 )含有所述弓I物對(duì)A的RT-PCR試劑；3)含有所述引物對(duì)A或所述RT-PCR試劑的試劑盒。上述應(yīng)用中，所述R T-PCR試劑由水、RT-PCR擴(kuò)增緩沖液、鎂離子、dNTPs、所述的弓I物對(duì)A、熒光染料和Taq酶組成；所述引物對(duì)A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度具體為0. 2-1 U M，所述引物對(duì)A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為0. 25iiM ;所述試劑盒還包括內(nèi)參引物對(duì)B，所述內(nèi)參引物對(duì)B由引物3和引物4組成；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)昆蟲(chóng)卵孵化率的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用所述的引物對(duì)A或所述的RT-PCR試劑或所述的試劑盒對(duì)待測(cè)的昆蟲(chóng)A和B進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；若所述昆蟲(chóng)A的精液蛋白CSSFP066基因的表達(dá)量高于所述昆蟲(chóng)B，則所述昆蟲(chóng)A卵孵化率高于所述昆蟲(chóng)B。上述方法中，所述昆蟲(chóng)為昆蟲(chóng)個(gè)體或昆蟲(chóng)種群；所述RT-PCR擴(kuò)增的模板為昆蟲(chóng)的cDNA ；所述昆蟲(chóng)具體為躅蝽。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述昆蟲(chóng)A為取食獵物的昆蟲(chóng)種群；所述昆蟲(chóng)B為取食人工飼料的昆蟲(chóng)種群。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法可以通過(guò)檢測(cè)精液蛋白CSSFP066基因表達(dá)量來(lái)檢測(cè)不同種群的昆蟲(chóng)卵孵化率，特別是不同營(yíng)養(yǎng)源的躅蝽的卵孵化率。實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)昆蟲(chóng)的卵孵化率僅需2-3天。而用傳統(tǒng)的生物學(xué)方法需要30-60天左右。本發(fā)明的檢測(cè)方法涉及的材料來(lái)源廣，易購(gòu)買(mǎi)，操作簡(jiǎn)單，省時(shí)，省力，適合于在昆蟲(chóng)商品檢驗(yàn)檢測(cè)中推廣應(yīng)用。
圖1為躅蝽beta-actin內(nèi)參擴(kuò)增曲線圖2為躅蝽beta-actin內(nèi)參融解曲線圖3為躅蝽精液蛋白CSSFP066基因擴(kuò)增曲線圖4為躅蝽精液蛋白CSSFP066基因融解曲線
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、檢測(cè)昆蟲(chóng)卵孵化率的精液蛋白CSSFP066及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)和專(zhuān)用引物的設(shè)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)，精液蛋白基因是一種檢測(cè)昆蟲(chóng)卵孵化率的很好的分子標(biāo)記，因此本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)躅蝽的精液蛋白(seminal fluid protein CSSFP066)編碼基因的表達(dá)來(lái)檢測(cè)躅蝽的卵孵化率。躅蝽的精液蛋白CSSFP066編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-312位核苷酸，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。根據(jù)躅蝽的精液蛋白CSSFP066編碼基因設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增該編碼基因的引物如下上游引物TCACCAGTCCTTGCTTCGAC(序列 3 );下游引物TGCACTCGTAGGGAnTTGTC(序列 4)。實(shí)施例2、精液蛋白CSSFP066或編碼基因或?qū)Ｓ靡镌跈z測(cè)躅蝽卵孵化率中的應(yīng)用下述實(shí)驗(yàn)中米用的螞疇(Armachinensis,記載在 Taxonomic and bionomicnotes onArma chinensis (Fallou) (Hemiptera:Pentatomidae:Asopinae, Zootaxa,3382:41-52, 2012，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所獲得)根據(jù)取食物質(zhì)的不同分為兩組，每組50只 取食人工飼料組躅蝽飼喂人工飼料的躅蝽(27 ±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每天每頭成蟲(chóng)飼喂160 Ul人工飼料，一直到躅蝽自然死亡；取食獵物組躅蝽飼喂獵物的躅蝽(27±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每對(duì)成蟲(chóng)飼喂一頭獵物，每隔7-15天根據(jù)獵物被取食情況更換一次獵物，一直到躅蝽自然死亡；人工飼料為生豬肝60g、大豆粉IOgjjC 100ml、雞蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VCO. 2g、氯化膽堿0. 4g、泛酸I丐8mg、葉酸0. lmg、煙酰胺0. 2mg、慶大霉素3. 9mg ；獵物為昨蠶(Antheraea pernyi )蛹(可商購(gòu))。一、躅蝽cDNA的獲得1、躅蝽RNA抽提步驟如下將各組躅蝽樣品移入加入適量液氮的研缽中，快速、用力研磨成勻漿，移至1. 5ml
離心管中。加1000 u ITri zol到1. 5ml離心管中，靜置5分鐘。加200 U I氯仿，旋渦振蕩10秒，靜置5分鐘，放入離心機(jī)中，12，000g4°C離心15分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，_20°C放置I小時(shí)，室溫靜置10分鐘。放入離心機(jī)中，12，000g，4°C離心10分鐘。棄上清液，將異丙醇除盡，加入Iml75%的無(wú)水乙醇，12，000g，4°C離心5分鐘。
棄上清液，待沉淀干燥后加入DEPC處理水，_80°C保存，得到RNA。2、反轉(zhuǎn)錄米用SuperscripttOReverse Transcriptasekit 試劑盒(Invitrogenl8080044)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄a)取一滅菌的無(wú)RNA酶的印pendorf管，每個(gè)樣本加入如下表I所示的組分得到mixl ；表I為反轉(zhuǎn)錄加入組分I
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)精液蛋白CSSFP066編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)在檢測(cè)昆蟲(chóng)卵孵化率中的應(yīng)用； 所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述昆蟲(chóng)為昆蟲(chóng)個(gè)體或昆蟲(chóng)種群； 所述精液蛋白CSSFP066編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-312位核苷酸； 所述昆蟲(chóng)具體為躅蝽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用于檢測(cè)精液蛋白CSSFP066編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)為如下I) -3)中任意一種 1)引物對(duì)A:所述引物對(duì)由引物I和引物2組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4 ； 2)含有所述引物對(duì)A的RT-PCR試劑； 3)含有所述引物對(duì)A或所述RT-PCR試劑的試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于 所述RT-PCR試劑由水、RT-PCR擴(kuò)增緩沖液、鎂離子、dNTPs、所述的引物對(duì)A、熒光染料和Taq酶組成； 所述弓I物對(duì)A中的各條弓I物在所述RT-PCR試劑中的終濃度具體為0. 2-1 ii M,所述弓I物對(duì)A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度進(jìn)一步具體為0. 25uM ； 所述試劑盒還包括內(nèi)參引物對(duì)B，所述內(nèi)參引物對(duì)B由引物3和引物4組成；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7。
5.一種檢測(cè)昆蟲(chóng)卵孵化率的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求3或4應(yīng)用中所述的引物對(duì)A或所述的RT-PCR試劑或所述的試劑盒對(duì)待測(cè)的昆蟲(chóng)A和B進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增； 若所述昆蟲(chóng)A的精液蛋白CSSFP066基因的表達(dá)量高于所述昆蟲(chóng)B，則所述昆蟲(chóng)A的卵孵化率高于所述昆蟲(chóng)B。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述昆蟲(chóng)為昆蟲(chóng)個(gè)體或昆蟲(chóng)種群； 所述RT-PCR擴(kuò)增的模板為昆蟲(chóng)的cDNA ； 所述昆蟲(chóng)具體為躅蝽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用精液蛋白基因檢測(cè)昆蟲(chóng)卵孵化率的方法。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)取食不同物質(zhì)的昆蟲(chóng)種群的精液蛋白CSSFP066編碼基因表達(dá)量的物質(zhì)在檢測(cè)取食不同物質(zhì)的昆蟲(chóng)種群卵孵化率中的應(yīng)用；所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法可以用于檢測(cè)昆蟲(chóng)卵孵化率，特別是不同營(yíng)養(yǎng)源的蠋蝽的卵孵化率，用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)昆蟲(chóng)的卵孵化率僅需2-3天。而用傳統(tǒng)的生物學(xué)方法需要30-60天左右。本發(fā)明的檢測(cè)方法涉及的材料來(lái)源廣，易購(gòu)買(mǎi)，操作簡(jiǎn)單，省時(shí)，省力，適合于在昆蟲(chóng)商品檢驗(yàn)檢測(cè)中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103060465SQ20131003140
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者鄒德玉, 陳紅印, 張禮生, 王樹(shù)英, 陳長(zhǎng)風(fēng), 王孟卿, 劉晨曦 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所