專利名稱：細胞制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在封閉系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選遺傳修飾細胞的方法。
背景技術(shù)：
目前，通常使用開放系統(tǒng)來轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選遺傳修飾細胞。然而，此類系統(tǒng)可能費時且可能與重大污染風(fēng)險有關(guān)。當(dāng)細胞將用于臨床環(huán)境時及當(dāng)需要高劑量時尤其如此。此類需求的例子是生產(chǎn)供體T細胞用于同種異體骨髓移植。
同種異體骨髓移植是治療許多血液惡性腫瘤的選擇(Thomas 1983，J Clin Oncol1517；O′Reilly 1993，Curr Op In Hematol 221)。
在同種異體骨髓移植的情況中，普遍知道供體T淋巴細胞通常完全根除腫瘤的免疫學(xué)作用。衍生自供體T淋巴細胞的抗腫瘤作用(移植物抗白血病，GvL)使得該治療方法優(yōu)于常規(guī)化療和自體移植。
此外，供體T淋巴細胞的灌注還能介導(dǎo)針對病毒和真菌的免疫反應(yīng)的重建，這一點通過在未操作移植較之那些T淋巴細胞耗盡移植的情況中有較低的此類感染發(fā)生率和嚴重性而得到論證(Papadopoulos 1994，N Engl J Med 3301185；Rooney1995，The Lancet 3459；Heslop 1996，Nature Med 2551；Rooney l998，Blood 921549；Riddel 1992，Science 257；Walter 1995，N Engl JMed 3331038)。
面對引入抗腫瘤作用的明確臨床益處，供體T淋巴細胞的灌注仍伴隨著移植物抗宿主病(GvHD)發(fā)展的風(fēng)險升高。這是因為供體淋巴細胞產(chǎn)生針對宿主組織的凝集，特征在于死亡率和發(fā)病率升高，尤其是在接受來自相關(guān)半相合(haploidentical)供體的移植物的患者中(Kolb 1995，Blood 862041；Collins 1997，JClin Oncol 15433；Porter 2000，Blood 951214)。
疾病的發(fā)生率和嚴重性與灌注淋巴細胞的數(shù)量成正比，即劑量越大，疾病越嚴重。因為臨床益處在抗腫瘤和抗病毒活性方面與灌注劑量成正比，故增加劑量將提升抗腫瘤益處，但同時也提高了GvHD的風(fēng)險。沒有針對GvHD的特異治療，而使用中的基于類固醇和其它免疫抑制劑的那些療法是非特異性的且伴隨著嚴重感染和疾病復(fù)發(fā)的發(fā)生率升高。
為了獲得免疫學(xué)重建并在能選擇性控制出現(xiàn)的GvHD的同時降低感染事件和疾病復(fù)發(fā)的發(fā)生率，一種有前景的策略是使用轉(zhuǎn)導(dǎo)有含自殺基因和標(biāo)志基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的供體淋巴細胞。自殺基因使遺傳修飾細胞對稍后將用于在出現(xiàn)GvHD的情況中選擇性消除灌注細胞的藥物敏感。標(biāo)志基因的存在允許跟蹤遺傳修飾細胞的存活、擴增和遷移部位。
例如，可使用SFCMM-3載體，它帶有自殺基因HSV-tk和標(biāo)志基因ΔLNGFR二者(Verzeletti 98，Human Gene Therapy 92243)。HSV-tk編碼單純皰疹病毒I的胸苷激酶(HSV-tik)，它一旦插入供體淋巴細胞，使它們對更昔洛韋(ganciclovir)選擇性敏感。在施用于患者后，藥物更昔洛韋被遺傳修飾細胞表達的胸苷激酶磷酸化，接著被細胞激酶繼續(xù)磷酸化。更昔洛韋的活性形式抑制基因組DNA的合成，從而引起胞死亡(Smee 1983，Antimicrobials Agents and Chemotherapy 4504)。HSV-tk自殺系統(tǒng)早已在不同的臨床研究中得到論證(Bordignon 1995，Hum Gene Ther 2813；Bonini 1997，Science 2761719；Tiberghien 1997，Hum Gene Ther 8615；Tiberghien2001，Blood 9763；Link 1998，Hum Gene Ther 9115；Champlin 1999，Blood 941448)。
LNGFR基因編碼神經(jīng)生長因子(NGF)的低親和力受體，它的胞內(nèi)部分遭到刪除以致其不能再傳遞信號(ΔLNGFR)(Mavilio 1994，Blood 831988)。使用單克隆抗體和磁珠，ΔLNGFR蛋白質(zhì)的存在允許體外免疫篩選遺傳修飾細胞。而且，ΔLNGFR蛋白質(zhì)的表達可用作遺傳修飾細胞的標(biāo)志，一旦灌注到患者體內(nèi)允許證明此類細胞的存在、擴增或減少，并用于表征它們的淋巴細胞亞型和激活狀態(tài)方面。
上述臨床研究(Bordignon 1995，Hum Gene Ther 2813；Bonini 1997，Science 2761719；Tiberghien 1997，Hum GeneTher 8615；Tiberghien 2001，Blood 9763；Link1998，Hum GeneTher 9115；Champlin 1999，Blood 941448)依賴不同方法來生成遺傳修飾淋巴細胞(終產(chǎn)品)。所述方法包括細胞解凍，激活，轉(zhuǎn)導(dǎo)，篩選，擴增和回收終產(chǎn)品用于患者灌注。在患者灌注前測試的終產(chǎn)品的安全性與所述工序每個步驟的細胞操作有關(guān)。通常，這些方法在使用搖瓶進行細胞培養(yǎng)和使用層流操作臺進行細胞操作諸如轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選的開放系統(tǒng)中建立。目前，使用開放系統(tǒng)來生成轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞用于臨床方案。然而，這樣的系統(tǒng)可能是費時的，而且可能與重大污染風(fēng)險有關(guān)。
因此，需要一種安全有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選遺傳修飾細胞的方法。
發(fā)明概述通過提供在封閉系統(tǒng)中進行細胞操作和培養(yǎng)的方法，本發(fā)明克服了上文提到的問題。開放系統(tǒng)到封閉系統(tǒng)的轉(zhuǎn)變，允許擴大產(chǎn)品的規(guī)模并提高產(chǎn)品臨床使用的安全性。
在本發(fā)明的一個方面，提供了用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞并篩選此類遺傳修飾細胞的方法，該方法包括在封閉系統(tǒng)中進行轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了修飾細胞的方法，包括(i)任選解凍所述細胞；(ii)任選刺激所述細胞；(iii)用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細胞；(iv)篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞；以及(v)擴增和收獲所述轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞其中步驟(i)至(v)在封閉系統(tǒng)中進行。
封閉系統(tǒng)是可防止細胞暴露于系統(tǒng)外環(huán)境的隔離系統(tǒng)。細胞僅暴露于構(gòu)成封閉系統(tǒng)的袋、管和機械部件這些直接環(huán)境。
本發(fā)明的封閉系統(tǒng)可防止轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的污染。它達到這一點是通過確保細胞與系統(tǒng)外部環(huán)境的密封隔絕，防止污染物進入系統(tǒng)。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法不包括人工轉(zhuǎn)移流體。
優(yōu)選的是，使用用于細胞操作的自動流體管理設(shè)備洗滌、濃縮和重懸細胞。
在一個實施方式中，所述遺傳構(gòu)建體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
優(yōu)選的是，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是鼠白血病病毒(MLV)衍生載體。
優(yōu)選的是，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼能被特異抗體識別的細胞表面標(biāo)志，諸如例如ΔLNGFR。
在一個實施方式中，所述細胞是供體T細胞。
優(yōu)選的是，所述方法包括使用纖連蛋白或其變體的轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。先前的研究表明，胞外基質(zhì)分子的有些胰凝乳蛋白酶消化片段在感染過程中使用時可提高人造血祖細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Moritz et al.，(1994)J.Clin.Invest.93，1451；Moritz et al.，(1996)Blood 88，855)。Takara已開發(fā)出人纖連蛋白的重組肽CH-296(RetroNectin)，它由三個功能結(jié)構(gòu)域組成(Hanenberg et al.，(1996)Nature Medicine 2，876)，且已證明增強逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(Kimizuka et al.，(1991)J. Biochem.～110，284)。在包被到皮氏培養(yǎng)皿、搖瓶或袋的表面上后，RetroNectin顯著增強進入哺乳動物細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。
優(yōu)選的是，在本發(fā)明中使用RetroNectin轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法包括轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的免疫篩選。例如，用標(biāo)志基因ΔLNGFR轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，可以根據(jù)它們與抗LNGFR抗體的反應(yīng)性來篩選。
更優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法包括免疫磁性篩選。免疫磁性篩選涉及將抗體偶聯(lián)到能夠利用磁性分離抗原性結(jié)構(gòu)的順磁顆粒上。例如，可將表達ΔLNGFR細胞表面分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的遺傳修飾亞群與結(jié)合ΔLNGFR陽性細胞的小鼠IgG抗NGF受體抗體一起溫育。然后可將所述細胞與包被有綿羊抗小鼠IgG的免疫磁珠一起溫育，并使用磁體來分離ΔLNGFR陽性細胞?？赏ㄟ^取走磁體來回收分離的細胞。
封閉系統(tǒng)可以包括執(zhí)行獲得分離的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞所必需的所有步驟的單一設(shè)備。
可選的是，封閉系統(tǒng)可包括兩種或多種設(shè)備。第一設(shè)備可用于細胞濃縮、細胞洗滌、轉(zhuǎn)導(dǎo)及培養(yǎng)基更換步驟，而第二設(shè)備可執(zhí)行轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞篩選。所述設(shè)備之間的細胞轉(zhuǎn)移可使用密封袋和無菌連接來實現(xiàn)，以確保整個過程保持封閉過程。優(yōu)選的是，使用用于細胞操作的自動流體管理設(shè)備洗滌、濃縮、轉(zhuǎn)導(dǎo)和重懸細胞。所述設(shè)備可以在允許逐步用戶自定義編程的完全封閉系統(tǒng)中包括轉(zhuǎn)膜(spinningmembrane)，它確保細胞針對逆流緩沖液循環(huán)過濾且與不同袋連接。細胞洗滌和濃縮可以在一次性無菌裝置中進行，該裝置由與濾洗袋、緩沖袋及廢棄袋連接的轉(zhuǎn)膜組成。可由用戶定義期望的洗滌流程。此類設(shè)備的實例是CytomateTM細胞處理系統(tǒng)。
前期處理的終產(chǎn)品可濃縮在袋中。然后可將該袋與第二管道裝置無菌連接，以開始使用順磁微球(珠)的篩選步驟。適用于該步驟的裝置的實例是IsolexTM300磁性細胞分離系統(tǒng)。
圖1所示工藝流程概括了依照本發(fā)明制備遺傳修飾細胞可能需要的步驟。
根據(jù)臨床研究，可以操作不同的生物學(xué)起始材料?？梢允÷砸粋€或多個步驟。在一個實施方案中，暗區(qū)中的步驟可以省略。
本發(fā)明涉及在封閉系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選優(yōu)選用于臨床的遺傳修飾細胞的方法。
具體而言，本發(fā)明可包括解凍(僅在冷凍細胞用作起始材料的情況中需要)、激活(是否需要基于細胞和載體特性)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選(例如使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)、擴增及收獲用于臨床的患者特異細胞的連續(xù)步驟。整個工序可在短時間內(nèi)進行，例如少于兩周。
封閉系統(tǒng)可以用于每一步驟，包括細胞洗滌、培養(yǎng)基更換、為轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選進行的溫育、以及最終收獲用于將細胞灌注到患者體內(nèi)。
在一個實施方案中，使用能夠進行兩類不同操作的一次性塑料材料和設(shè)備開發(fā)出的封閉系統(tǒng)確保了終產(chǎn)品的安全性1)細胞濃縮/洗滌/培養(yǎng)基更換；2)磁性篩選。
具體而言，本發(fā)明可成功用于生產(chǎn)將用于同種異體骨髓移植臨床方案的遺傳修飾T細胞。
例如，可以使用以下設(shè)備；1)CytoMateTM細胞處理系統(tǒng)(Nexell Therapeutic公司的商標(biāo))(Baxter，codeR4R9860)，用于臨床級封閉式一次性試劑盒中的細胞操作(一次性細胞清洗裝置，Baxter，code R4R9811)；2)IsolexTM300磁性細胞分離系統(tǒng)，用于篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。
用于解凍后洗滌細胞的CytoMateTM細胞處理系統(tǒng)的實例及用于臨床規(guī)模分離細胞的磁性細胞篩選器的實例分別在Calmels 2003，Bone Marrow Transplant 31823和Suen 2001，Cytotherapy 3365中有記載。
使用能在臨床中心為簡易操作細胞標(biāo)準(zhǔn)化的完全封閉系統(tǒng)，本發(fā)明在單一方法中集合了不同步驟細胞的解凍、刺激、轉(zhuǎn)導(dǎo)、篩選、擴增、以及回收終產(chǎn)物用于患者灌注。
本發(fā)明的優(yōu)點包括在單一方法中組合了不同步驟，提高了終產(chǎn)品安全性，以及簡化了細胞操作。
現(xiàn)在將通過非限制性實施例的方式并參考附圖來描述本發(fā)明的更多優(yōu)選特征和實施方案，其中附圖簡述圖1顯示的工藝流程圖概括了制備遺傳修飾細胞可能需要的步驟。
圖2顯示了刺激和轉(zhuǎn)導(dǎo)方法對細胞擴增的影響。通過在每個指定時間點對細胞計數(shù)并除以第0天接種的細胞數(shù)來評估擴增倍數(shù)。
圖3顯示了刺激和轉(zhuǎn)導(dǎo)方法對轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。通過流式細胞術(shù)評估了第6天的LNGFR陽性細胞百分率。
圖4顯示了珠細胞比率對細胞擴增的影響。通過在每個指定時間點對細胞計數(shù)并將存活細胞數(shù)除以第0天接種的細胞數(shù)來評估擴增倍數(shù)。
圖5顯示了珠細胞比率對轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。通過流式細胞術(shù)評估了第6天的LNGFR陽性細胞百分率。
實施例1解凍后從供體淋巴細胞洗去DMSO本發(fā)明提供了使用臨床級一次性封閉試劑盒中的細胞操作設(shè)備在完全封閉系統(tǒng)中進行細胞操作和培養(yǎng)的方法。
在本實施例中，使用CytoMateTM作為細胞操作的自動流體管理設(shè)備。它由在允許逐步用戶自定義編程的完全封閉系統(tǒng)中確保細胞針對逆流緩沖液循環(huán)過濾且與不同袋連接的轉(zhuǎn)膜組成。
細胞洗滌和濃縮在一次性無菌裝置中進行，該裝置由與濾洗袋、緩沖袋及廢棄袋連接的轉(zhuǎn)膜組成。該系統(tǒng)容許在GMP環(huán)境中進行細胞處理。由用戶定義洗滌流程，將裝有(待處理的)樣品的袋與無菌裝置連接，并通過四種重量標(biāo)度和探測器監(jiān)測由所述流程定義的不同袋之間的流體轉(zhuǎn)移。
簡單的菜單驅(qū)動界面容許為多達100個自定義流程編程。
洗滌效率通過在洗滌程序中設(shè)置“殘留倍數(shù)減少”參數(shù)來定義。
用于生成上文定義的遺傳修飾細胞的起始材料可以由新鮮或冷凍細胞(來自成分血(apheresis)、血沉棕黃層(buffy-coat)、全外周血、臍帶血、骨髓)組成，在使用冷凍細胞時，將它們解凍，且為了刺激細胞以進行細胞培養(yǎng)而在解凍后洗去DMSO，即冷凍培養(yǎng)基的防凍成分(10％)。
將樣品袋(一個或多個)與一次性裝置(Baxter code R4R9811)的細胞源管道連接后，將細胞用冷的解凍緩沖液(X-Vivo 15，加有1％谷氨酰胺及600IU IL-2)稀釋兩次，第一次10ml，速率5ml/min，第二次20ml，速率10ml/min。在這些操作過程中，將解凍袋(一個或多個)鋪放于冰層或冰袋上，并輕輕搖動以重懸細胞和避免細胞沉降。
然后用轉(zhuǎn)膜洗滌和濃縮細胞，并轉(zhuǎn)移至收集袋中；用130ml緩沖液漂洗來源袋、洗滌袋和管道，以使細胞損失降至最低。簡單的說，使細胞懸浮液通過轉(zhuǎn)膜，在那里細胞在膜外濃縮并從頂端出口排出，而含細胞碎片和DMSO的上清液通過膜從底端出口排出。
洗滌步驟的效率和時間長度取決于選擇的參數(shù)“殘留倍數(shù)減少”，它定義了洗滌的程度，即洗滌流程中初始流體移除的程度。該參數(shù)值可選擇1-1000。根據(jù)CytoMateTM客戶編程指南的Nexell數(shù)據(jù)，選擇數(shù)值100；該值將導(dǎo)致來源溶液減少約2個對數(shù)(log)。終體積通常在100-250ml之間，這取決于兩個可選擇的參數(shù)初始細胞數(shù)和最大洗滌袋終末重量，根據(jù)CytoMateTM客戶編程指南的Nexell數(shù)據(jù)，選擇數(shù)值250作為默認設(shè)置。
在洗滌流程結(jié)束時，可采集一份細胞樣品并評估細胞存活率和細胞數(shù)；然后可根據(jù)細胞數(shù)以細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基作為洗滌緩沖液稀釋細胞懸浮液；該細胞準(zhǔn)備好在培養(yǎng)基中以1×106/ml的濃度接受刺激。
包括最終細胞稀釋在內(nèi)的洗滌流程的時間長度為約1小時。
使用上文所述洗滌流程以單一洗滌步驟進行了兩種不同實驗。在這些實驗中，評估了不同參數(shù)初始和終末體積，以評估具有小體積細胞懸浮液的起始樣品的洗滌可行性；初始和終末細胞數(shù)，以評估解凍和洗滌步驟中的細胞損失；整個流程的時間長度，以推測該流程與開放系統(tǒng)相比是否耗時較少；所用洗滌緩沖液體積，以評估試劑消耗。
在下文描述的實驗中，起始材料是一袋來自健康供體血沉棕黃層的冷凍PBL起始材料的體積是15ml，但是可以在一個或多個袋中處理更大范圍的細胞體積。
袋中的細胞數(shù)總計約1×109個，但是待處理細胞數(shù)的范圍可以是一個或多個袋中裝有的0.1×109-100×109之間。
根據(jù)使用Cyt0MateTM洗去DMSO的文獻數(shù)據(jù)(Calmels B.et al.，Bone MarrowTransplant.2003 May；31(9)823-8)，來源溶液(含DMSO和細胞碎片)減少值選擇2個對數(shù)(即“殘留倍數(shù)減少”值100，由用戶在洗滌程序中設(shè)定)，但是數(shù)值50早已足夠清除超過96％的DMSO了。
表1顯示了在使用來自不同供體血沉棕黃層的細胞的三個獨立實驗中獲得的結(jié)果。
表1
存活率＝存活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100，該測試用錐蟲藍染色進行回收率＝終末細胞數(shù)/初始細胞數(shù)×100*＝細胞冷凍日評估細胞數(shù)用于減少來源溶液的一種可選方法是設(shè)置二次洗滌的程序。每個程序由用戶逐步自定義。
該流程遵循上文所述相同原理，但是增加了一個二次洗滌步驟。在這種情況中，流程的時間長度延長至1小時20分鐘，且解凍緩沖液體積增加至1100ml。
使用增加了二次洗滌的流程進行了三個實驗。
在這些實驗中，評估了上文所述相同參數(shù)初始體積(樣品袋中細胞懸浮液的體積)和終末體積，以評估具有小體積細胞懸浮液的起始樣品的洗滌可行性；初始和終末細胞數(shù)，以評估解凍和洗滌步驟中的細胞損失；整個流程的時間長度，以推測該流程與開放系統(tǒng)相比是否耗時較少；所用洗滌緩沖液體積，以評估試劑消耗。
在下文描述的實驗中，起始材料在實驗4中是一袋來自健康供體血沉棕黃層的冷凍PBL，而在實驗5中是一袋來自健康供體成分血的冷凍PBL，但是該流程可應(yīng)用于例如臍帶血或骨髓樣品。
起始材料的體積是20-100ml，但是待處理細胞體積的范圍可以是一個或多個袋中裝有的1ml-9999ml之間。
袋中的細胞數(shù)是約1×109個，但是待處理細胞數(shù)的范圍可以是一個或多個袋中裝有的0.1×109-100×109之間。
表2顯示了使用來自不同供體血沉棕黃層或成分血的細胞的兩個獨立實驗的結(jié)果。
表2
存活率＝存活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100，該測試用錐蟲藍染色進行回收率＝終末細胞數(shù)/初始細胞數(shù)×100*＝在該實驗中，起始樣品事先解凍，并在袋中用解凍緩沖液稀釋至100ml+＝細胞冷凍日評估細胞數(shù)討論5個實驗中有4個的樣品初始體積在15-20ml之間的范圍內(nèi)，只有1個實驗的起始樣品用解凍緩沖液稀釋至總體積100ml。
●這些實驗的結(jié)果顯示，初始體積對解凍后細胞的回收率和存活率沒有重大影響。
前4個實驗的平均細胞回收率確實是92％，標(biāo)準(zhǔn)偏差5.7％(范圍85-100％)，而第5個實驗的數(shù)值83％接近該范圍。
平均細胞存活率為91.5％，標(biāo)準(zhǔn)偏差5.9％(范圍87-100％)，而第5個實驗的數(shù)值100％在該范圍內(nèi)。
實驗表明，解凍步驟可以以小體積15-20ml及更高體積的起始樣品起動進行。
●關(guān)于細胞損失，解凍后及用CytoMateTM洗滌細胞前進行了初始細胞數(shù)測試的實驗1和3顯示出最大細胞損失9％。
●在實驗2、4、5中，將冷凍前的細胞數(shù)看作初始細胞數(shù)。這可能表示高估了真實初始數(shù)。即使在這種情況中，觀察到最大細胞損失15％。這些細胞損失數(shù)值與我們當(dāng)前用開放系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)以及使用CytoMateTM的文獻中顯示的數(shù)據(jù)(Calmels B.et al.，Bone MarrowTransplant.2003 May；31(9)823-8)沒有顯著差別。
●根據(jù)文獻數(shù)據(jù)(Calmels B.et al.，Bone Marrow Transplant.2003 May；31(9)823-8)，考慮用設(shè)備進行單輪洗滌，整個流程(步驟包括初始樣品解凍，樣品洗滌，以及樣品稀釋用于細胞培養(yǎng))的時間長度是1小時，考慮二次細胞洗滌，則有20分鐘的延遲。
這些數(shù)據(jù)與我們當(dāng)前用開放系統(tǒng)獲得的約1小時的數(shù)據(jù)也沒有顯著差別。
根據(jù)這些結(jié)果，在封閉系統(tǒng)中進行的解凍和洗滌工序與在開放系統(tǒng)中進行的工序相比并不費時，而且在封閉系統(tǒng)中處理的細胞的安全性可得到很好保持，因為細胞在解凍和洗滌操作中從初始袋至終末培養(yǎng)袋的轉(zhuǎn)移是通過管道裝置進行的，培養(yǎng)基是通過袋加入的，且用于細胞測試的樣品是通過無菌注射器抽取的。不同袋之間的連接是使用確保無菌連接的無菌管道焊接物(welder)(SterileConnecting Device，Terumo)或使用插入袋口的長針進行的。
該系統(tǒng)避免了樣品以及工序試劑與環(huán)境的接觸。
實施例2不同淋巴細胞刺激對袋或搖瓶中細胞生長的影響為了評估封閉系統(tǒng)中的細胞生長，進行了以不同方式刺激淋巴細胞的幾個實驗在存在重組IL-2的情況下，使用OKT3(Orthoclone，Janssen-Cilag S.p.A.)或用DynabeadsCD3/CD28 T細胞擴增器(Dynal Biotech，coden°111.31)。其它刺激也可以考慮，例如用可溶性CD3/CD28抗體或用不同細胞因子混合物。
OKT3是針對CD3抗原的鼠單克隆抗體的臨床用無菌溶液。OKT3當(dāng)前在基因療法臨床研究中用于誘導(dǎo)淋巴細胞增殖，以進行使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體事實上需要細胞增殖以在DNA復(fù)制期間自我整合到細胞基因組中。
DynabeadsCD3/CD28 T細胞擴增器是包被有CD3和CD28抗體的超順磁聚苯乙烯珠。CD3抗體對T細胞上的人CD3抗原是特異性的，就像OKT3，而CD28抗體對T細胞上的人CD28共刺激抗原是特異性的。
Dynabeads模擬抗原呈遞細胞的體內(nèi)表現(xiàn)，用兩種信號同時刺激T細胞，由此誘導(dǎo)T細胞擴增。
在下面的實驗中(圖2和圖3所總結(jié)的)，在6個獨立的實驗中使用來自9個供體的PBL，以評估OKT3刺激較珠刺激對細胞生長的影響。在開放系統(tǒng)中(OKT3旋轉(zhuǎn)接種(spinoculation)樣品)或在袋中(其它樣品)的10天培養(yǎng)期間測定細胞擴增；每個點代表6-8個數(shù)據(jù)的平均值。
還評估了不同刺激對轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(轉(zhuǎn)導(dǎo)后LNGFR陽性細胞百分率)的影響。
在OKT3旋轉(zhuǎn)接種樣品中，用旋轉(zhuǎn)接種法在開放系統(tǒng)中進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，而在其它樣品中，使用RetroNectin在封閉系統(tǒng)中進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。
這些轉(zhuǎn)導(dǎo)方法和用于下文所述所有實驗的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在實施例3和4中有詳細說明。所述載體含有編碼截短形式人低親和力NGF受體的細胞表面標(biāo)志基因，它容許通過細胞熒光測定分析測試細胞表面上的ΔLNGFR表達來評估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
圖2只顯示了初步的細胞增殖結(jié)果比較所有樣品直到第6天，只有CD3較3∶1珠比較到第10天。
在這個最后步驟中，幾種樣品之間的增殖差別更明顯。
圖3與圖2有關(guān)，對相同樣品測試轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，比較開放系統(tǒng)與封閉系統(tǒng)。
由圖2的幾個實驗總結(jié)得出的結(jié)果證明，在開放系統(tǒng)中用OKT3刺激的細胞比在封閉系統(tǒng)中刺激的細胞有更高的增殖潛力。但是使用CD3/CD28珠獲得的刺激增加封閉系統(tǒng)中的細胞生長。細胞增殖的這些差別在細胞培養(yǎng)第6天和第10天之間更明顯，而直到第6天，即轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟后兩天或三天，細胞增殖在所有樣品中都非常相似。
在相同實驗中，在用不同方法刺激的淋巴細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后，評估了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，如圖3所示。結(jié)果非常有趣，在封閉系統(tǒng)中用CD3/CD28刺激并用RetroNectln轉(zhuǎn)導(dǎo)比用OKT3進行的其它刺激及或是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)法或是RetroNectin法導(dǎo)致更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(LNGFR陽性細胞百分率)。
與開放系統(tǒng)相比，這對封閉系統(tǒng)的效率非常重要，因為盡管增殖少但由于獲得較高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，封閉系統(tǒng)的遺傳修飾細胞的最終數(shù)目仍然較高。
這些初步結(jié)果得到了其它實驗的證實，代表性的如圖3和圖4所示。
圖4顯示了有代表性的細胞增殖實驗，它強調(diào)了在封閉系統(tǒng)中用OKT3和用兩種不同珠細胞比率刺激的樣品之間的差別。
與之對照的是，圖5顯示了在相同實驗中用旋轉(zhuǎn)接種和RetroNectin獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，比較了用OKT3和珠刺激獲得的數(shù)據(jù)。
該結(jié)果證實了由圖3所總結(jié)的實驗獲得的初步數(shù)據(jù)，其中使用RetroNectin的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比使用旋轉(zhuǎn)接種高。
圖4證實了CD3/CD28刺激與OKT3刺激相比增加封閉系統(tǒng)中的細胞增殖；以及珠細胞比率對細胞生長非常重要，即似乎需要至少每個細胞2粒珠。DynalBiotech建議的比率3∶1可能能進一步增加增殖速率。
相反(圖5)，該珠細胞比率不影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在比率2∶1和1∶1，轉(zhuǎn)導(dǎo)后LNGFR陽性細胞的百分率都比OKT3刺激獲得的百分率高，證實了在封閉系統(tǒng)中使用RetroNectin進行的轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟后的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率用CD3/CD28刺激較高。
這些數(shù)據(jù)表明，為了確保產(chǎn)品的安全性，在封閉系統(tǒng)中生成遺傳修飾細胞是非常重要的，而且它也可以是一個非常高效的系統(tǒng)。
實施例3細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)載體導(dǎo)致用于基因療法的遺傳修飾細胞生成的所有實驗都使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進行。
本發(fā)明可用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，其中解凍、洗滌、轉(zhuǎn)導(dǎo)、篩選、擴增及最后回收的所有生產(chǎn)步驟可在完全封閉系統(tǒng)中進行，但是它也適用于其它方案，其中只使用了這些步驟中的一些或步驟的順序改變或顛倒，或是使用不同載體，像慢病毒或腺病毒載體。
為下面的實驗選擇的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是SFCMM-3(Verzeletti et al.HSV-TKgene transfer for controlled GvHD and GvLclinical follow-up and improved new vectors.lluman Gene Therapy，1998)。
ΔLNGFR基因的轉(zhuǎn)錄受早期SV40啟動子調(diào)節(jié)。
該載體可用于生成自殺基因HSV-tk工程化淋巴細胞，用于前述同種異體骨髓移植背景中的臨床研究。
可獲得關(guān)于在開放系統(tǒng)中生成工程化淋巴細胞的工序的許多資料。使用這種背景來比較開放系統(tǒng)與本發(fā)明的新封閉系統(tǒng)。
轉(zhuǎn)導(dǎo)方法的轉(zhuǎn)換，生產(chǎn)工藝從開放系統(tǒng)變成封閉系統(tǒng)在生成遺傳修飾細胞的臨床研究以及我們的開放系統(tǒng)方法中使用旋轉(zhuǎn)接種法進行開放系統(tǒng)中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。
在本方法中，在通常用OKT3刺激2或3天后在層流箱中用培養(yǎng)瓶回收細胞，例如淋巴細胞。
在管中用一輪離心洗去培養(yǎng)基，并將細胞懸浮于逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液培養(yǎng)基中，根據(jù)病毒滴度，濃度為1-5×106細胞/ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。
將細胞置于塑料容器中進行細胞培養(yǎng)，并以1000-1200g離心1-2小時。然后在管中通過細胞離心洗去逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。
將細胞沉淀物懸浮于培養(yǎng)基中，并將處理后的細胞置于搖瓶中并培養(yǎng)。通常，在培養(yǎng)24小時后進行第二輪轉(zhuǎn)導(dǎo)。
48小時后，用細胞熒光測定分析對細胞測試ΔLNGFR表達。
在封閉系統(tǒng)中生成遺傳修飾細胞的本發(fā)明中，改變了轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟從而在袋中進行細胞洗滌及轉(zhuǎn)導(dǎo)。
該方法(在實施例4中有詳細說明)使用RetroNectin分子(Takara)，重組人纖連蛋白片段，以通過靶細胞和病毒體的共定位來增強逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。在RetroNectin包被的袋中將細胞與逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液一起培養(yǎng)12-24小時，容許在封閉系統(tǒng)中進行細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在幾個實驗中用OKT3刺激淋巴細胞后，將該轉(zhuǎn)導(dǎo)方法與旋轉(zhuǎn)接種法進行比較，早已總結(jié)在實施例2、圖3中。
在下面的表3中，總結(jié)了兩種不同轉(zhuǎn)導(dǎo)方法的特點。
表3在6個獨立實驗中使用來自9個供體的PBL
使用RetroNectin轉(zhuǎn)導(dǎo)法的優(yōu)點在于流向封閉的、更安全的系統(tǒng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)輪數(shù)從2次減至1次，消除了可能有危險的離心步驟，以及提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
安全性考慮以及改進的效率結(jié)果引導(dǎo)我們在封閉系統(tǒng)生產(chǎn)工序的開發(fā)中使用RetroNectin轉(zhuǎn)導(dǎo)法。
實施例4淋巴細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞刺激后的第2步是細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在下面的實驗中，在使用OKT3(Orthoclone)(但是如前文所述，可使用不同的刺激方案)的刺激步驟后進行淋巴細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，將細胞在RetroNectin(Takara)預(yù)包被的袋中與逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液(載體是上文描述的含有目的基因和細胞表面標(biāo)志基因的SFCMM-3)一起培養(yǎng)24小時。RetroNectin是重組人纖連蛋白片段，它通過靶細胞和病毒體的共定位而增強逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。
轉(zhuǎn)導(dǎo)通常在刺激后0-7天的范圍內(nèi)進行。在下述實驗中，轉(zhuǎn)導(dǎo)在第2天進行。
使用RetroNectin的轉(zhuǎn)導(dǎo)工序牽涉不同步驟制備RetroNectin包被袋，制備靶細胞，將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體加載到RetroNectin預(yù)包被袋中，將細胞在預(yù)加載袋中溫育。
將RetroNectin凍干粉溶于無菌注射用水，將合適體積的該溶液分配到各個袋(CellGenix Vuelife袋或Baxter x fold袋)中，并于室溫(RT)避光溫育2小時。所用RetroNectin濃度通常在l-8μg/cm2袋表面積的范圍內(nèi)。在這些實驗中使用1.2μg/cm2。
除去RetroNectin液后，將PBS 2％人血清清蛋白(HSA)的無菌溶液加至各個袋中進行封閉。需要室溫溫育30分鐘，然后通過用PBS洗滌三次以除去HSA溶液。這些袋可直接使用，在4℃或-80℃保存可長達一周。
然后在37℃溫育1小時期間，將逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液預(yù)加載到袋中的RetroNectin上。
將用于細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液的體積與細胞數(shù)目有關(guān)，而且細胞數(shù)目與上清液體積之間的比率可在0.5×106細胞/ml-10×106細胞/ml的范圍內(nèi)。
上清液添加有IL-2(范圍100-600IU/ml)、2mM谷氨酰胺及3％自體血漿。
在這些實驗中，使用的比率是1×106細胞/ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。關(guān)于預(yù)加載步驟，所用上清液的范圍在0到計劃總體積之間。在這些實驗中，用于預(yù)加載步驟的上清液是計劃的一半。
恰在感染前收集細胞，然后懸浮于剩余體積的上清液中，如上所述添加試劑。如上所述，所用最終比率是1×106細胞/ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。
袋中的細胞溫育進行24小時，但是可以在例如1-72小時的范圍內(nèi)。
在轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達之間通常有24-48小時的延遲，在該步驟中事實上尚未檢測到ΔLNGFR蛋白質(zhì)。
表3所示數(shù)據(jù)總結(jié)了轉(zhuǎn)導(dǎo)工序后48小時測試的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的結(jié)果。
使用CytoMateTM的轉(zhuǎn)導(dǎo)正如實施例1中詳細描述的，本發(fā)明的一個方面提供了使用臨床級一次性封閉試劑盒中的細胞操作設(shè)備在完全封閉系統(tǒng)中進行細胞操作和培養(yǎng)的方法。
在本實施例中，為了恰在感染前收集細胞，使用CytoMateTM作為自動流體管理設(shè)備。
根據(jù)上述方案，在轉(zhuǎn)導(dǎo)前，將一個或多個袋用RetroNectin預(yù)包被，并用計劃逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液體積的一半預(yù)加載。
OKT3刺激后第2天，使用CytoMate收集培養(yǎng)淋巴細胞袋(一個或多個)，并在最終預(yù)加載袋(一個或多個)中用計劃上清液體積的一半懸浮。所用最終比率是1×106細胞/ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。
袋中的細胞溫育進行24小時。
細胞洗滌及濃縮像細胞解凍一樣在一次性無菌裝置中進行，該裝置由與濾洗袋、緩沖袋及廢棄袋相連的轉(zhuǎn)膜組成。裝有培養(yǎng)淋巴細胞的樣品袋及裝有預(yù)加載上清液的終末袋都與該裝置無菌連接。該系統(tǒng)容許在GMP環(huán)境中進行細胞處理。
由用戶定義洗滌流程，且在遺傳修飾細胞的生產(chǎn)工序的不同步驟中是不同的。
簡單的說，使用轉(zhuǎn)膜將細胞用冷的緩沖液(X-Vivo 15，加有1％谷氨酰胺及600IU/ml IL-2)洗滌2輪，并轉(zhuǎn)移至收集袋，即洗滌袋。然后將細胞以約40ml的小體積轉(zhuǎn)移至終末袋，用計劃上清液的一半漂洗洗滌袋及管道以減少細胞損失。將該上清液轉(zhuǎn)移至終末袋，并將細胞釋至1×106細胞/ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。
將終末袋中的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液用40ml洗滌緩沖液稀釋，這取決于不同的定義參數(shù)，但是該稀釋不降低逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(數(shù)據(jù)未顯示)。
洗滌步驟的效率和時間長度取決于選擇的參數(shù)“殘留倍數(shù)減少”。根據(jù) Nexell數(shù)據(jù)(CytoMateTM客戶編程指南)，選擇數(shù)值50。數(shù)值100將導(dǎo)致來源溶液減少約2個對數(shù)。
在洗滌流程結(jié)束時，可對一份細胞樣品評估存活細胞數(shù)，并將細胞最后在溫箱中于37℃5％CO2溫育24小時。上清液是感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒重懸于X-VIVO15即細胞培養(yǎng)基的試劑。如上所述，在轉(zhuǎn)導(dǎo)前與1％谷氨酰胺、600IU/ml IL-2、3％自體血清及魚精蛋白一起添加上清液。該培養(yǎng)環(huán)境容許細胞在24小時溫育期與逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒一起培養(yǎng)。
包括稀釋在內(nèi)的洗滌流程的長度達到1小時。
使用上文所述洗滌流程進行了三個不同實驗。在這些實驗中，評估了不同步驟初始體積(樣品袋中細胞懸浮液的體積)和終末體積；初始細胞數(shù)，以評估要使用的上清液體積(1×106細胞/ml上清液)，終末細胞數(shù)，以評估終末比率“細胞上清液”；整個流程的時間長度，以推測該流程與開放系統(tǒng)相比是否耗時較少；所用洗滌緩沖液體積，以評估試劑消耗。
表4總結(jié)了使用CytoMateTM進行的三個洗滌實驗的數(shù)據(jù)。
表4
在以1×106/ml的濃度培養(yǎng)細胞時，初始樣品體積取決于刺激當(dāng)天的細胞數(shù)。細胞數(shù)取決于刺激和使用OKT3，細胞數(shù)通常會在刺激后兩天內(nèi)減少。知道了細胞數(shù)，要用的上清液體積就可以用比率1×106細胞/ml上清液來確定。細胞懸浮液的終末體積是洗滌后的懸浮液體積(約40ml洗滌緩沖液，X-Vivo 15)加上添加的上清液體積的結(jié)果。在這方面，最終的上清液稀釋至最多0.33倍。該稀釋不降低上清液的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。將細胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟中濃縮至0.75-0.9×106/ml的范圍內(nèi)，而該濃度容許基因較好的轉(zhuǎn)移到細胞中，如下一段所述。
使用CytoMateTM的流程非常短。只有在實驗3中超過1小時。在封閉系統(tǒng)中使用該RetroNectin方案容許轉(zhuǎn)導(dǎo)輪數(shù)減少至1，而在使用旋轉(zhuǎn)接種的開放系統(tǒng)中是2輪，花費2小時。
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，為了制備用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞懸浮液在封閉系統(tǒng)中進行的洗滌工序是迅速的，而且處理細胞的安全性得到很好保持。這是因為細胞在洗滌操作過程中從初始袋至終末RetroNectin預(yù)加載袋的轉(zhuǎn)移是通過管道裝置進行的，上清液是通過袋加入的，且用于細胞測試的樣品是通過無菌注射器抽取的(細胞計數(shù))。因此，該系統(tǒng)避免了樣品及工序試劑與環(huán)境的接觸。這與使用在A級層流箱中在搖瓶中操作細胞的旋轉(zhuǎn)接種的轉(zhuǎn)導(dǎo)流程形成了對照。
實施例5轉(zhuǎn)導(dǎo)后的淋巴細胞培養(yǎng)與逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液一起溫育24小時后，收獲細胞并懸浮于用于細胞培養(yǎng)的袋(一個或多個)中的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基與用于刺激的相同X-Vivo 15，加有3％自體血清、1％谷氨酰胺及IL-2(范圍100-600IU/ml)。
在本實施例中，使用CytoMateTM作為自動流體管理設(shè)備，以在封閉系統(tǒng)中操作細胞。在該步中，細胞用X-Vivo 15洗滌，懸浮于培養(yǎng)基，并棄去逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。
現(xiàn)在，一部分培養(yǎng)細胞受到實施例3中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的遺傳修飾，該載體包含目的基因和標(biāo)志基因，即截短形式的NGF受體(ΔLNGFR)。培養(yǎng)數(shù)天后，在該方案中是兩天，對細胞群測試ΔLNGFR表達。編碼ΔLNGFR的基因在淋巴細胞中沒有內(nèi)源性表達，而僅在轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中表達，且可使用偶聯(lián)有熒光染料的抗LNGFR抗體通過FACS(熒光激活細胞分選儀)分析在細胞表面上檢測到。
簡而言之，綴合有熒光染料的細胞通過激光束。它們中斷并散射激光，作為前散射和側(cè)散射光檢測到。第一個參數(shù)涉及細胞大小，而第二個是細胞內(nèi)部復(fù)雜性的指標(biāo)。除了散射，細胞計數(shù)器測量熒光參數(shù)。熒光染料吸收激光，并在光譜不同區(qū)域發(fā)射出該吸收光的一部分。細胞計數(shù)器測量各個細胞上每種染料的相對量，加工源自每個細胞的電子信號，并產(chǎn)生每個參數(shù)的數(shù)值。然后它將信息傳輸至計算機系統(tǒng)用于顯示和分析。熒光強度與細胞表面結(jié)合的綴合有熒光染料的抗體的數(shù)量成正比。
用CytoMateTM洗去逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液在該步中，如實施例4所述，在一次性無菌裝置中進行細胞洗滌和濃縮，該裝置由與濾洗袋、緩沖袋及廢棄袋相連的轉(zhuǎn)膜組成。含轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細胞的樣品袋及用于細胞培養(yǎng)的終末袋與該裝置無菌連接。如前所述，該系統(tǒng)容許在GMP環(huán)境中進行細胞處理。
洗滌過程由用戶定義且與實施例4中所述相同。使用轉(zhuǎn)膜將細胞用緩沖液(X-Vivo 15，加上1％谷氨酰胺及IL-2，范圍100-600IU/ml)洗滌2輪，并轉(zhuǎn)移至收集袋，即洗滌袋，然后將細胞以計劃體積轉(zhuǎn)移至終末袋，用固定體積的緩沖液漂洗洗滌袋和管道以使細胞損失降至最低。
然后根據(jù)終末細胞數(shù)稀釋終末袋中的細胞懸浮液，從而以0.2-0.5×106細胞/ml培養(yǎng)基的濃度培養(yǎng)細胞。加入總體積3％的自體血清。
洗滌步驟的效率和時間長短取決于選擇的參數(shù)“殘留倍數(shù)減少”。根據(jù)CytoMateTM客戶編程指南的Nexell數(shù)據(jù)，選擇數(shù)值50。數(shù)值100將導(dǎo)致來源溶液減少約2個對數(shù)。
包括最后稀釋在內(nèi)的洗滌流程的長度約為1小時。
使用上文所述洗滌流程進行了三個獨立實驗。在這些實驗中，考慮了以下參數(shù)初始體積、初始細胞數(shù)、整個流程的時間長度以及所用洗滌緩沖液體積以評估試劑消耗。在一個實驗中，評估終末細胞數(shù)以測試洗滌步驟中的細胞損失。
表5總結(jié)了使用CytoMateTM進行的三個洗滌實驗的數(shù)據(jù)。
表5
在以1×106/ml在逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液中培養(yǎng)細胞時，初始樣品體積取決于轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天的細胞數(shù)。根據(jù)初始細胞數(shù)，要用的培養(yǎng)基體積可以用比率0.5×106細胞/ml培養(yǎng)基來確定。
使用CytoMateTM的流程非常短，這一點在實施例4中也有描述。
使用開放系統(tǒng)時，應(yīng)當(dāng)離心細胞以棄去上清液，并在層流箱中必須在用于細胞培養(yǎng)的搖瓶中用培養(yǎng)基稀釋。這步引起對細胞的醫(yī)學(xué)壓力(physic stress)和操作困難，因為要操作的體積可能非常大。例如在實施例3中，必須除去556ml逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，且必須分配1100ml培養(yǎng)基到許多搖瓶中。這些操作提高了產(chǎn)品污染的風(fēng)險。
這些操作在開放系統(tǒng)中所用的時間，根據(jù)我們的數(shù)據(jù)是約1小時30分鐘。
根據(jù)該數(shù)據(jù)，為了制備用于細胞培養(yǎng)的細胞懸浮液在封閉系統(tǒng)中進行的洗滌工序比在開放系統(tǒng)中進行的洗滌工序耗時較少；使用封閉系統(tǒng)處理的細胞的安全性得到很好保持，因為細胞在洗滌操作中從初始袋至終末培養(yǎng)袋的轉(zhuǎn)移是通過管道裝置進行的，培養(yǎng)基是通過袋加入的，且用于細胞測試的樣品是用無菌注射器抽取的(細胞計數(shù))。
該系統(tǒng)避免了樣品及工序試劑與環(huán)境的接觸，并消除了可影響細胞存活率的離心壓力。
實施例6如前述實施例所述，在轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟后的兩天培養(yǎng)期間，遺傳修飾亞群表達ΔLNGFR細胞表面分子。該分子容許用磁珠系統(tǒng)篩選遺傳修飾亞群。
將細胞懸浮液與GMP級小鼠IgG抗NGF受體抗體一起溫育，該抗體結(jié)合ΔLNGFR陽性細胞，即遺傳修飾亞群。兩個洗滌步驟后，與包被有綿羊抗小鼠IgG的GMP級免疫磁珠(Baxter，code RAR9950)一起進行二次溫育。
現(xiàn)在，將珠處理細胞懸浮液應(yīng)用于磁體以分離珠包被的ΔLNGFR陽性細胞。用足夠的緩沖液(PBS 0.1％HSA)洗去磁體未俘獲的陰性群。
然后通過取走磁體在培養(yǎng)基中回收陽性細胞。培養(yǎng)24小時后，抗原與抗體之間的結(jié)合遭到破壞。珠釋放到培養(yǎng)基中，并使用磁體除去。在應(yīng)用磁體的過程中，珠結(jié)合磁體，而磁體未俘獲的細胞群用足夠的緩沖液(PBS 0.1％HSA)洗去。
將回收細胞群，即同質(zhì)遺傳修飾群，培養(yǎng)幾天，在1-7天的范圍內(nèi)，并在最小48小時后測試細胞增殖和ΔLNGFR表達。
如關(guān)于轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟所述，在ΔLNGFR分子下調(diào)后，編碼ΔLNGFR分子的基因需要24-48小時在細胞表面進行分子表達。
用于測試ΔLNGFR表達的細胞熒光測定分析在前述實施例中有描述。使用CytoMateTM進行的抗體溫育和細胞洗滌本發(fā)明使用CytoMateTM以在封閉系統(tǒng)中進行以下步驟洗去培養(yǎng)基及將細胞濃縮，將細胞懸浮液與抗NGF受體抗體一起溫育，冼去過量的抗體，并濃縮細胞以進行珠溫育。
洗滌和濃縮如實施例4所述在一次性無菌裝置中進行，該裝置由與濾洗袋連接的轉(zhuǎn)膜組成。緩沖袋和廢棄袋也與該裝置連接。用于溫育步驟的緩沖液是PBS0.5％HSA，用于洗滌步驟的緩沖液是PBS 0.1％HSA。
裝有懸浮在培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的樣品袋以及用于細胞回收的終末袋都與該裝置無菌連接。在洗滌前對細胞測試細胞數(shù)以計劃篩選操作。
如先前所討論的，本系統(tǒng)容許在GMP環(huán)境中進行細胞處理。使用轉(zhuǎn)膜用計劃好的1輪洗滌在洗滌袋中濃宿細胞，使用先前描述的用于洗去培養(yǎng)基的緩沖液。
將計劃抗體微克數(shù)(1μg/5×106細胞)的抗體溶液加到洗滌袋中。先前計劃的在洗滌步驟之后的“循環(huán)洗滌袋”步驟，通過洗滌通道在洗滌袋中循環(huán)細胞懸浮液。根據(jù)用戶設(shè)定的程序，該操作將細胞懸浮液與抗體溶液混合20分鐘。
溫育時間后，用第二輪洗滌洗去過量的未結(jié)合抗體，然后將細胞以計劃體積轉(zhuǎn)移至終末袋中，用固定體積的緩沖液漂洗洗滌袋和管道以降低細胞損失。
袋中收集的結(jié)合有抗體的細胞懸浮液，現(xiàn)在準(zhǔn)備好使用裝備有磁體的不同設(shè)備與珠一起溫育。
洗滌步驟的效率和長度取決于選擇的參數(shù)“殘留倍數(shù)減少”。根據(jù)Nexell數(shù)據(jù)，選擇數(shù)值50。數(shù)值100將導(dǎo)致來源溶液減少約2個對數(shù)。
細胞洗滌及細胞與抗體一起溫育的整個流程的時間長度達到1小時30分鐘。
使用剛剛描述的流程進行了三個不同實驗。在這些實驗中，考慮了以下參數(shù)細胞懸浮液的初始體積(樣品袋中細胞懸浮液的體積)、終末體積，以用于在后續(xù)溫育步驟中濃縮細胞；初始細胞數(shù)，以計劃篩選流程的試劑；整個流程的時間長度，以推測該流程與開放系統(tǒng)相比是否耗時較少；以及所用洗滌緩沖液體積，以評估試劑消耗。在一個實驗中，測試了終末細胞數(shù)和存活率以評估該流程中的細胞損失。
表6總結(jié)了使用CytoMateTM進行的三個實驗的數(shù)據(jù)。
表6
在培養(yǎng)基中以0.5×106/ml培養(yǎng)細胞時，初始樣品體積取決于轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟后的細胞數(shù)(參見實施例5)。
必須檢測細胞懸浮液的終末體積，以濃縮細胞用于與珠一起溫育的后續(xù)步驟。
有了初始細胞數(shù)，就能計算要用的溫育緩沖液體積(用于制備抗體溶液，20×106細胞/ml緩沖液)和抗體微克數(shù)(1μg/5×106細胞)。
在一個實驗中測試了終末細胞數(shù)和細胞懸浮液存活率，以評估該流程中的細胞損失。存活率為100％，表示該流程對細胞不產(chǎn)生壓力。
在實驗1中，細胞回收率為88％表明Cyt0MateTM流程后有少量細胞損失，這可通過改變程序來減少，例如縮短洗滌步驟。
使用CytoMateTM的流程不費時，約為1小時30分鐘。在這段時間進行了許多操作2次洗滌及20分鐘溫育。根據(jù)我們的經(jīng)驗，這些操作在開放系統(tǒng)中所用時間約為2小時。
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，為了使細胞懸浮液與抗體結(jié)合及使細胞準(zhǔn)備好磁性篩選而在封閉系統(tǒng)中進行的洗滌、濃縮和溫育工序與在開放系統(tǒng)中進行的相同工序相比耗時較少，而且在封閉系統(tǒng)中處理的細胞的安全性得到很好保持，因為細胞操作是用管道裝置進行的，試劑是通過袋加入的，而用于細胞測試的樣品是用無菌注射器抽取的(細胞計數(shù))。
該系統(tǒng)避免了樣品及工序試劑與環(huán)境的接觸，并消除了可能影響細胞存活率的離心壓力。
免疫磁性篩選現(xiàn)在在袋中濃縮前述工序的終產(chǎn)品，即敏化細胞(與抗NGF受體一起溫育過的)。該袋與第二管道裝置無菌連接，以起動使用順磁微球(珠)和裝備有磁體的設(shè)備(磁性細胞分離器)的篩選步驟。無菌、非熱原一次性裝置由150ml通風(fēng)圓筒槽構(gòu)成。該槽在底部通過Y連接器與兩個管道系統(tǒng)永久連接輸入管和輸出管。這兩條管道都有兩個長釘連接，用于將裝有細胞懸浮液(樣品袋)和工作緩沖液的袋通過輸入管與槽相連，以及用于將終末細胞收集袋和廢棄袋通過輸出管與槽相連。
在下文描述的實驗中，所用磁性分離器是Baxter International Inc.設(shè)計的IsolexTM300，它利用抗CD34單克隆抗體和順磁微球，從異質(zhì)細胞群篩選和分離CD34+細胞。
在IsolexTM300標(biāo)準(zhǔn)方案中，在開放系統(tǒng)中用抗CD34單克隆抗體使細胞敏化，然后用管道裝置將細胞與珠混合，磁性分離CD34+細胞并洗去未結(jié)合的陰性細胞。最后，使用對一抗具有高親和力的肽分子從珠上釋放CD34+細胞?？贵w/肽復(fù)合物可磁性保留在分離槽內(nèi)，而CD34+細胞釋放到收集袋中。
只是為了我們的目的，遵循該工序用于將敏化細胞(與抗NGF受體一起溫育過的)與珠(Baxter，如上文所詳述的)混合及用于磁性分離玫瑰形(rosetted)ΔLNGFR陽性細胞。通過三輪洗滌降非玫瑰形(unrosetted)陰性細胞從分離槽洗至廢棄袋。
簡而言之，輸入管的兩個袋與輸出管的兩個袋使用確保無菌連接的無菌管道焊接物(Terumo)或者使用插入袋口的管道長針而無菌連接。該系統(tǒng)避免了樣品及工序試劑與環(huán)境的接觸。連接后，固定的裝置程序以如下步驟順序起動用洗滌緩沖液填充管道，在槽中混合敏化細胞與珠，溫育前加到初始細胞袋中，磁性分離玫瑰形物(rosette)，洗去殘余的珠及陰性細胞。
洗滌緩沖液是PBS 0.1％HSA。根據(jù)初始細胞NGF陽性數(shù)，以珠NGF陽性細胞比率5∶1加入珠。在篩選前以少量細胞懸浮液檢測NGF陽性細胞數(shù)，通過FACS分析對細胞計數(shù)并測試NGF陽性細胞百分率，正如上文實施例5中所描述的。
體積不超過100ml--90ml起始溶液和10ml預(yù)洗滌計劃珠?？捎迷撛O(shè)備處理最多10×109個敏化細胞?；旌衔镉谑覝氐臏赜龝r間為30分鐘。
混合后，玫瑰形NGF+細胞被磁鐵保留在主槽壁中。非玫瑰形細胞洗到廢棄袋中，然后將NGF+細胞用緩沖液洗滌三次以除去殘留的非玫瑰形細胞。將用于洗滌的工作緩沖液與非玫瑰形細胞收集在一起，最后可對該細胞懸浮液計數(shù)以控制篩選流程有良好的結(jié)果。
使用上文所述流程進行了兩個不同實驗。在這些實驗中，測定了下列參數(shù)細胞懸浮液的初始體積(管道裝置槽中細胞懸浮液的體積)、終末體積，以濃縮ΔLNGFR+細胞用于免疫磁性分離后的培養(yǎng)；通過FACS分析測試NGF+細胞百分率；總ΔLNGFR+細胞數(shù)，源自初始細胞數(shù)(CytoMateTM洗滌前檢測)及ΔLNGFR+細胞百分率；整個工序的時間長度，以推測該工序與開放系統(tǒng)相比是否耗時較少；懸浮在廢棄袋中的細胞數(shù)；以及所用洗滌緩沖液體積，以評估試劑消耗。
表7總結(jié)了使用IsolexTM300進行的兩個實驗的數(shù)據(jù)。
表7
討論初始樣品體積取決于使用CytoMateTM進行的洗滌和敏化步驟，洗滌液約80ml加上添加的預(yù)洗滌珠體積，總體積約為100ml。體積不應(yīng)超過130ml，因為管道裝置槽的體積為150ml。需要20ml剩余體積以充分昆合細胞和珠。
根據(jù)總LNGFR陽性細胞數(shù)確定細胞懸浮液終末體積。細胞懸浮液體積是細胞培養(yǎng)物的體積，并以2×106個LNGFR陽性細胞/ml培養(yǎng)基的濃度鋪涂細胞。洗滌玫瑰形細胞后，用確保無菌連接的無菌管道焊接物(Terumo)無菌連接裝有計劃體積培養(yǎng)基的袋。
LNGFR+細胞百分率與轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟有關(guān)，且取決于不同因素，包括細胞刺激、轉(zhuǎn)導(dǎo)方法、用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的上清液的病毒滴度、及轉(zhuǎn)導(dǎo)輪數(shù)。
LNGFR陽性細胞百分率高是非常重要的，因為它提高最終遺傳修飾細胞的回收率及整個流程的效率。
與初始細胞數(shù)及LNGFR陽性細胞百分率有關(guān)的總LNGFR陽性細胞數(shù)，對準(zhǔn)備篩選試劑、要用的珠和工作緩沖液的數(shù)量、以及評估篩選后的細胞回收率(即篩選步驟的效率)都是重要的。當(dāng)ΔLNGFR分子的下調(diào)將珠釋放到培養(yǎng)基中時，在篩選的下一天評估細胞回收率。使用錐蟲藍染色對細胞測試細胞數(shù)。這些結(jié)果顯示在表8中，正如實施例8所廣泛討論的，在開放系統(tǒng)獲得的回收率結(jié)果平均值的范圍內(nèi)。
在兩個實驗之一中對最終的細胞懸浮液計數(shù)，以評估篩選流程的結(jié)果。該流程了損失了低于10％的總細胞數(shù)。
該篩選流程與開放篩選法相比并不費時，后者必須將細胞懸浮液分成至少3管且必須對每管施加磁體。還有，必須在幾個管中對玫瑰形細胞進行接下來的洗滌步驟，并對每管施加磁體，這是費時的。此外，在層流箱中操作幾個管與在管道裝置中操作細胞相比有高污染風(fēng)險。
免疫磁性微球脫離Dynabeads(Baxter)M-450綿羊抗小鼠IgG是表面共價結(jié)合有親和純化的綿羊抗小鼠IgG的順磁性聚苯乙烯珠。無菌、非熱原懸浮液僅供回體(exvivo)使用。為此，必須從細胞懸浮液中除去該珠。如上所述，篩選后那天，玫瑰形細胞將珠釋放到培養(yǎng)基中。然后用磁性細胞分離系統(tǒng)處理細胞懸浮液，以從細胞培養(yǎng)物中除去珠。
如先前部分所述，使用帶有槽室的管道裝置。
簡而言之，輸入管的兩個袋和輸出管的兩個袋用確保無菌連接的無菌管道焊接物(Terumo)或者用插入袋口的管道長針而無菌連接。輸入管的連接袋是緩沖袋(緩沖液是培養(yǎng)用培養(yǎng)基)和細胞懸浮液袋。輸出管的連接袋是用于細胞回收的終末細胞懸浮液袋和廢棄袋。
連接后，按如下步驟順序起動固定的裝置程序用洗滌緩沖液填充管道，在槽中混合敏化細胞與珠，溫育前加到初始細胞袋中，磁性分離玫瑰形物，洗去殘余的珠和陰性細胞。
洗滌裝置僅用于我們的目的用磁體將珠保留在槽壁上，而將細胞收集到終末袋中。
使用上文所述方法進行了兩個不同實驗。這些實驗的細胞篩選步驟如上面的部分所述。
在這些實驗中，評估了細胞回收率以比較在封閉系統(tǒng)中進行的本發(fā)明的篩選和脫離與在開放系統(tǒng)中進行的篩選和脫離。
表8總結(jié)了使用IsolexTM300進行的珠脫離后的細胞回收。
表8
正如實施例8所廣泛討論的，封閉系統(tǒng)中進行篩選和脫離的實驗1和實驗2的細胞回收結(jié)果在開放系統(tǒng)中進行篩選和脫離所獲得的結(jié)果的平均值內(nèi)。
實施例7篩選后的淋巴細胞培養(yǎng)珠脫離后，將細胞培養(yǎng)24小時。使用錐蟲藍染色對細胞計數(shù)，并通過FACS分析評估ΔLNGFR表達，以測試篩選群的均一性。
然后將袋中培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)基中以0.2-1×106細胞/ml的濃度范圍稀釋，使用確保各袋之間無菌連接的無菌管道焊接物(Terumo)添加培養(yǎng)基。
通常，ΔLNGFR分子已經(jīng)在超過90％的群中表達。然而，根據(jù)細胞增殖速率，可能并非所有細胞此時表達細胞表面分子，導(dǎo)致非均一群。在任何情況中，在患者灌注或細胞冷凍之前培養(yǎng)的最后一天，重復(fù)相同的細胞熒光測定分析，以確認細胞群受到完全的遺傳修飾。
篩選后的培養(yǎng)天數(shù)在0-6天范圍內(nèi)，這取決于計劃在臨床研究中對每位患者灌注的細胞數(shù)；將細胞群的小樣用于質(zhì)量控制分析，包括無菌測試。
根據(jù)歐洲藥典(EP)，測試了產(chǎn)品的小樣；小樣的體積取決于產(chǎn)品的總體積。從統(tǒng)計學(xué)考慮，可以假設(shè)，如果該小樣在無菌測試中沒有發(fā)生細菌生長，那么可以認為整個產(chǎn)品是無菌的。
然而，不能絕對排除終產(chǎn)品中污染物以極低負荷存在。該風(fēng)險可通過使用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)諸如本發(fā)明而降至最低，本發(fā)明的主要優(yōu)點是在完全封閉的系統(tǒng)中操作細胞。
在本例中，終產(chǎn)品的安全性由系統(tǒng)本身保證，因為在每一個生產(chǎn)步驟中，細胞從未接觸環(huán)境。
總是在無菌管道裝置中操作細胞，用無菌袋中制備的試劑處理細胞；因此，無菌環(huán)境很容易保證。
使用CytoMate洗條和回收終產(chǎn)品在該步中，回收、洗滌終產(chǎn)品以清除培養(yǎng)基，然后濃縮到50-60ml的終體積以灌注患者或冷凍以備將來灌注。
在下面的實驗中，用于細胞洗滌的緩沖液是添加0.5％HSA的PBS，但是對于基因療法的臨床方案來說，必須使用含0.5-4％HSA的0.9％氯化鈉溶液，以更好保持細胞的生理環(huán)境及制備適于患者灌注的生理產(chǎn)品。
洗滌和濃縮步驟如實施例4所述在一次性無菌裝置中進行，該裝置由與濾洗袋、緩沖袋和廢棄袋連接的轉(zhuǎn)膜組成。裝有遺傳修飾淋巴細胞的樣品袋及用于細胞回收的終末袋都與該裝置無菌連接。
如前所述，本系統(tǒng)容許在無菌環(huán)境中進行細胞處理。
洗滌流程由用戶定義，且與實施例4中所述相同。使用轉(zhuǎn)膜將細胞用剛剛描述的緩沖液洗滌兩輪，并轉(zhuǎn)移至收集袋，即洗滌袋。然后將細胞以計劃的50-60ml體積轉(zhuǎn)移至終末回收袋，用固定體積的緩沖液漂洗洗滌袋和管道以減少細胞損失。
如上所述，終末回收袋中的終產(chǎn)品，即遺傳修飾細胞，可懸浮于補充有HSA0.5-4％(用于灌注)或者HSA0.5-4％及DMSO 10％(用于細胞冷凍)的鹽水溶液。
在灌注或冷凍前，按歐洲條令要求的測試對終產(chǎn)品的小樣進行質(zhì)量控制。
洗滌步驟的效率和長度取決于選擇的參數(shù)“殘留倍數(shù)減少”；根據(jù)Nexell數(shù)據(jù)選擇數(shù)值50，數(shù)值100將導(dǎo)致來源溶液減少約2個對數(shù)。
洗滌和濃宿流程的時間長度為約1小時。
用剛才描述的洗滌流程進行了兩個獨立實驗。在這些實驗中，分析了以下參數(shù)初始體積(樣品袋中細胞懸浮液的體積)、初始細胞數(shù)及終末細胞數(shù)，以測試洗滌步驟中的細胞損失；所用洗滌緩沖液體積，以評估試劑消耗；以及整個流程的時間長度。最后一點在該步中非常重要，其中細胞存活率是基本要素。
表9總結(jié)了使用CytoMateTM進行的兩個洗滌實驗的數(shù)據(jù)。
表9
在以0.2-1×106細胞/ml培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞時，初始樣品體積取決于先前拆分步驟的細胞數(shù)。
回收袋中的細胞終體積由用戶在程序中設(shè)置，且優(yōu)選不超過60ml，以將注入患者的體積降至最低。
初始和終末細胞數(shù)是非常有用的數(shù)據(jù)，以評估該流程中的細胞損失，以及用于臨床研究目的，以計劃計算患者注射劑量，它在基因療法臨床研究中(Bibliografia)通常以細胞數(shù)/Kg患者重量定義。
如實施例4所述，使用CytoMateTM的流程很短。
在最終回收細胞是終產(chǎn)品的該步中，必須將細胞操作總時間降至最低，以保持細胞存活力直至患者注射或細胞冷凍。關(guān)于懸浮在含4％HSA的0.9％氯化鈉溶液中的終產(chǎn)品的存活率，在我們實驗室中進行的穩(wěn)定性測試表明，該細胞懸浮液維持穩(wěn)定性達4小時由此1小時對該工序步驟而言是足夠的。
在兩個實驗中，評估了產(chǎn)品的存活率，發(fā)現(xiàn)是96-97％，同時洗滌步驟中的細胞損失為4-7％。該結(jié)果確保了用于患者注射或冷凍的終產(chǎn)品的質(zhì)量。
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，為了制備終產(chǎn)品，即用于注射或冷凍的遺傳修飾細胞，在封閉系統(tǒng)中進行的洗滌工序是不費時的，而且處理細胞的質(zhì)量和安全性得到很好保持細胞在洗滌操作中從初始袋至終末灌注或冷凍袋的轉(zhuǎn)移是通過管道裝置進行的，而產(chǎn)品質(zhì)量的控制是通過用無菌注射器抽取產(chǎn)品小樣而進行的。
實施例8開放和封閉系統(tǒng)之間的比較如前述實施例所廣泛說明的，本發(fā)明提供了在用于臨床使用的標(biāo)準(zhǔn)化安全封閉系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選遺傳修飾細胞的方法。
具體而言，本發(fā)明用于生成遺傳修飾T細胞(參見前述實施例)以用于同種異體骨髓移植臨床方案的環(huán)境中。
當(dāng)前使用開放系統(tǒng)來生成轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞用于臨床方案。該系統(tǒng)的步驟在上文中有總結(jié)，包括刺激，轉(zhuǎn)導(dǎo)，篩選，擴增，以及收獲。
在每個實施例中，描述了單個步驟以及將該步驟開發(fā)到封閉系統(tǒng)中。
從開放系統(tǒng)至封閉系統(tǒng)的轉(zhuǎn)變對提升產(chǎn)品規(guī)模是必要的，而且為了提高用于臨床使用的產(chǎn)品的安全性也是必要的。
在我們的經(jīng)驗中，如果需要有限數(shù)目的細胞(1-1.2x108個終末細胞，患者劑量106細胞/Kg)，那么可使用開放系統(tǒng)，且沒有重大污染風(fēng)險。
但是當(dāng)臨床方案需要高劑量時(107或108細胞/Kg)，那么生成0.8-8x109個終末細胞，而且封閉系統(tǒng)是必要的，以降低污染風(fēng)險并便利細胞操作。
為此目的，在我們實驗室中開發(fā)出了一個易實施的封閉系統(tǒng)。如前述每個步驟中所說明的，該系統(tǒng)確保與開放系統(tǒng)相比更高數(shù)量細胞的無菌操作。由于沒有出現(xiàn)開放步驟，所以可以在常規(guī)實驗室中進行整個操作。
本方法可在方案設(shè)備中進行標(biāo)準(zhǔn)化，以利于廣泛實驗室操作人員使用。
在下表中總結(jié)了前述實施例中廣泛討論的兩個實驗，并與開放系統(tǒng)中進行的實驗逐步比較。
開放系統(tǒng)的每個數(shù)值是使用通過成分血回收的5份不同供體細胞進行的5個實驗的中值，而封閉系統(tǒng)中進行的兩個實驗是由血沉棕黃層和成分血開始而進行的。
表10
-第2天/第0天顯示了第2天和第0天測試的細胞教之間的比率。該比率指示直到第2天的細胞增殖率。比率第3天/第2天及第6天/第3天具有相同含義。
-篩選前％NGFR+細胞指示經(jīng)SFCMM-3載體遺傳修飾的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞數(shù)，所述載體如實施例2所述，編碼TK分子和ΔLNGFR細胞表面表達分子。該值在篩選步驟前通過細胞熒光測定分析來檢測。
-MFI是熒光強度平均值，是與細胞表面表達的細胞分子數(shù)量有關(guān)的細胞熒光測定分析參數(shù)。
-回收率％是篩選步驟后收集的細胞總數(shù)與篩選步驟前轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞細胞總數(shù)的比值。
-終末NGFR細胞百分率指示終產(chǎn)品中遺傳修飾細胞的數(shù)量。
-終末細胞數(shù)指患者灌注當(dāng)天或細胞冷凍當(dāng)天所收集遺傳修飾細胞的數(shù)目。
-時間點是第0天，細胞刺激日；第2天，轉(zhuǎn)導(dǎo)日；第6天，篩選日；第7天，珠脫離日；第10天，終產(chǎn)品回收日。
可以比較這些實驗，因為它們是由相似的細胞數(shù)開始而進行的5個開放系統(tǒng)實驗平均1622×106個細胞，封閉系統(tǒng)實驗則932-1000×106個細胞。
● 該表顯示，由成分血開始在封閉系統(tǒng)中進行的實驗非常高效，且生成的遺傳修飾細胞數(shù)事實上比同樣從成分血開始的開放系統(tǒng)生成的要高。
● 該工序的詳細分析指出，封閉系統(tǒng)顯示主要優(yōu)勢的步驟是轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選，其中細胞回收率很高。
終產(chǎn)品的純度(最終NGFR陽性細胞百分率)非常相似，且顯示最終遺傳修飾細胞群的均一性。
● 封閉系統(tǒng)只有增殖速率比開放系統(tǒng)低，尤其是在第3天與第6天之間及第10天與第7天之間。然而，用不同袋或不同培養(yǎng)基開發(fā)細胞培養(yǎng)，應(yīng)當(dāng)能提高細胞增殖。
這些結(jié)果表明，本發(fā)明提供了在安全有效的標(biāo)準(zhǔn)化封閉系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選遺傳修飾細胞的方法。
在同種異體骨髓移植臨床方案的環(huán)境中測試的本發(fā)明，可應(yīng)用至安全高效是必要的多種基因療法臨床研究中。
權(quán)利要求
1.用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞和篩選遺傳修飾細胞的方法，該方法包括在封閉系統(tǒng)中進行轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選。
2.修飾細胞的方法，包括(i)任選解凍所述細胞；(ii)任選刺激所述細胞；(iii)用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細胞；(iv)篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞；以及(v)任選擴增和收獲所述轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞其中步驟(i)至(v)在封閉系統(tǒng)中進行。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述方法不包括人工轉(zhuǎn)移流體。
4.權(quán)利要求2的方法，其中使用用于細胞操作的自動流體管理設(shè)備洗滌、濃縮和重懸細胞。
5.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述遺傳構(gòu)建體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是MLV衍生載體。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼細胞表面標(biāo)志。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述細胞表面標(biāo)志是ΔLNGFR。
9.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述細胞是供體T細胞。
10.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述方法包括使用纖連蛋白或其變體的轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。
11.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述方法包括使用RetroNectin系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。
12.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述方法包括轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的免疫篩選。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述免疫篩選包括免疫磁性篩選。
14.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述方法使用單一設(shè)備。
15.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述方法使用用于細胞濃縮、細胞洗滌、轉(zhuǎn)導(dǎo)、培養(yǎng)基更換及轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞免疫磁性篩選的兩種或多種設(shè)備。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述方法使用(i)用于細胞濃縮、細胞洗滌、轉(zhuǎn)導(dǎo)及培養(yǎng)基更換的第一設(shè)備；和(ii)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞免疫磁性篩選的第二設(shè)備。
17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述設(shè)備之間的細胞轉(zhuǎn)移是使用密封袋和無菌連接進行的。
18.權(quán)利要求15-17任一項的方法，其中在允許逐步用戶自定義編程的完全封閉系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)膜確保細胞針對逆流緩沖液循環(huán)過濾且與不同袋連接。
19.權(quán)利要求17的方法，其中(i)使用CytomateTM細胞處理系統(tǒng)或其變體進行。
20.權(quán)利要求17的方法，其中(ii)使用IsolexTM300磁性細胞分離系統(tǒng)或其變體進行。
全文摘要
用遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞和篩選遺傳修飾細胞的方法，該方法包括在封閉系統(tǒng)中進行轉(zhuǎn)導(dǎo)和篩選。
文檔編號C12N15/867GK101014712SQ200580022964
公開日2007年8月8日 申請日期2005年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月6日
發(fā)明者克勞迪婭·貝納蒂, 羅伯托·S·拜羅洛, 西莫娜·拉塞塔卡塔曼西奧, 馬里納·拉德里扎尼, 塞西莉亞·森德雷森, 薩爾瓦托爾·托馬 申請人:莫爾米德公司