專利名稱：豬苓伴生菌提高豬苓菌絲體產(chǎn)量及多糖含量的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及一項利用真菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)豬苓時提 高豬苓菌絲體產(chǎn)量及菌絲體多糖含量的實用技術(shù)。
背景技術(shù)：
豬苓[尸o/少/7oms ww&〃a^^ (Pers.) Fries]屬多孔菌科真菌，其干燥菌核入藥在我國已有 2000多年的歷史，是重要的傳統(tǒng)中藥。豬苓子實體俗稱"豬苓花"、"千層蘑菇"，味道鮮美， 可食。豬苓菌核具有利水滲濕的功效，為我國歷版藥典所收錄。在上世紀(jì)70年代，日本學(xué)者 首先從豬苓菌核中分離出了豬苳多糖，并證明它對動物移植性腫瘤有抑制作用。隨后圍繞豬 苓多糖開展了很多研究工作?，F(xiàn)已證明，豬苓多糖具有免疫刺激作用，可提高人體免疫力， 對肺癌、宮頸癌、肝癌等多種癌癥都有一定療效，其抗癌效果已受到國內(nèi)外醫(yī)藥界的普遍重 視；同時，豬苓多糖在治療慢性傳染性肝炎和抗放射等方面也有良好的效果，豬苓多糖能顯 著降低肝臟中氧化清除自由基損傷的作用，對于延緩組織細(xì)胞老化、保護(hù)機體、抗老防衰十 分有益。上世紀(jì)八、九十年代，我國已經(jīng)有豬苓多糖注射液、豬苓多糖膠囊等產(chǎn)品問世，并 在臨床及日常保健中被廣泛為應(yīng)用。隨著豬苓藥用范圍的擴大，加之缺乏有效的管理，由亂 采濫挖而導(dǎo)致豬苓野生資源銳減，已很難滿足市場需求。發(fā)酵工程技術(shù)是通過現(xiàn)代微生物工程技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)，是大部分生物技 術(shù)藥物工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。利用發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行藥物的生產(chǎn)是現(xiàn)代生物技術(shù)制藥的一個重要內(nèi) 容。真菌具有種類多、次生代謝產(chǎn)物豐富多樣、培養(yǎng)條件簡單等特點，針對食、藥用真菌的 自身發(fā)酵研究已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點。發(fā)酵技術(shù)具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、產(chǎn)物質(zhì)量穩(wěn)定 等特點，由此開辟了藥用真菌生產(chǎn)的新途徑。已有研究表明發(fā)酵生產(chǎn)的豬苓菌絲體多糖與豬苓子實體多糖的紅外吸收光譜相似，該多 糖對Lewis肺癌及HAC肝癌的殺傷作用明顯，具有調(diào)節(jié)免疫功能。從豬苓菌絲體中提取的多 糖和從豬苓菌核中提取的多糖均能提高機體免疫力。由此可見，通過工業(yè)發(fā)酵來生產(chǎn)豬苓菌絲體及多糖是解決當(dāng)前豬苓供求矛盾的一條捷徑， 并能在一定程度上保護(hù)豬苓的野生資源，實現(xiàn)其資源的可持續(xù)利用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用真菌的發(fā)酵產(chǎn)物來大幅度提高豬苓菌絲體產(chǎn)量及多糖含量的發(fā)酵方法。該方法操作簡便，應(yīng)用效果明顯，用于豬苓菌絲體和豬苓菌絲多糖的工業(yè)化生 產(chǎn)中，能提高生產(chǎn)效率，提高產(chǎn)量。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)是先液體發(fā)酵培養(yǎng)真菌，再將真菌的菌絲體或發(fā)酵 液以一定比例添加到豬苓的液體發(fā)酵體系中，從而提高豬苓菌絲體的產(chǎn)量及豬苓菌絲多糖的 含量。本發(fā)明采用的真菌為分離自野生豬苓菌核的穴中并經(jīng)過人工馴化和選育的菌株，經(jīng)鑒定 為豬苓伴生菌(Gn/oto sp.) GS-1，該菌種于2007年4月27日在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院 微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.2023。保藏和存活證明見附件。 具體地說，本發(fā)明所述的技術(shù)步驟方法如下-1. 真菌GS-1的液體培養(yǎng)將真菌菌株GS-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于 24-26'C恒溫培養(yǎng)20-30天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行 發(fā)酵培養(yǎng)30天；GS-1液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基麥麩1-5% (煮汁)，葡萄糖1-4%， KH2P04 0.05-0.2%， MgS04 0.05-0.2%，以上組分均按重量百分比含量計算,其余成分為水，pH 5.0-6.5，三角瓶或其他容 器振蕩,暗培養(yǎng)真菌，容器裝量30-60%。培養(yǎng)基滅菌后接入真菌GS-1。培養(yǎng)條件振蕩轉(zhuǎn)速 100-150轉(zhuǎn)/分鐘；22-25'C暗培養(yǎng)；20-30天收獲。2. 真菌GS-1在豬苓液體發(fā)酵培養(yǎng)的應(yīng)用上述菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)后，發(fā)酵產(chǎn)物添加到豬苓的液體培養(yǎng)體系中，進(jìn)行豬苓菌絲體的 發(fā)酵培養(yǎng)。GS-1發(fā)酵產(chǎn)物的處理及添加方式為(1) 液體培養(yǎng)的GS-1菌絲體，打碎后添加到豬苓的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)滅菌處理后接種 豬苓菌種進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。GS-1菌絲體的加入量以鮮重計算(W)為豬苓培養(yǎng)基體積(V)的 0.5%隱2%;(2) 液體培養(yǎng)的GS-1，在無菌條件下過濾，獲得GS-1發(fā)酵液。在無菌條件下添加GS-1 發(fā)酵液至已經(jīng)過滅菌處理的豬苓液體培養(yǎng)基中，再接種豬苓菌種進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。GS-1發(fā)酵液 的加入量以體積計算(V)為豬苓液體培養(yǎng)基體積(V)的10%-40%。應(yīng)用這種方式添加GS-1 發(fā)酵產(chǎn)物時，應(yīng)適當(dāng)提高豬苓液體培養(yǎng)基中碳源的用量，以提高10-40%為宜。
具體實施方式
實施例l.GS-l的液體培養(yǎng)將GS-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于24'C恒溫 培養(yǎng)25天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);GS-1 液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基麥麩3% (煮汁)，葡萄糖2%， KH2PO40.1%， MgSO40.1%，以上組分均 按重量百分含量計算，其余成分為水，pH5.8。三角瓶振蕩暗培養(yǎng)，容器裝量40%。培養(yǎng)基滅 菌后接入GS-1菌株。培養(yǎng)條件振蕩轉(zhuǎn)速110轉(zhuǎn)/分鐘；24-25'C暗培養(yǎng)25天。2. GS-1菌絲體的加入GS-1液體發(fā)酵培養(yǎng)后，用100目尼龍網(wǎng)過濾，分離菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體用水沖洗干凈， 擠干水分，稱重后研磨粉碎，加入豬苓液體發(fā)酵的培養(yǎng)基中。GS-1菌絲體的加入量以鮮重計 算(W)為豬苓液體培養(yǎng)基體積(W)的1%。加入GS-1菌絲體的豬苓液體培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓 滅菌處理后接入豬苓菌種，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。比較例1. 添加GS-1發(fā)酵液對豬苓菌絲體產(chǎn)量及菌絲多糖含量的影響將GS-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，在24-25'C下于PDA培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)30天， 接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基含麥麩3% (煮汁)，葡萄糖2%， KH2PO40.2%， MgSO40.1%，以上組分均按重量百分含量計算，其余成分為水，pH6.0。三角瓶振蕩暗培養(yǎng)， 培養(yǎng)基裝量30%，振蕩轉(zhuǎn)速110轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度22-25'C。GS-1培養(yǎng)30天后，在超凈工作臺中經(jīng)無菌濾紙過濾，去除GS-1菌絲體，GS-1發(fā)酵液加入 到已經(jīng)滅菌處理的豬苓液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入量為60ml/瓶。豬苓液體培養(yǎng)基組成，處理組 為麥麩3% (煮汁)，葡萄糖2.5%， KH2PO40.2%， MgSO40.1%;對照組為麥麩3% (煮汁)， 葡萄糖2%， KH2PO40.2%, MgSO40.1%。采用500ml三角瓶，對照組每瓶中培養(yǎng)基裝量200ml，處理組每瓶中培養(yǎng)基裝量140 ml， GS-1發(fā)酵液60 ml。取豬苓平板培養(yǎng)菌種，用直徑5 mm的打孔器沿平板菌種的外圍打孔，每 瓶接6片，120轉(zhuǎn)/分鐘震蕩暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22-25'C。發(fā)酵培養(yǎng)30天后收獲，過濾收集豬苓菌 絲體，濾后的菌絲體用蒸餾水沖洗數(shù)次，置5(TC烘箱中徹底烘干后精確稱重并測定多糖含量。 結(jié)果表明與對照組相比，在培養(yǎng)基中添加GS-1發(fā)酵液60 ml，使豬苳菌絲體的干重提高了 41%,菌絲多糖的含量提高了88.6%。2. 添加GS-1菌絲體對豬苳菌絲體產(chǎn)量及菌絲多糖含量的影響將GS-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，在24-25'C下于PDA培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)25天， 接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基含麥麩3% (煮汁)，葡萄糖2%， KH2PO40.2%， MgSO40.1%，以上組分均按重量百分含量計算，其余成分為水，pH6.2。三角瓶振蕩暗培養(yǎng)， 培養(yǎng)基裝量30%，振蕩轉(zhuǎn)速110轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度24-25'C。GS-1培養(yǎng)25天后，用100目尼龍網(wǎng)過濾獲得菌絲體，用蒸餾水沖洗干凈，吸干表面水分，(煮汁)，葡萄糖2%， KH2PO40.2%， MgSO40.1%。采用500ml三角瓶，對照組和處理組每瓶中培養(yǎng)基裝量200ml，處理組每瓶中加入研磨后 的GS-1菌絲體5 g。高溫高壓滅菌處理兩種豬苓液體培養(yǎng)基。取豬苳平板培養(yǎng)菌種，用直徑5 mm的打孔器沿平板菌種的外圍打孔，每瓶接6片，120轉(zhuǎn)/分鐘震蕩暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22-25'C。 發(fā)酵培養(yǎng)30天后收獲，抽濾收集豬苓菌絲體，濾后的菌絲體用蒸餾水沖洗數(shù)次，置5(TC烘箱 中徹底烘干后精確稱重并測定多糖含量。結(jié)果表明與對照相比，在培養(yǎng)基中添加GS-1菌絲 體5g，使豬苓菌絲體的干重提高了33.4%，菌絲多糖的含量提高了35.4%。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用豬苓伴生菌GS-1，在液體發(fā)酵培養(yǎng)時提高豬苓菌絲體產(chǎn)量及菌絲多糖含量的方法，包括步驟(1)豬苓伴生菌GS-1的液體培養(yǎng)將GS-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于22-28℃恒溫培養(yǎng)15-30天后，在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)18-30天；GS-1液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為麥麩、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4，三角瓶或其它容器振蕩暗培養(yǎng)真菌；(2)豬苓伴生菌GS-1在豬苓液體發(fā)酵培養(yǎng)中的應(yīng)用GS-1的液體培養(yǎng)產(chǎn)物，以菌絲體和發(fā)酵液兩種形式添加到豬苓的液體培養(yǎng)體系中，用于豬苓的發(fā)酵培養(yǎng)。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的真菌GS-1為豬苓伴生菌(Gn/o/asp.)，保藏 編號CGMCCNo. 2023。
3. 如權(quán)利要求1和2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于GS-1液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中各組分 的加入量按重量計分別為麥麩(煮汁)1-5%，葡萄糖1.5-4%，磷酸二氫鉀0.1-0.5%，硫酸鎂 0.1-0.3%;其余成分為水，培養(yǎng)基pH 5.0-6.5;三角瓶或其他容器振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量 30-60%;培養(yǎng)條件為振蕩轉(zhuǎn)速90-130轉(zhuǎn)/分鐘，20-28'C暗培養(yǎng)15-30天。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于液體培養(yǎng)的GS-1菌絲體，打碎后添加到豬 苓的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)滅菌處理后接種豬苓菌種進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)；GS-1菌絲體的加入量以鮮重 計算(W)為豬苓培養(yǎng)基體積(V)的0.5%-2%。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于液體培養(yǎng)的GS-1發(fā)酵液，在無菌條件下添 加到已經(jīng)過滅菌處理的豬苓液體培養(yǎng)基中，再接種豬苓菌種進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)；GS-l發(fā)酵液的加 入量以體積計算(V)為豬苓培養(yǎng)基體積(V)的10%-40%。
6. 如權(quán)利要求l所述的方法，GS-l也可用于豬苓菌絲體的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中。
7. 用于任一權(quán)利要求1-6所述方法的真菌GS-1為分離自野生豬苓菌核穴中并經(jīng)過人工 馴化和選育的豬苓伴生菌(Gn/o/fl sp.)，保藏編號CGMCC No. 2023。
全文摘要
一種利用真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)豬苓菌絲體的方法，所用的真菌為分離自野生豬苓菌核的穴中，并經(jīng)過人工馴化和選育的豬苓伴生菌(Grifola sp.)GS-1；通過在豬苓液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加GS-1液體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行豬苓菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)，提高液體培養(yǎng)豬苓菌絲體的產(chǎn)量和菌絲多糖的含量。該技術(shù)豬苓菌絲體的產(chǎn)量高，生產(chǎn)的豬苓菌絲體中菌絲多糖的含量高，且操作簡便，成本低，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P19/04GK101294139SQ20071009772
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者王春蘭, 邢曉科, 郭順星, 陳曉梅 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所