專利名稱：一種生物轉(zhuǎn)化二醇型人參皂甙Rb1的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用真菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂甙的方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。
技術(shù)背景人參是中國名貴中藥。人參皂甙是人參重要的活性成分，具有多種生物活性。Rbl、Rd、Rg3均屬于人參皂甙。Rbl的含量最多，其次是Rd，Rg3的含量最少。Rg3具有多種藥理作用預(yù)防和治療癌癥，改善心臟血管功能，抗血小板凝集，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞，提高集體免疫力，抗疲勞，抗血栓，保肝，降低膽固醇，且無依賴性，對正常組織無毒性；尤其是明顯的抑制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的功能，使其成為許多國家研究的熱點(diǎn)。利用生物轉(zhuǎn)化可以將Rbl轉(zhuǎn)化成Rd或者Rg3。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種利用真菌將含量高的人參皂甙Rbl轉(zhuǎn)化為含量低、藥效高的人參皂甙Rd或者Rg3的方法。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是利用番茄葉霉(Cladosporium fulvum)高效轉(zhuǎn)化Rb成Rd或者Rg3。包括以下步驟 a)活化菌種無菌操作接種于V-8汁固體培養(yǎng)基、90cm培養(yǎng)皿，25。C恒溫暗培養(yǎng)5-10天; b)刮取孢子無菌條件下，刮下平板上的菌絲和孢子，用無菌水沖洗平板若干次，將菌絲及孢子全部轉(zhuǎn)移到無菌水中。向含有菌絲及孢子的無菌水中加入玻璃珠，室溫振蕩l-2h，使孢子充分分散。四層紗布過濾，濾液離心，棄去上清，得到孢子(沉淀)；
c)液體培養(yǎng)將孢子加入到V-8液體培養(yǎng)基(不含瓊脂)中，28°C 、 150r/min恒溫振蕩培養(yǎng)； d)濾取新生菌絲將液體培養(yǎng)48h-72h的孢子懸液用四層紗布過濾，得到新生菌絲； e)生物轉(zhuǎn)化將新生菌絲加入到含有人參皂甙的醋酸緩沖液中，28t:恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔24小時取出1組轉(zhuǎn)化液離心，棄去菌體，取上清液加水飽和正丁醇終止反應(yīng)，TLC檢測。 f)回收皂甙用正丁醇終止反應(yīng)，同時皂甙產(chǎn)物被萃取至有機(jī)層中。將有機(jī)層水浴蒸干，然后用乙睛(乙睛水=35 : 65)溶解，進(jìn)行柱層析分離制備稀有人參皂甙純品。
具體實(shí)施例方式
1.活化菌種無菌操作接種于V-8汁固體培養(yǎng)基，25°。恒溫暗培養(yǎng)5-10天。
2.刮取孢子無菌條件下，刮下平板上的菌絲和孢子，用無菌水沖洗平板若干次，將菌絲及孢子全部轉(zhuǎn)移到無菌水中。向含有菌絲及孢子的無菌水中加入玻璃珠，室溫振蕩l-2h， 200rpm，使孢子充分分散。
3.液體培養(yǎng)四層紗布過濾培養(yǎng)液，濾液離心，棄去上清，得到孢子；將孢子加入到200mL的V-8液體培養(yǎng)基中，稀釋調(diào)整濃度為5 X 106個/ml， 28°C 、 150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)。
4.擴(kuò)大培養(yǎng)將液體培養(yǎng)48h-72h的孢子懸液用四層紗布過濾，得到新生菌絲。
5.生物轉(zhuǎn)化將新生菌絲加入到400ml醋酸緩沖液(0. 2M， pH 5)中，調(diào)整其濃度
3為5X 106個/ml，加入人參皂甙Rbl，終濃度為0. 25mg/ml， ， 28"恒溫振蕩培養(yǎng)8天。
6.回收皂甙離心，6000rpm，20min，取上清液，按正丁醇與培養(yǎng)液體積比1 : 2的比例，加水飽和正丁醇，皂甙產(chǎn)物被萃取至有機(jī)層中。重復(fù)三次，合并有機(jī)液。將有機(jī)層水浴蒸干，然后用乙睛(乙睛水=35 : 65)溶解，進(jìn)行HPLC分離制備稀有人參皂甙純品，得到人參皂甙Rd 68mg。
權(quán)利要求
一種生物轉(zhuǎn)化人參皂甙Rb1制備Rd或者Rg3的方法，其特征在于利用番茄葉霉(Cladosporium fulvum)水解人參皂甙Rb1，制備Rd或者Rg3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物轉(zhuǎn)化Rbl，制備Rd或者Rg3的方法，其特征在于包含以 下主要步驟a) 活化菌種將番茄葉霉(Cladosporium fulvum)無菌操作接種于V_8汁固體培養(yǎng)基， 25t:恒溫暗培養(yǎng)5-10天。b) 刮取孢子無菌條件下，刮下平板上的菌絲和孢子，用無菌水沖洗平板若干次，將 菌絲及孢子全部轉(zhuǎn)移到無菌水中；向含有菌絲及孢子的無菌水中加入玻璃珠，室溫振蕩 l-2h，使孢子充分分散；四層紗布過濾，濾液離心，棄去上清，得到孢子(沉淀)。c) 液體培養(yǎng)將孢子加入到V-8液體培養(yǎng)基(不含瓊脂)中，28t:、150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)。d) 濾取新生菌絲將液體培養(yǎng)48h-72h的孢子懸液用四層紗布過濾，得到新生菌絲。e) 生物轉(zhuǎn)化將新生菌絲加入到含有人參皂甙的醋酸緩沖液中，28t:恒溫振蕩培養(yǎng)； 每隔24小時取出1組轉(zhuǎn)化液離心，棄去菌體，取上清液加水飽和正丁醇終止反應(yīng)。f) 回收皂甙用正丁醇終止反應(yīng)，同時皂甙產(chǎn)物被萃取至有機(jī)層中；將有機(jī)層水浴蒸 干，然后用乙睛(乙睛水=35 : 65)溶解，進(jìn)行柱層析分離制備稀有人參皂甙純品。
全文摘要
本發(fā)明公開一種生物轉(zhuǎn)化二醇型人參皂甙Rb1的方法，用番茄葉霉(Cladosporium fulvum)水解Rb 1，制備稀有人參皂甙Rd或者Rg3。具有選擇性好、活性高，工藝簡單，生產(chǎn)路線短，產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12P33/00GK101748183SQ20081005162
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者付玲, 臺桂花, 周義發(fā), 孫成新, 趙雪淞, 高娟 申請人:東北師范大學(xué)