專利名稱：煙草s期激酶蛋白1基因序列及其編碼蛋白質(zhì)序列和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及S期激酶相關(guān)蛋白1基因，具體地說是一種來源于抗病煙草品 種枯斑三生煙(7Wcoria"ato6ac"mvar. SamsunNN)的煙草S期激酶蛋白1基因序列及其編碼蛋白質(zhì)序列和應(yīng)用。
技術(shù)背景S期激酶相關(guān)蛋白1 (S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PROTEINl， SKP1)是真核生物(煙草)中普遍存在的一類蛋白，是泛素連接酶3 SCF 復(fù)合體的核心亞單位。近幾年來研究發(fā)現(xiàn)，SCF介導(dǎo)的泛素系統(tǒng)在茉莉酸信 號(hào)途徑和R-基因介導(dǎo)的抗性等生物反應(yīng)過程中均有作用，但具體通路尚不 太清楚，尤其是在殼寡糖的誘抗中的作用尚無報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種煙草S期激酶蛋白1基因序列及其編碼蛋白 質(zhì)序列和應(yīng)用。一種煙草S期激酶蛋白1基因序列，具有序列表中SEQ ID NO. 1堿基序列。所述的煙草S期激酶蛋白lcDNA基因序列的編碼蛋白，具有序列表中 SEQ IDN0.2編碼的氨基酸序列。應(yīng)用基因序列的殼寡糖誘導(dǎo)植物抗性反應(yīng)，從而可將所述基因序列用 于制備生物農(nóng)藥。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)1. 真核生物煙草中普遍存在的一類蛋白，是泛素連接酶3 SCF復(fù)合體 的核心亞單位，與煙草的抗病毒活性相關(guān)，分子量為17527. 78Da，等電點(diǎn) 4. 57，定位于細(xì)胞質(zhì)，其Skpl結(jié)構(gòu)域位于4-105位氨基酸。2. 對(duì)生物農(nóng)藥的應(yīng)用具有明顯指導(dǎo)作用；該基因的克隆對(duì)于揭示殼寡 糖誘導(dǎo)植物抗性反應(yīng)的分子信號(hào)通路很有價(jià)值，并在寡糖生物農(nóng)藥的應(yīng)用 方面具有重要的理論指導(dǎo)意義。
圖1為本發(fā)明S期激酶相關(guān)蛋白1 (SKP1)根據(jù)衍射數(shù)據(jù)得到三緯結(jié) 構(gòu)模型圖。
具體實(shí)施方式
S期激酶相關(guān)蛋白1 (S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PROTEINl， SKP1)是真核生物(煙草)中普遍存在的一類蛋白，是泛素連接酶3 SCF 復(fù)合體的核心亞單位。近幾年來研究發(fā)現(xiàn)，SCF介導(dǎo)的泛素系統(tǒng)在茉莉酸 信號(hào)途徑和R-基因介導(dǎo)的抗性等生物反應(yīng)過程中均有作用，功能上具有多
樣性，調(diào)節(jié)過程廣泛；煙草SKP1是在殼寡糖處理?xiàng)l件下特異表達(dá)的，因此 與殼寡糖誘導(dǎo)的植物抗性信號(hào)傳導(dǎo)有著密切的關(guān)系。 實(shí)施例1l.煙草(枯斑三生煙)的S期激酶相關(guān)蛋白1基因的cDNA的克隆及序列1) 50mg/L的殼寡糖噴施煙草葉片，噴水作對(duì)照，分別在8h和168h取 樣提取總RNA進(jìn)行DDRT-PCR，將差異片段回收并亞克隆后，測序獲得3 '端序列，該片段與本塞姆氏煙草的SKP1 ( S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PR0TEIN1)基因同源性為82%。2) 利用CLONTECH公司的試劑盒獲得枯斑三生煙草的SKP1基因的5 '端及cDNA的全長，進(jìn)而推導(dǎo)出氨基酸序列。3) 可被殼寡糖誘導(dǎo)的枯斑三生煙草SKP1具有以下cDNA堿基(參見序 列表l)和蛋白質(zhì)的氨基酸序列(參見序列表2)。煙草S期激酶相關(guān)蛋白l基因(SXP/)的cDNA序列特征基因組序 列653bp,核苷酸、線性雙鏈，最初來源枯斑三生煙草(Nicotianatabacum var.samsun NN);煙草S期激酶相關(guān)蛋白l基因(SXP/)的氨基酸序列特征線性、單 鏈、155氨基酸。4) 根據(jù)枯斑三生煙SKP1基因的cDNA全長序列和pET-23b(+)的特點(diǎn)， 設(shè)計(jì)SKP1基因原核表達(dá)的PCR引物序列，分別在引物skples和skplea的 5 '端引入了 Nde I和Xhol I酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，另在下游引物的酶 切位點(diǎn)后面去掉目的基因的終止密碼子以產(chǎn)生融合有His標(biāo)簽的融合蛋白， 引物序列入下SKP1 上游表達(dá)引物(skples ) 5' CGGCCCATATGTCCTCCTCAAAGATGATC 3'; SKP1下游表達(dá)引物 (skplea)5' GCCGCCTCGAGCTCAAATGCCCAAGCATT 3'，以枯斑三生 煙草總RNA為模板擴(kuò)增待表達(dá)的基因片段，克隆到表達(dá)載體pET-23b(+)上， 轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3)誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)出與預(yù)期蛋白相符的目的蛋白， 且該蛋白的大量表達(dá)可以抑制大腸桿菌的增殖，因此該蛋白具有一定的抑 菌活性，可增強(qiáng)植物的抗病性。5) 根據(jù)枯斑三生煙SKP1基因的cDNA全長序列設(shè)計(jì)RNA干擾引物，擴(kuò)增目的片段，克隆到干擾載體pHANMBAL上構(gòu)建干擾重組質(zhì)粒pHANNIBAL-skpla-skpls，將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，然后侵染煙草獲得 轉(zhuǎn)基因煙草，結(jié)果證明有千擾片段插入的煙草植株抗煙草花葉病毒的抗性 減弱，因此SKP1基因的正常表達(dá)對(duì)煙草的抗病性起關(guān)鍵的作用。6) 根據(jù)枯斑三生煙SKP1基因的cDNA全長序列設(shè)計(jì)植物過表達(dá)擴(kuò)增弓I 物 SKP1 上 游 表 達(dá) 引 物 (skplSLs )-5' CGGCCAGATCTATGTCCTCCTCAAAGATG 3'和SKP1下游表達(dá)引物 (skplSLa)-5' GCCGCACTAGTCTCAAATGCCCAAGCATT 3'，分別在引
物skplSLs和skplSLa的5 '端引入了 Bgl II和Spe I酶切位點(diǎn)(下劃線部 分)，經(jīng)過酶切和連接后構(gòu)建出植物過表達(dá)重組質(zhì)粒pCAMBIAl 1302-SKP1, 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404然后侵染煙草，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在SKP1過表達(dá)的情況 下，植物體抗病性和抗逆性都由明顯提高。 實(shí)施例21. mRNA差異顯示及3'末端的克隆材料 感病煙草品種枯斑三生煙(Nicotianatabacum var. samsunNN)于溫室中培養(yǎng)至幼苗為4-5片葉時(shí)，葉面噴施50mg/L殼寡糖，葉面噴施雙蒸水作 為對(duì)照，分別在8小時(shí)和168小時(shí)取材。2. 總RNA提取，定量與完整性檢測用雙蒸水洗去葉表面塵土，在液氮中研磨，用TRIZOL (GibcoBRL) 試劑提取RNA。 (l)定量測260、 280nm處的吸光值，計(jì)算A^/A^的值 以估計(jì)總RNA的純度。通過A湖的值計(jì)算總RNA的量。(2)RNA完整性檢 測在1%甲醛變性瓊脂糖凝膠上分離總RNA，若有兩條清晰的帶，且大 分子量(28SrRNA)的亮度近似為小分子量(18SrRNA)的亮度的2倍,則說 明總RNA完整。3. mRNA差異顯示及差異片段的回收、載體連接一用RNAase free DNAase I去除總RNA中的DNA污染。第一條cDNA 合成在20tU反應(yīng)體系中加入2.0lU濃度為0.1ug/ul的總RNA， 2.0ul 錨定引物AP (2uM)混勻，7CTC溫育5min立即置冰上冷卻，力ll 7 . 8 " 1 滅菌的DEPC水，5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液4.0ul， 2.0ul的dNTP混合液(250 y M每種)，2.0 ti 1的DTT( 100mM),0.2 u 1 Superscript II RT enzyme( 200U/ Pi);反應(yīng)程序?yàn)?2°C 5分鐘，50。C50分鐘，70。C15分鐘，holdat4。C。 DD — PCR:在l Oul反應(yīng)體系中加入1 . 9 5 u 1滅菌的D E P C水， lOXPCR緩沖液lul(無MgCl2)， 1.5 lU MgCl2(25mM),2WdNTP mix(250WVI每種)，1 .7 5 ul隨機(jī)引物(2PM)， 0.7W四甲基諾丹明標(biāo) 記的相應(yīng)的錨定引物(TMR — AP， 5!iM)， 1 W反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，0.1 Units/W的AmpliTaqK酶;反應(yīng)程序?yàn)? 5T變性2分鐘；9 2 °C 1 5秒， 5 0°C 3 0秒，7 2°C 2分鐘為一個(gè)反應(yīng)循環(huán)，重復(fù)4次；9 2 °C〗5 秒，6(TC3 0秒，7 2°C 2分鐘為一個(gè)反應(yīng)循環(huán)，重復(fù)3 0次；7 2 。C延伸7分鐘；Hold at 4°C。將來自經(jīng)殼寡糖誘導(dǎo)的8h禾n 1 6 8 h材料 的同一對(duì)引物RT —P C R產(chǎn)物(4.0u 1DD-PCR樣品+ 1 5 " 1熒光差 顯示染料)并排在5. 6 %聚丙烯酰胺尿素膠上分離，5 5 °C， 3 0 0 0 V， 1 0 0 W 5小時(shí)，熒光檢測，回收差異條帶。經(jīng)AP和ARP兩端的L和M13, 通用引物對(duì)回收條帶再擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PMD 18-T載體(大連寶生物 工程有限公司)上。4. 陽性克隆片段的鑒定將各連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Novanblue，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，分別挑取10個(gè)
白斑液體擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒(王關(guān)林，方宏筠，2002)1%瓊脂糖電泳檢測 后，選取遷移略慢的質(zhì)粒經(jīng)EC0R I和HindIII雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳 檢測。 」5. 反向Northern點(diǎn)雜交分析取插入片段一致且與PCR產(chǎn)物大小一致的的質(zhì)粒2W(0.5^gMl)點(diǎn)到 Hybond-K"尼龍膜上，8(TC烘烤2小時(shí)固定，用DIG-dUTP標(biāo)記探針，按照地高辛試劑盒操作說明進(jìn)行雜交分析后由大連寶生物工程有限公司用F Primer(M13-47)CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC在ABI PRISM 377 X L DNA Sequencer上測序。6. 序列同源性比較用核苷酸序列同源性比較軟件(BLAST)在基因核苷酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 同源性比較分析。結(jié)果獲得誘導(dǎo)表達(dá)的SKP1基因的3'端序列AAA7.cDNA的5'末端及全長的克隆cDNA5 一末端快速擴(kuò)增按照Clontech公司的SMART RACE cDNA擴(kuò)增 試劑盒說明書進(jìn)行。1JJ g噴施殼寡糖8h后的煙草總RNA用于cDNA的合 成，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用通用引物混合物(Long:5 '和Short:5 ' -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ')和根據(jù)3 '端序列設(shè)計(jì) 的5 ' RACE基因特異引物(5' -TGAGATCGAATAGGGTGGCATGGTC- 3')按照 試劑盒說明書擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測并純化后連接 到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Novanblue,藍(lán)白斑篩選及酶切鑒定后， 由寶生物工程(大連)有限公司測序。獲得5'端序列GCTTCTGAGGATGAGCTTAAGG
用Clone Manager軟件分析并與3 '序列拼接，根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增 全長的特異引物(5' - TAACAMGTCAGGGGTCCAAAAGC-3')與通用引物(Long:5'禾口 Short:5 ' —CTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ') —起以5 ' -RACE-Ready cDNA為模板擴(kuò)增差顯片段的cDNA全長，連接到PMD18-T 載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌Novablue，藍(lán)白斑篩選及酶切鑒定后，由寶生物工程(大連)有限公司測序，獲得枯斑三生煙草的SKP1基因cDNA的全長參 見序列表1，GCATTCACTCTCTCTGAGGAAGCGGTGGCTTTGGAATCTCAGACGATAAAGCATATGATTGAAGATGATTGCATCAAGAATGACTTCACTCCAGAGGAAGAAGAGGAGGTTAGGAGGGAGAATGCTTGGTGACTTTGTTA并推導(dǎo)出氨基酸序列參見序列表2:MSSSKMIVKSSDGETFEvlHEEAVAESQTIKHMIEDDC:,HADTsIPPNVTSKIAKVI57EYCKRHVDATKTEDKASED7fiEKGFDSDFVKVDQATFD95LIAANYNIKsDTCTVADMIKGKTPEEIRKTFIKNDFTPEEEEEVRREN AA F實(shí)施例31.SKP1蛋白的原核表達(dá) (1)根據(jù)SKPl cDNA序列設(shè)計(jì)并在TaKaRa公司合成了 SKP1基因 的表達(dá)蛋白的引物SKP1 上 游 表 達(dá) 引 物 (skples )-5' CGGCCCATATGTCCTCCTCAAAGATGATC 3' SKPl 下 游 表 達(dá) 弓l 物 (skplea )-5' GCCGCCTCGAGCTCAAATGCCCAAGCATT 3'參考pET-23b(+)的多克隆位點(diǎn)，分別在引物skples和skplea的5 '端引 入了 Nde I和Xhol I酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。 (2) SKPl cDNA的合成 以SKPl全長亞克隆質(zhì)粒pMD18-SKPl質(zhì)粒為模板擴(kuò)增待表達(dá)的SKPl cDNA序列，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在25 W反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)體系[stock]1XrXn(50W)[final]無菌雙蒸水18.PCR緩沖液10X2. 5^1IXdNTP混合液(1:1:1:1)250MM20剛skplcs10,0. 5ri0.2,Skpl6310MM0. 5^10. 2幽LATag酶5u/W0.0.05 u/WSkpl全長質(zhì)粒DNAO，lPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件95。C， 2min4個(gè)循環(huán)94°C 15sec，52 °C30sec，72°C 2min;30個(gè)循環(huán)94°C 15sec，68 °C30sec,72°C 2niin;72°C,10min- 4。C,hold將PCR反應(yīng)擴(kuò)增的目的片段按照Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0的操作程序回收純化，在50 u 1反應(yīng)液體系中用Nde I和Xho I 酶切回收的PCR產(chǎn)物和pET23b載體，37"C反應(yīng)15 h,P/。瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。其中，10XH緩沖液組分5 0 0 mM Tris-HCl(pH7.5),100mM MgC12,10mM Dithiothreitol, 1000mM NaCl;分別將雙酶切后的skpl誦e片段和pET曙23b載體按照Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0的操作程序回收純化，在25 u 1體系中用T4 DNA連 接酶將skpl-e與pET23b片段連接。反應(yīng)液體系A(chǔ):反應(yīng)液體系BX H緩沖液 SKPl擴(kuò)增產(chǎn)物 Xho I (10 U/u 1 ) Nde I ( 8 U/ u 1 ) 無菌H20 一 10 X H緩沖液 pET23b質(zhì)粒 Xhol I (10 U/u 1 ) Nde I ( 8 U/") 無菌H20 反應(yīng)液體系A(chǔ):反應(yīng)液體系B:10 X H緩沖液 SKP1擴(kuò)增產(chǎn)物 Xh0 I (10 U/u 1 ) Nde I ( 8 U/ u 1 ) 無菌H20 10 X H緩沖液 pET23b質(zhì)粒 Xhol I (10 U/y 1 ) Nde I ( 8 U/ u 1 ) 無菌H20 2.性質(zhì)測定(1)重組子的篩選鑒定 挑取LB/Amp平扳培養(yǎng)基上的單菌落接種于2 ml含Amp的液體LB培養(yǎng) 基中，37°C， 150rpm搖培過夜，按照小量質(zhì)粒DNA提取法提取質(zhì)粒，1%瓊 脂糖凝膠(含0.5Mg/ml溴化乙錠)電泳檢測質(zhì)粒質(zhì)量。用提取的質(zhì)粒做模板，在2514反應(yīng)體系中PCR擴(kuò)增反應(yīng)篩選陽性克隆，5 yl 40 ul 1. 5 u 1 2 y 11. 5 u ] 5 ul y 1 u 1 u 134 y 1812PCR反應(yīng)體系 無菌雙蒸水 PCR緩沖液 dNTP混合液(1:1:1:1) skplps skplpa LATag酶Skpl全長質(zhì)粒DNA PCR反應(yīng)條件 95 °C, 2min 4個(gè)循環(huán)94°C 15sec， 30個(gè)循環(huán):94°C 15sec, 72°C，lOmin- [stock]10X 250MM IOMM 10, 5u/W1 XrXn(50W) 18.2. 5ri2. (￥1 0. 5rt 0. 5ri 0. 25W[final]IX 20剛 0.2, 0. 2幽 0.05 u/W52 。C 68 。C30sec， 30sec，72 °C 72 °C2min; 2min;— 4。C，hold 1%瓊脂糖凝膠(含0.5Mg/ml溴化乙錠)電泳檢測PCR反應(yīng)結(jié)果， 擴(kuò)增出目的產(chǎn)物質(zhì)粒，用Nde I和XholI雙酶切，反應(yīng)體系如下，反應(yīng)液體系13 lU8 u 1 U 1 5 ul 16. 5 u 110 X H緩沖液 pET23b-SKPl質(zhì)粒 Xho I (10 U/y 1 ) Nde I ( 8 U/u 1 )無菌H2037"C反應(yīng)15h，l。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，將陽性克隆送寶生物 工程(大連)有限公司測序。(2)枯斑三生煙草SKP1蛋白的結(jié)構(gòu)初始結(jié)晶條件摸索采用Hampton Reasearch的Kit I和KitII試劑盒， 以及實(shí)驗(yàn)室自己配置的PEG 4000和PEG 8000 Kit的稀疏矩陣采樣法.經(jīng)過 對(duì)溫度、溶液pH、蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度、添加劑和沉淀劑等條件的摸索，
獲得一種長柱狀的晶體，可基本滿足高分辨率的結(jié)構(gòu)解析要求.晶體生長所 用的蛋白質(zhì)最好是當(dāng)日制備的SKP1新鮮蛋白質(zhì)。最終的結(jié)晶條件如下50%聚乙二醇(PEG) 1000,50 mM磷酸鈉，50 mM檸檬酸鈉pH 4.2.數(shù)據(jù)在MAR345面探測器上收集，所用光源為RIGUKU的轉(zhuǎn)耙陽極X射 線發(fā)生器，電壓和電流分別為48 KV和98 Ma，波長為0. 15418 nm。衍射 數(shù)據(jù)用服L軟件包的DENZ0和SCALEPACK程序處理，結(jié)果見下表Resolution limit[A]2.6Space groupUnique reflections (resolution range[A])21 328 (30.0-2.60)， 908(2.64-2.60)Completeness [%] (resolution range[A])89.50 (30.0-2.60)， 77.30 (2.64-2.60)實(shí)施例4(1)枯斑三生煙草SKPl在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將表達(dá)菌BL21(DE3)/pET23-skpl及相應(yīng)的空載體菌接在LB液體培養(yǎng) 基/Amp中，37。C培養(yǎng)過夜，次日取或化后的菌液按1%比例繼代培養(yǎng)3 h， 0D值達(dá)到0. 5-0. 6時(shí)用終濃度為1腿ol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，持續(xù)振蕩培 養(yǎng)4h。將1. 4 ml培養(yǎng)液8000 rpm離心10 min，將上清轉(zhuǎn)入另一 EP管， 200 u 1無菌雙蒸水和50 u 1的5X SDS上樣緩沖液吹打懸浮細(xì)菌，沸水浴 10 min， 12000 rpm離心1 min，取15u 1上清液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。 結(jié)果擴(kuò)增出預(yù)期的目的蛋白，并且該蛋白對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用。 (2)該蛋白對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用轉(zhuǎn)基因苗的鑒定 ①RNAi載體的構(gòu)建 根據(jù)枯斑三生煙SKP1基因的cDNA全長序列設(shè)計(jì)RNA干擾引物，經(jīng) SES-WIN軟件分析SKP1基因cDNA序列中無Xho I 、 Kpn I 、 Cla I和 BamHl限制性酶切位點(diǎn)，因此在引物中直接引入這些酶切位點(diǎn)，引物序 列如下小寫為引入酶切位點(diǎn)(XhoI 、 Kpnl )，導(dǎo)致正向插入 primerl:SKPl正義引物-5' ctcgag CTACGATGTCCTCCTCAA 3' primer2:SKPl反義引物-5' ggtacc TCACTCAAATGCCCAAGC 3'小寫為引入酶切位點(diǎn)(BamH I和Cla I )，導(dǎo)致反向插入 primerl:SKPl正義引物-5' ggatcc CTACGATGTCCTCCTCAA 3' primer2:SKPl反義引物-5' atcgat TCACTCAAATGCCCAAGC 3' 2004.10.8正向插入片段的PCR(以sf-8為模板)PCR反應(yīng)體系[stock]lXrXn(25Pl)[final]無菌雙蒸水18. 75WPCR緩沖液10X2.IXdNTP混合液(1:1:1:1)250MM2. (Msri-ss/as0.0. 2,sri-sa/aa翻0.0.2MMLATag酶0. 25W0. 05 u/WSkpl全長質(zhì)粒DNA0.5W反應(yīng)程序95°C， 2min 4個(gè)循環(huán)94°C 15sec 30個(gè)循環(huán)94°C 15sec 72°C，10min-150°C 30sec 68 °C 30sec 4。C,hold72 °C 2min; 72 °C 2min;說明書第9/13頁將PCR產(chǎn)物克隆到PMD18-T載體上形成PSK1(正向片段)和PSK2(含 反向片段)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌NovaBlue菌株(美國Novagen公司)并提質(zhì) 粒，PCR檢測重組質(zhì)粒，然后用與RNAi載體相匹配的限制性酶(XhoI和 Kpnl，位于啟動(dòng)子下游和基因內(nèi)區(qū)上游，正義方向)酶切PSK1質(zhì)粒上克 隆的靶基因序列，將酶切后的靶序列以正義方向克隆到RNAi載體 pHANNIBAL(5824bp)上形成PHSK1;用與RNAi載體相匹配的限制性內(nèi)切 酶(BamHl禾QClal ，位于基因內(nèi)區(qū)下游與OSC3 '上游之間，反義方向) 分別酶切PSK2上克隆的靶基因序列和PHSK1質(zhì)粒，將酶切下來的靶基因 序列以反以方向克隆到帶有靶基因正義片段的RNAi載體PHSK1上形成 PHSK2。用Notl酶切PHSK2和二元載體PART27，然后連接二者形成 PART27-SKP1。② 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及煙草葉片外植體的遺傳轉(zhuǎn)化將PART27-SKP1經(jīng)凍融法(電激法獲三親融合法)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌 LBA4404 "gro6ac^^m mme/ac/era LBA4404)，經(jīng)質(zhì)粒提取酶切鑒定后， 將轉(zhuǎn)化的土壤農(nóng)桿菌接種到含壯觀霉素(Spec Resistance)的液體YEB培 養(yǎng)基中28'C搖床培養(yǎng)17-20h。然后用此培養(yǎng)物按葉盤法轉(zhuǎn)化煙草:取上述土 壤農(nóng)桿菌培養(yǎng)物稀釋到液體M S培養(yǎng)基中，取煙草無菌苗的幼嫩葉片剪成 小塊在該稀釋液中浸5m i n，吸去多余菌液后,放至含有2.0m g/L6芐基 腺嘌呤、200-500m g/L羧芐青霉素、謂m g/L卡那霉素和0.5m g/LIAA 的固體MS培養(yǎng)基上，在14h白天、14h黑夜的光周期和25。C條件下培養(yǎng). 約3周后,將生長至長1 c m以上的小苗轉(zhuǎn)移到含300m g/L羧芐青霉素、 100m g/L卡那霉素和5m g/LIAA的固體M S培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根.約2 3周后可見根的形成,從而得到再生完整植株.待這些完整植株生長到大約5 c m時(shí),移栽到花盆中，使之在溫室中繼續(xù)生長③ 轉(zhuǎn)基因植株的PCR分析用C T AB法從煙草葉片中分離植物總DNA.取0.5g材料于液氮中 研成粉末,移至預(yù)熱的500u L2X C T A B緩沖液中(2。/。C T A B，100mm o 1 / L T r i s C 1 ,20mm o 1 / L E D T A，1.4mm o 1 / L N a C 1 ,p H-8.0)加等體積氯仿:異戊醇抽提,2/3體積異丙醇沉淀，70%乙醇清洗.用轉(zhuǎn) 化植株的總DN A為模板，未轉(zhuǎn)化植株作負(fù)對(duì)照,進(jìn)行P C R擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng) 條件為:94。C預(yù)變性10m i n后，94。C變性lm i n，56。C退火lm i n,72°C 延伸2m i n,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72"C延伸10m i n.檢測結(jié)果為陽性的植 株。 實(shí)施例5 (1 ) SKP1煙草過表達(dá)植株的建立根據(jù)SKP1基因的序列，并參考pCAMBIA1302 T-DNA fragment的多克 隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)SKPl基因在植物中過表達(dá)的引物skplSLs和skplSLa，分別 在引物skplSLs和skplSLa的5 '端引入了 Bgl II和Spe I酶切位點(diǎn)(下劃 線部分)SKP1 上 游 表 達(dá) 弓| 物 (skplSLs )-5' CGGCCAGATCTATGTCCTCCTCAAAGATG 3'SKP1 下 游 表 達(dá) 弓i 物 (skplSLa )-5' GCCGCACTAGTCTCAAATGCCCAAGCATT 3'以pMD18-SKPl質(zhì)粒為模板，用引物skplSLs和skplSLa擴(kuò)增待表達(dá)的 SKP1基因編碼區(qū)(去掉終止密碼子)片段，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C，2min; 94°C, 15sec， 50°C, 30sec， 72。C, 2min, 4個(gè)循環(huán)；94。C，15sec，68。C,30sec,72。C, 2min, 30個(gè)循環(huán)；72"C延伸10min。將PCR反應(yīng)的產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠(含 0.5pg/ml溴化乙錠)中電泳，以DNAMarkIII做為分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)束 后在302 nm波長的紫外燈下觀察結(jié)果拍照并回從膠中收目的片段。分別用 Bgl II和Spe I酶雙酶切回收純化的SKP1基因目的片段和載體 pCAMBIA1302，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收純化目的片段，用T4 DNA連接酶將SKPl連接到雙元載體pCAMBIA1302的花椰菜花葉病毒35S 強(qiáng)啟動(dòng)子下游和GFP完全編碼區(qū)的上游，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10并 用菌落PCR初步篩選陽性重組質(zhì)粒，將PCR鑒定為陽性的克隆提取質(zhì)粒并 送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序。將pCAMBIA-SKPl經(jīng)凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404"gra6acfen^w mme/aC/e"sLBA4404)，經(jīng)質(zhì)粒提取酶切鑒定后，將轉(zhuǎn)化的土壤農(nóng)桿菌接種 到含卡那霉素的液體YEB培養(yǎng)基中28。C搖床培養(yǎng)17-20h。然后用此培養(yǎng)物 按葉盤法轉(zhuǎn)化煙草:取上述土壤農(nóng)桿菌培養(yǎng)物稀釋到液體M S培養(yǎng)基中，取煙草無菌苗的幼嫩葉片剪成小塊在該稀釋液中浸5m i n，吸去多余菌液后, 放至含有2.0mg/L6芐基腺嘌呤、200-500m g/L羧芐青霉素、100mg/ L潮霉素和0.5m g/LIAA的固體MS培養(yǎng)基上,在14h白天、14h黑夜的 光周期和25。C條件下培養(yǎng).約3周后,將生長至長1 c m以上的小苗轉(zhuǎn)移到 含300m g/L羧芐青霉素、100m g/L卡那霉素和5m g/LIAA的固體MS 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根.約2 3周后可見根的形成，從而得到再生完整植株.待這 些完整植株生長到大約5 c m時(shí)，移栽到花盆中,使之在溫室中繼續(xù)生長。 轉(zhuǎn)基因苗的鑒定同實(shí)施例4的轉(zhuǎn)基因植株的P C R分析。 實(shí)施例6SKP1在植物抗性中的作用檢測將SKP1干擾的煙草苗、SKP1過表達(dá)的煙草苗和正常的苗一起種植在 溫室內(nèi)，在煙苗長到5-6葉時(shí)，摩擦接種煙草花葉病毒。TMV由本研究組在
普通煙(Nicotiana.Tabacum丄)上活體繼代保存。取TMV繁殖寄主上較嫩 的病葉，以5倍體積0.05mol/L pH5.5磷酸緩沖液(含0.05mol/L KH2P04和 0.05mol/L Na2HP04)在研缽中研碎，用4層紗布過濾擠出汁液。加入少量 細(xì)石英砂，用毛筆蘸取汁液摩擦接種，盡量做到用力一致均勻。接毒后每 天觀察，記錄第一批病斑出現(xiàn)的時(shí)間和數(shù)目。結(jié)果為病斑全部產(chǎn)生后的統(tǒng) 計(jì)數(shù)。采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。SKP1基因干擾的煙草植株在接毒84h后開始出現(xiàn)病斑，而野生型煙草 在接毒120h后開始出現(xiàn)病斑，SKP1基因過表達(dá)的煙草植株在接毒200小 時(shí)后才出現(xiàn)病斑。說明SKP1的沉默使得植株降低了抵抗病毒增殖和(或) 其在細(xì)胞間移動(dòng)的能力，提早出現(xiàn)了過敏反應(yīng)(壞死斑)，而SKP1的過表 達(dá)使得植株增強(qiáng)了抵抗病毒增殖和(或)其在細(xì)胞間移動(dòng)的能力，使得過 敏反應(yīng)(壞死斑)推遲出現(xiàn)。分別取8-10葉期的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草14棵，半葉法接種TMV，觀 察病斑發(fā)展情況，測量病斑直徑，計(jì)算平均值。結(jié)果野生型中枯斑平均直 徑為5.9375mm，枯斑總面積占葉片總面積29.375%; SKP1干擾的轉(zhuǎn)基因 苗中枯斑平均直徑為7.1875mm，枯斑總面積占葉片總面積33.9375%。 (P <0.051檢驗(yàn)后差異顯著)，SKP1干擾的轉(zhuǎn)基因苗中枯斑平均直徑為 3.335mm,枯斑總面積占葉片總面積24.885%。此結(jié)果說明，有SKPl蛋白 表達(dá)的野生型煙草及SKP1蛋白過表達(dá)的煙草比不含此基因表達(dá)產(chǎn)物的 SKP1干擾煙草對(duì)TMV的復(fù)制有更強(qiáng)的抗性作用。因此，SKP1的正常表達(dá)， 對(duì)于維持植株的抗病性很重要。 序列表SEQUENCE LISTING <110〉中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所<120〉煙草S期激酶蛋白l基因序列及其編碼蛋白質(zhì)序列和應(yīng)用<130〉<160〉 2〈170> Patent In version 3.1〈210〉 1<211〉 653〈212〉 腿<213〉 枯斑三生煙草(Nicotiana tabacum var. samsun NN)<220〉〈221> CDS〈222〉 (73),. (537)〈223><400> 1gcattcact.c tctctctctc tctctctctc tc.tatctcaa aaaatctcaa ttctagggtt 60agggttacta eg atg tec tec tea aag atg ate gta ttg aag age teg gac 111 Met Ser Ser Ser Lys Met lie Val Leu Lvs Ser Ser Asp 1 5' lbggc gag act Uc gag gtg gag gaa gcg gtg get ttg gaa tct cag acg Glv Glu Thr Phe Glu Val Glu Glu Ala Val Ala Leu Glu Ser Gin Thr 15 20 25159ata aag cat atg att geia gat gat tgc gcc gac acc age ate ccc ctt 207lie lvs His Met lie Glu Asp Asp Cvs Ala Asp Thr Ser lie Pro Leu 303540 45cct aat gtg acc age aaa ate ttg get aag gtt ate gag tac tgc aag 255Pro Asn Val Thr Ser Lys lie leu Ala Lvs Val lie Glu Tyr Cvs Lvs50 5b 6bcgc cat gtt gat get acc aaa act gag gat aag get tct gag gal gag Arg His Val Asp Ala Thr Lvs Thr Glu Asp Lvs Ala Ser Glu Asp Ghi 65 70 75303ctt aag ggc ttt gat tct gat ttc gtt aaa gtt gac cag gcc acc eta Leu Lvs Glv Phe Asp Ser Asp Phe Val I_vs Val Asp Gin人la Thr Leu '80 85 90351Uc gat etc ate ttg get gcc aac tac ttg aac ate aag age ctg ctt Phe Asp Leu lie Leu Ala人la Asn Tvr Leu Asn lie Lvs Ser Leu Leu 95 100 105399 gat Asp 110Leu ThrCvsGinThr 115gtg Valget Ala序列表gac Aspatg Metatt lie 120Lysggg aag Gly LysThrcc3 Pro 125447lieaag li^5aat Asngac Aspttc act Phe Thrcc3 Pro MOGlu495Asn 150get Alatgg Trpgca Alatn gag Phe Glu 155537130145tgaacttt.aa atctcataat ct,ggggataa atttggaata tataatcgta tgaacaatct 597 tUgtgttag taaatatgtg agtseggtat UgcttUgg acccctgact ttgtta 653〈210〉 2〈211〉 155<2i2> PRT<213〉 枯斑三生煙草(Nicotiana tabacum var. samsun畫)〈400〉 2Met Ser Ser Ser Lvs Met 1 5lie Val Leu Lvs Ser Ser Asp Glv Gu Thr lb 15Phe Glu Val Glu Glu Ala Val Ala Leu Glu Ser Gin Thr lie Lvs His 20 25 30Met lie Glu Asp Asp Cvs Ala Asp Thr Ser lie Pro Leu Pro Asn Val 35 40 45Thr Ser Lvs Jle Leu Ala Lvs Val lie Glu Tvr Cvs Lvs Arg His Val 50 55 6bAsp Ala Thr Lvs Thr Glu Asp Lvs Ala Ser Glu Asp Glu Leu Lvs Glv 65 70 75 80Phe Asp Ser Asp Phe Val Lvs Val Asp Gin Ala Thr Leu Phe Asp Leu 85 90 95lie Leu Ala Ala Asn Tvr Leu Asn lie Lvs Ser Leu Leu Asp Leu Thr 100 105 110Cvs Gin Thr Val Ala Asp Met lie Lvs Glv Us Thr Pro Glu Glu lie 115 120 125Arg Lys Thr Phe Asn lie Lvs Asn Asp Phe Thr Pro Glu Glu Glu Glu li30 lS5 140Glu Val Arg Arg Glu Asn Ala Trp Ala Phe Glu 145 150 15權(quán)利要求
1. 一種煙草S期激酶蛋白1基因序列，其特征在于具有序列表中SEQID NO.1堿基序列。
2. —種權(quán)利要求1所述的煙草S期激酶蛋白lcDNA基因序列的編碼蛋白， 其特征在于具有序列表中SEQ IDN0.2編碼的氨基酸序列。
3. —種權(quán)利要求1所述的煙草S期激酶蛋白1的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用 基因序列的殼寡糖誘導(dǎo)植物抗性反應(yīng)，從而可將所述基因序列用于制備生 物農(nóng)藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及S期激酶相關(guān)蛋白1(S-PHASE KINASE-ASSOCIATEDPROTEIN1，SKP1)；具體地說是真核生物(煙草)中普遍存在的一類蛋白，是泛素連接酶3SCF復(fù)合體的核心亞單位，與煙草的抗病毒活性相關(guān)，分子量為17527.78Da，等電點(diǎn)4.57，定位于細(xì)胞質(zhì)，其Skp1結(jié)構(gòu)域位于4-105位氨基酸。本發(fā)明對(duì)生物農(nóng)藥的應(yīng)用具有明顯指導(dǎo)作用；該基因的克隆對(duì)于揭示殼寡糖誘導(dǎo)植物抗性反應(yīng)的分子信號(hào)通路很有價(jià)值，并在寡糖生物農(nóng)藥的應(yīng)用方面具有重要的理論指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)C12N15/54GK101210251SQ20061015582
公開日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者張付云, 杜昱光, 白雪芳 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所