專利名稱：一種紅酵母細(xì)胞以及生產(chǎn)光學(xué)純手性仲醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一種紅酵母細(xì)胞以及生產(chǎn)光學(xué)純手性仲醇的方法。
背景技術(shù)：
光學(xué)活性手性仲醇是手性藥物，如(R)-硝苯洛爾、(R)-托莫西汀，以及其它手性化學(xué)品合成的重要中間體。目前通常采用的手性仲醇制備方法包括消旋醇或酯的對(duì)映選擇性拆分以及潛手性酮的不對(duì)稱還原。如文獻(xiàn)生物加工過(guò)程，2005，3(3)1-8所介紹的方法。
酯酶或脂肪酶催化的外消旋仲醇的對(duì)映選擇性酯化或轉(zhuǎn)酯化拆分以及外消旋酯的對(duì)映選擇性水解拆分是制備光學(xué)活性手性仲醇最常用的方法，這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于目前商品脂肪酶的種類較多，針對(duì)特定的底物，能比較容易地選出具有高活力和高對(duì)映選擇性的酶。但該方法有一個(gè)最大的缺點(diǎn)，即目標(biāo)對(duì)映體產(chǎn)物的最高收率不超過(guò)50％。另外，對(duì)于脂肪酶催化的外消旋酯水解拆分，必須事先合成外消旋的底物酯，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)而言，不僅增加了操作步驟，而且增加了額外的成本。
潛手性酮的不對(duì)稱還原是制備光學(xué)活性手性醇的重要方法，該方法在理論上能將底物酮100％地轉(zhuǎn)化為單一對(duì)映體的手性醇，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值?；瘜W(xué)法對(duì)潛手性酮的不對(duì)稱還原通常使用手性氨基醇或過(guò)渡金屬配合物等作為催化劑，用化學(xué)還原劑實(shí)現(xiàn)酮的還原?；瘜W(xué)法催化的酮不對(duì)稱還原雖然具有較高的產(chǎn)率，但其主要缺點(diǎn)是反應(yīng)的立體選擇性往往不夠理想，產(chǎn)品的光學(xué)純度常常不能達(dá)到制藥行業(yè)的要求，而且手性催化劑的制備和回收比較困難，價(jià)格比較昂貴。
生物法催化的潛手性酮不對(duì)稱還原具有立體專一性高的優(yōu)勢(shì)，還原產(chǎn)物仲醇的光學(xué)純度通常很高。生物法催化酮不對(duì)稱還原所使用的生物催化劑一般包括脫氫酶制劑和微生物活性整細(xì)胞。使用分離純化的脫氫酶制劑催化酮的不對(duì)稱還原，操作簡(jiǎn)單，沒(méi)有副反應(yīng)，產(chǎn)物提取方便，但其最大缺點(diǎn)是反應(yīng)體系中需要額外添加還原型輔酶NADH或NADPH，而這些輔酶非常昂貴，難以用于大規(guī)模產(chǎn)品生產(chǎn)。目前雖然已報(bào)道了一些雙酶耦合的體外輔酶再生系統(tǒng)，但其大規(guī)模應(yīng)用還有很多問(wèn)題有待解決。而使用活性整細(xì)胞催化酮的還原相對(duì)要方便得多，細(xì)胞體內(nèi)存在完整的輔酶再生系統(tǒng)，只需加入適量的輔底物(如葡萄糖或乙醇等)，即可進(jìn)行輔酶的自發(fā)循環(huán)再生，無(wú)須額外添加價(jià)格昂貴的還原型輔酶，并且整細(xì)胞的使用可以免去酶的提取純化過(guò)程，更適合于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
面包酵母是一種常用的生物還原催化劑，但是面包酵母細(xì)胞內(nèi)含有多種立體選擇性不同甚至完全相反的羰基還原酶組分，當(dāng)應(yīng)用于潛手性酮的不對(duì)稱還原反應(yīng)時(shí)，其產(chǎn)物手性仲醇的光學(xué)純度往往比較低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開一種紅酵母細(xì)胞以及生產(chǎn)光學(xué)純手性仲醇的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的紅酵母細(xì)胞(Rhodotorula sp.ECU316-1)是一種屬于紅酵母屬的菌種，該菌種是從上海植物園的土壤中分離，并經(jīng)過(guò)多輪紫外誘變篩選后獲得的，于2006年6月14日在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC1735。
本發(fā)明的菌種具有如下的微生物學(xué)特征1.形態(tài)特征(1)細(xì)胞的形態(tài)和大小卵形，2.3～5.0×4.0～10.0μ m；(2)擲胞子的形成無(wú)；2.在各種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)(1)牛肉浸膏瓊脂平板培養(yǎng)(30℃，36小時(shí))菌落形狀圓形；菌落表面隆起平滑、有光澤、菌落粘稠大小2～4mm；色調(diào)粉紅色。
(2)牛肉浸膏明膠穿刺培養(yǎng)(20℃，6天)不液化明膠3.生理生化特征(1)硝酸鹽利用(28℃，5天)能利用；(2)胞外類淀粉化合物產(chǎn)生不產(chǎn)生；(3)尿素水解陽(yáng)性(4)甲基紅試驗(yàn)陰性；
(5)對(duì)氧的需求好氣；(6)高滲培養(yǎng)基耐受性能耐受含20％NaCl的高滲培養(yǎng)基(7)碳源同化陽(yáng)性葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、淀粉和肌醇陰性乳糖(8)碳源發(fā)酵不發(fā)酵碳源(9)生長(zhǎng)pH范圍5.0～8.0；(10)生長(zhǎng)最適宜溫度25～35℃；根據(jù)文獻(xiàn)“酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)”提供的鑒定方法和上述的試驗(yàn)結(jié)果表明，該細(xì)胞屬于紅酵母菌類群，但又與以前報(bào)道的紅酵母細(xì)胞有明顯的不同，其主要不同之處在于一般的紅酵母細(xì)胞不能耐受高滲培養(yǎng)基，而本發(fā)明的紅酵母細(xì)胞能耐受高滲培養(yǎng)基，并且對(duì)許多底物的對(duì)映選擇性有顯著提高，如催化還原產(chǎn)物對(duì)硝基苯乙醇的ee值由原先的96％提高到高于99％。
本發(fā)明的紅酵母Rhodotorula sp.ECU316-1可以用于生產(chǎn)光學(xué)純手性仲醇，包括如下步驟(1)對(duì)紅酵母Rhodotorula sp.ECU316-1進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為葡萄糖10～30g/L，酵母膏0～20g/L，蛋白胨0～20g/L，KH2PO41～5g/L，NaCl1～10g/L，MgSO40.5～5g/L，pH6～8，搖瓶裝液量為10～30％，基于培養(yǎng)基的體積，接種量為2～10％，培養(yǎng)溫度為25～40℃，搖床轉(zhuǎn)速為100～200rpm，培養(yǎng)時(shí)間為15～30hr。
(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基配方與搖瓶培養(yǎng)基配方相同，發(fā)酵罐裝液量以體積計(jì)為60～80％，基于培養(yǎng)基的體積的2～10％的比例接入種子液。培養(yǎng)溫度為25～40℃，通氣量為0.5～1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300～600rpm，發(fā)酵時(shí)間為20～35hr。離心收獲細(xì)胞。
(3)直接用紅酵母整細(xì)胞或?qū)⑵涔潭ɑ笞鳛樯锎呋瘎?，置于水或水與有機(jī)溶劑的兩相體系中，催化底物酮的不對(duì)稱還原，然后從反應(yīng)產(chǎn)物中收集還原產(chǎn)物——光學(xué)純的手性仲醇，具體包括如下步驟將紅酵母整細(xì)胞或固定化后的紅酵母細(xì)胞置于水、緩沖液或水與有機(jī)溶劑的兩相體系中，使細(xì)胞濃度為50～500g(濕重)/L，加入羰基底物，羰基底物濃度為10～200mM，反應(yīng)溫度為25～40℃，反應(yīng)時(shí)3～48小時(shí)，并通過(guò)薄板層析監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行的程度，待反應(yīng)完成后，從反應(yīng)產(chǎn)物中收集還原產(chǎn)物——光學(xué)純的手性仲醇，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到95％以上。
所說(shuō)的羰基底物的結(jié)構(gòu)通式為R1COR2；其中R1和R2分別代表-CH3，-CH2CH3，-CH2X，-CH2CH2X，-C6H5，-C6H4X，且R1和R2不相同；X代表F，Cl，Br，I，OH，NH2，NO2，N3；優(yōu)選的羰基底物選自苯環(huán)、甲基取代的苯乙酮衍生物、乙酰吡啶衍生物、α-酮酯或β-酮酯；所說(shuō)的緩沖液可選用pH為6-8的磷酸鉀緩沖液或Tris-HCl緩沖液；所說(shuō)的有機(jī)溶劑選自環(huán)己烷、正己烷、正庚烷、異辛烷、異丙醚、甲基叔丁基醚或甲苯等溶劑其中的一種，有機(jī)相與水相的體積比為1∶5至5∶1；所說(shuō)的固定化后的紅酵母細(xì)胞是海藻酸鈣包埋的紅酵母細(xì)胞，制備方法如下將紅酵母濕細(xì)胞與海藻酸鈉水溶液混合，濕細(xì)胞終濃度為10～30％，海藻酸鈉終濃度為2～4％。將混合物逐滴滴入濃度為0.05～0.2M的CaCl2溶液中，凝固成球。生成的固定化細(xì)胞凝膠顆粒在8～12mM CaCl2溶液中固化10～12小時(shí)，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>
按照本發(fā)明優(yōu)選的方法，反應(yīng)體系中可以添加幫助底物分散的表面活性劑，優(yōu)選的表面活性劑為吐溫-80，加入量為反應(yīng)體系質(zhì)量的0.2％～5％。
采用本發(fā)明的紅酵母細(xì)胞生產(chǎn)光學(xué)純手性仲醇，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，底物的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到95％以上，能夠合成高光學(xué)純度(＞99％)的手性仲醇，而且催化劑易于制備、反應(yīng)條件溫和、底物適應(yīng)性廣，具有很好的工業(yè)應(yīng)用開發(fā)前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1培養(yǎng)基配方為葡萄糖15g/L，酵母膏7.5g/L，蛋白胨7.5g/L，KH2PO41.0g/L，NaCl1.0g/L，MgSO40.5g/L，pH7.0。121℃高溫滅菌20min。
取4℃保存的紅酵母斜面菌種，挑取一環(huán)接種至裝有50ml培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在30℃下，160rpm振搖培養(yǎng)20hr，按5％的接種量轉(zhuǎn)接至盛有100ml培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，于160rpm、30℃繼續(xù)培養(yǎng)20hr，離心收獲細(xì)胞。發(fā)酵液酶活力約為20U/L，細(xì)胞濃度約40g(濕重)/L，單位細(xì)胞的酶活為0.5U/g濕細(xì)胞。
細(xì)胞活力單位定義為30℃，pH7.0的條件下，每分鐘催化苯乙酮還原生成1.0μmol苯乙醇所需的細(xì)胞量。
實(shí)施例2發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖30g/L，酵母膏15g/L，蛋白胨15g/L，KH2PO42.0g/L，NaCl1.0g/L，MgSO40.5g/L，調(diào)節(jié)pH為7.0。121℃高溫滅菌20min。
種子液培養(yǎng)基同實(shí)施例1。挑取斜面菌種，分別接種至裝100ml培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，在30℃，160rpm振搖培養(yǎng)20hr，按5％的接種量轉(zhuǎn)接至盛有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L攪拌發(fā)酵罐中，通氣量為3.0L/min，培養(yǎng)溫度恒定為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm。發(fā)酵培養(yǎng)30h，離心收獲細(xì)胞。發(fā)酵液酶活力為79.5U/L。
實(shí)施例3在50g濕細(xì)胞中加入100ml生理鹽水(0.9％NaCl溶液)，懸浮調(diào)勻，隨后與預(yù)先加熱溶解的海藻酸鈉溶液混合，加水定容至250ml，攪拌均勻，海藻酸鈉終濃度為2.5％(w/v)。將此混合物逐滴滴入0.1M的CaCl2溶液中，凝固成球。生成的固定化細(xì)胞凝膠顆粒在10mM CaCl2溶液中固化12h，然后儲(chǔ)存于4℃，待用。
實(shí)施例4～13紅酵母整細(xì)胞催化苯乙酮衍生物的不對(duì)稱還原取12g紅酵母濕細(xì)胞懸浮于100mL磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.0)中，分別加入1.0mmol不同結(jié)構(gòu)的底物羰基化合物，反應(yīng)混合物在30℃，160rpm條件下在恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，間歇取樣測(cè)定反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化完全時(shí)結(jié)束反應(yīng)。8,000×g離心8min，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液加無(wú)水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用硅膠柱層析法純化粗產(chǎn)品，用手性氣相、液相色譜或通過(guò)比旋光度的測(cè)定分析產(chǎn)物的光學(xué)純度。反應(yīng)結(jié)果以及產(chǎn)物的構(gòu)型和光學(xué)純度如下表所示。
實(shí)施例14～16紅酵母整細(xì)胞催化乙酰吡啶的不對(duì)稱還原取12g紅酵母濕細(xì)胞懸浮于100mL磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.0)中，分別加入10.0mmol的羰基底物乙酰吡啶，反應(yīng)混合物在30℃，160rpm條件下在恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，間歇取樣測(cè)定反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化完全時(shí)結(jié)束反應(yīng)。8,000×g離心8min，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液加無(wú)水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用硅膠柱層析法純化粗產(chǎn)品，用手性氣相色譜分析產(chǎn)物的光學(xué)純度。反應(yīng)結(jié)果以及產(chǎn)物的構(gòu)型和光學(xué)純度如下表所示。
實(shí)施例17～23紅酵母整細(xì)胞催化α-酮酯以及β-酮酯的不對(duì)稱還原取12g紅酵母濕細(xì)胞懸浮于100mL磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.0)中，分別加入不同濃度的α-酮酯或β-酮酯，反應(yīng)混合物在30℃，160rpm條件下在恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng)，間歇取樣測(cè)定反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100％時(shí)結(jié)束反應(yīng)。8,000×g離心8min，上清液用乙酸乙酯萃取，萃取液加無(wú)水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用硅膠柱層析法純化粗產(chǎn)品，用手性氣相、液相色譜或通過(guò)比旋光度的測(cè)定分析產(chǎn)物的光學(xué)純度。反應(yīng)結(jié)果以及產(chǎn)物的構(gòu)型和光學(xué)純度如下表所示。
實(shí)施例24取15g紅酵母濕細(xì)胞，放在500ml搖瓶中，加入含有1g葡萄糖的100ml磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.0)重新懸浮細(xì)胞，加入100ml異辛烷和0.6ml苯乙酮，在恒溫?fù)u床上，恒溫30℃，160rpm條件下振搖反應(yīng)30h，獲得(S)-1-苯乙醇，轉(zhuǎn)化率為96％。
實(shí)施例25取100g海藻酸鈣包埋固定化細(xì)胞，放在500ml搖瓶中，加入200ml Tris-HCl緩沖液(50mM，pH 7.0)，2g葡萄糖，1.2ml苯乙酮和0.4g吐溫-80，在恒溫?fù)u床上，恒溫30℃，160rpm反應(yīng)24h，獲得(S)-1-苯乙醇，轉(zhuǎn)化率為95％。
實(shí)施例26在2L攪拌反應(yīng)器中，加入200g紅酵母濕細(xì)胞，1.0L自來(lái)水，10g葡萄糖，6ml苯乙酮，2g吐溫-80，反應(yīng)溫度恒定為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，反應(yīng)17h，獲得(S)-1-苯乙醇，轉(zhuǎn)化率98％。
用500ml乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，重復(fù)兩次，合并萃取液，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮液過(guò)硅膠柱分離，洗脫液比例為石油醚/乙酸乙酯＝5∶1，合并含有產(chǎn)物苯乙醇的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得產(chǎn)品5.1g。以手性氣相色譜分析，產(chǎn)物的光學(xué)純度為99.1％ee。
權(quán)利要求
1.一種紅酵母細(xì)胞Rhodotorula sp.ECU316-1，保藏號(hào)為CGMCC1735。
2.一種以紅酵母細(xì)胞催化劑制備光學(xué)純手性仲醇的方法，其特征在于該方法包括先培養(yǎng)保藏號(hào)為CGMCC1735的紅酵母細(xì)胞(Rhodotorula sp.ECU316-1)，然后再將該培養(yǎng)物或?qū)⑵涔潭ɑ笾糜谒?、緩沖液或水與有機(jī)溶劑的兩相體系中，加入羰基底物，催化羰基底物的不對(duì)稱還原，然后從反應(yīng)產(chǎn)物中收集還原產(chǎn)物——光學(xué)純的手性仲醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，水、緩沖液或水與有機(jī)溶劑的兩相體系中，細(xì)胞濃度為50～500g(濕重)/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，羰基底物濃度為10～200mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，反應(yīng)溫度為25～40℃，反應(yīng)時(shí)間為3-48小時(shí)，所說(shuō)的緩沖液pH為6-8。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的有機(jī)溶劑選自環(huán)己烷、正己烷、正庚烷、異辛烷、異丙醚、甲基叔丁基醚或甲苯等溶劑其中的一種，有機(jī)相與水相的體積比為1∶5至5∶1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的固定化后的紅酵母細(xì)胞是海藻酸鈣包埋的紅酵母細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系中可以添加幫助底物分散的表面活性劑，優(yōu)選的表面活性劑為吐溫-80，加入量為反應(yīng)體系質(zhì)量的0.2％～5％。
9.根據(jù)權(quán)利要求2～8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的羰基底物的結(jié)構(gòu)通式為R1COR2；其中R1和R2分別代表-CH3，-CH2CH3，-CH2X，-CH2CH2X，-C6H5，-C6H4X，且R1和R2不相同；X代表F，Cl，Br，I，OH，NH2，NO2，N3。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，羰基底物選自苯環(huán)或甲基被取代的苯乙酮衍生物、乙酰吡啶衍生物、α-酮酯或β-酮酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅酵母細(xì)胞(Rhodotorulasp.ECU316－1)，保藏號(hào)為CGMCC1735，以及生產(chǎn)光學(xué)純手性仲醇的方法。采用本發(fā)明的紅酵母細(xì)胞生產(chǎn)光學(xué)純手性仲醇，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，底物的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到95％以上，能夠合成高光學(xué)純度(＞99％)的手性仲醇，且催化劑易于制備、反應(yīng)條件溫和、底物適應(yīng)性廣，具有很好的工業(yè)應(yīng)用開發(fā)前景。
文檔編號(hào)C12P7/02GK1869197SQ20061002835
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者許建和, 潘江, 楊巍, 陸幫榮, 朱月珍 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué), 金壇市華英化工廠