乙型肝炎的治療、預(yù)防和診斷試劑的制作方法

專利名稱：乙型肝炎的治療、預(yù)防和診斷試劑的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了用于在動物種類中感染乙型肝炎病毒(HBV)的治療和預(yù)防的化合物。本發(fā)明還提供了診斷HBV感染或其它疾病狀態(tài)的方法以及用于診斷試驗(yàn)方案的試劑。本發(fā)明還構(gòu)思了監(jiān)測人和其它動物種類包括動物模型的疾病狀態(tài)的方法，以及提供研究對象感染HBV的易感性或其它疾病狀態(tài)發(fā)展的指征。
現(xiàn)有技術(shù)的描述說明書中參考的發(fā)表物的詳細(xì)目錄也收集在本說明書的最后。
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乙型肝炎病毒(HBV)造成虛弱疾病狀態(tài)并能導(dǎo)致急性肝衰竭。HBV是DNA病毒，它經(jīng)由RNA中間體復(fù)制并在其復(fù)制策略中利用了逆轉(zhuǎn)錄。HBV基因組性質(zhì)復(fù)雜，具有部分雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，有重疊的編碼表面、前核心、核心、多聚酶和X基因的開放閱讀框。
HBV前核心/核心基因含有兩個(gè)符合讀框的起始密碼子，它們控制具有共末端N末端的(核心基因編碼的)HBcAg和(前核心基因編碼的)HBeAg的合成。實(shí)際上，前核心基因編碼相同蛋白的兩個(gè)形式HBeAg細(xì)胞外形式和P22或P25細(xì)胞內(nèi)形式(此處稱為P22)。前核心基因表達(dá)產(chǎn)物稱為HBeAg/P22。細(xì)胞外蛋白是免疫介導(dǎo)的病毒清除機(jī)制的靶點(diǎn)。
與前核心蛋白相關(guān)，翻譯從這個(gè)ORF的第一個(gè)AUG開始，得到有編碼信號肽的前C區(qū)域的25kD多肽。信號肽的功能是將前體蛋白插入ER，在ER中肽被切割得到經(jīng)由分泌途徑運(yùn)出的17kD蛋白產(chǎn)物。17-25kD蛋白是P22。運(yùn)出過程中，切除基本C末端結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生15-17kD可溶性蛋白，它最終被分泌進(jìn)血清中并被測量為HBeAg，但是一些也會引入到細(xì)胞外膜。HBeAg/P22對于生產(chǎn)性病毒復(fù)制不是必需的。
HBcAg是21kD的磷蛋白，它的合成從第二個(gè)符合讀框的起始密碼子開始，從較短的基因組轉(zhuǎn)錄物翻譯。HBcAg是核殼(nucleocapsid)的主要蛋白組分。C末端結(jié)構(gòu)域是高度堿性的并且擁有非序列特異性核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
位于重疊X開放閱讀框區(qū)域(X-ORF)的基礎(chǔ)核心啟動子[BCR](核苷酸1744至1804)控制前核心和核心區(qū)域的轉(zhuǎn)錄并且指導(dǎo)前核心mRNA和前基因組/CmRNA這兩個(gè)mRNA的合成。前核心mRNA編碼HBeAg/P22，前基因組/CmRNA編碼核心蛋白。DNA多聚酶起前基因組RNA(pgRNA)逆轉(zhuǎn)錄模板的作用。
影響HBeAg/P22合成的兩個(gè)主要類型的突變是前核心蛋白突變(G1896A)和基礎(chǔ)核心啟動子(BCP)在核苷酸1762和核苷酸1764的突變，所有都導(dǎo)致了HBeAg/P22產(chǎn)生的減少并且導(dǎo)致增加的宿主免疫反應(yīng)，雖然在一些患者這可能是瞬時(shí)的，并且在沒有被免疫抑制的患者中與更具侵略性的肝疾病沒有明顯的相關(guān)性。前核心突變經(jīng)常發(fā)生在相似的時(shí)間并且通常與核心基因的突變/刪除相關(guān)。
前核心終止突變和HBV基因表型之間有相關(guān)性。核苷酸1896是鳥嘌呤核苷(G)并且見于RNA結(jié)構(gòu)元件ε之內(nèi)，它參與殼體化。這個(gè)與核苷酸1858堿基配對，核苷酸1858的突變聯(lián)合在核苷酸1896的前核心終止突變能增強(qiáng)ε莖-環(huán)區(qū)域之內(nèi)的病毒堿基配對。有基因型A HBV感染(北美和部分歐洲最普遍的基因型)的患者中，核苷酸1858是C。這個(gè)基因型中，核苷酸1896(G變A)和核苷酸1858(C變T)的突變對于穩(wěn)定莖-環(huán)結(jié)構(gòu)是必需的?；蛐虯 HBV中核苷酸1858沒有代償性的突變，當(dāng)C-1858試圖與A-1896配對時(shí)導(dǎo)致未配對的堿基配對，這動搖了裝配信號的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。對于裝配沒有穩(wěn)定的ε，可以發(fā)生殼體化的降低因而復(fù)制降低，得到復(fù)制缺陷病毒。因而，前核心終止密碼子突變在基因型A中不太頻繁發(fā)生，因?yàn)樾枰獌蓚€(gè)突變事件。相反，亞洲、非洲、地中海盆地或中東多于70％的慢性HBV攜帶者的HBV序列在核苷酸1858已經(jīng)含有T。因而，只有在核苷酸1896的單個(gè)突變對于產(chǎn)生有穩(wěn)定莖-環(huán)配對的前核心突變體是必需的。含有核苷酸1858是T的這些其它的基因型(基因型B、C、D和E)的患者中前核心終止突變HBV的這個(gè)更高頻率反映了對于ε得到終止密碼子和穩(wěn)定莖-環(huán)結(jié)構(gòu)只有單個(gè)突變(G1896A)是需要的(Hunt等，Hepatology.31(5)1037-44，1994；Lok等，Proc Natl AcadSciUSA.91(9)4077-81，1994)。
在許多有持續(xù)感染、暴發(fā)肝炎患者以及免疫抑制患者中檢測到了造成T-1762和/或A-1764的BCP中的突變，尤其是在核苷酸1762和核苷酸1764。T-1762和A-1764的雙突變與HBeAg/P22的降低(但是沒有消失)和病毒荷載的增加相關(guān)(Gunther等，Adv Virus Res.5225-137，1999；Hunt等，1994同上)。一般地，一些基因型A感染的患者中發(fā)現(xiàn)了這個(gè)模式的前核心的改變。
核心蛋白能分成兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，N末端裝配結(jié)構(gòu)域直到氨基酸位置144和功能上重要的富含精氨酸C末端結(jié)構(gòu)域。C末端結(jié)構(gòu)域?qū)τ谇盎蚪MRNA的結(jié)合和基因組復(fù)制以及參與核運(yùn)輸是必需的。有趣地，HBeAg陽性、免疫耐受階段患者的HBV核心蛋白序列不含有或含有很少的氨基酸改變，提示較低的免疫壓力可以導(dǎo)致臨床較不明顯的突變。HBcAg和HBeAg氨基酸改變的普及和前C缺陷的那些非常相似并且在慢性感染的多個(gè)階段中可見。然而，一旦患者進(jìn)入免疫再激活(清除)階段，HBcAg和HBcAg氨基酸改變的平均比率增加多于五倍，簇集到受免疫壓力和其后病毒“選擇”影響的36個(gè)熱點(diǎn)位置。這些熱點(diǎn)位置與主要細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)[氨基酸18-30]和T輔助(TH)細(xì)胞[氨基酸50-70]區(qū)域以及分別在氨基酸殘基75-90和120-140的兩個(gè)B細(xì)胞[HBc/e1和HBc/e2]表位相關(guān)聯(lián)(Gunther等，1999同上)。
為了理解帶有慢性HBV感染的特殊人群，必須理解HBV感染的自然歷史。有高達(dá)30％的慢性HBV感染的患者發(fā)展了肝硬化和或肝癌，對于將要評價(jià)臨床試驗(yàn)或治療每個(gè)患者必須分別定義各個(gè)的HBV病程。由于在世界上一些地方例如非洲、亞洲、中東、地中海盆地和南美洲非基因型A感染的HBV是常見的，HBeAg陰性的慢性肝炎目前代表了慢性肝炎的主要形式。
每年1至10％的慢性乙型肝炎攜帶者(有野生型病毒的患者中)發(fā)生了從HBeAg到抗HBeAg抗體的重要的自發(fā)血清轉(zhuǎn)換(以及同時(shí)HBVDNA水平的降低)，但是從HBsAg到抗HBsAg抗體的血清轉(zhuǎn)換和HBV從肝的清除非常罕見(每年1％或更低)。
慢性HBV感染定義為HBsAg持續(xù)超過六個(gè)月。HBV的持續(xù)是因?yàn)楣矁r(jià)閉環(huán)(cccDNA)的穩(wěn)定性質(zhì)、免疫特殊部位的感染和/或HBV特異性的免疫抑制。相信HBeAg在HBV持續(xù)中有重要作用，這通過經(jīng)由FAS介導(dǎo)的凋亡而耗盡HBeAg和HBcAg特異性Th1 CD4+T細(xì)胞(Milich等，J.Immunol 1602013-21，1998)。HBeAg跨越胎盤所以可以在新生兒建立對HBV的耐受，增加持續(xù)HBV感染垂直傳播的頻率。Th1/Th2反應(yīng)的失調(diào)通過抗炎細(xì)胞因子例如IL-4和IL-10的產(chǎn)生促進(jìn)了對HBeAg-HBcAg特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)和Th1效應(yīng)細(xì)胞的抑制(Ferrari等，J Immunol.1453442-9，1990；Milich等，1998同上，Milich等，Proc Natl Acad Sci USA.926847-51，1995)。還有其它的機(jī)制可能造成慢性HBV感染的個(gè)人全身性CD4+T細(xì)胞低反應(yīng)性，因?yàn)楫?dāng)與HBV陰性對照相比時(shí)對分裂素的反應(yīng)是降低的并且在抗HBV治療降低HBV病毒荷載后是增加的(Boni等，J Clin Inveest.102968-75，1998)。這個(gè)T細(xì)胞“低反應(yīng)性”可能來自HBV感染的樹狀突細(xì)胞功能的降低，它們有IFN-γ、TFN-α和IL-12產(chǎn)生的降低因而有降低的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的刺激(Beckebaum等，Immunology.109487-95，2003)。
總之，與成功清除感染的個(gè)體相比時(shí)，持續(xù)HBV感染中有功能性HBV特異性CD4+和CD8+細(xì)胞的降低。有持續(xù)性HBV感染的個(gè)體中，當(dāng)通過對HLA-A2陽性的慢性攜帶者完整HBV抗原或確定的表位之增殖反應(yīng)進(jìn)行評價(jià)時(shí)，HBV特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)顯著降低(Ferrari等，JImmunol.1453442-9，1990；Maini等，J Exp Med.1911269-80，2000)。特別是，在HBeAg陽性的慢性攜帶者，當(dāng)用四聚體(tetramers)測量時(shí)，幾乎檢測不到識別核心表位(在區(qū)域c18-27)的特異性CD8+T細(xì)胞，并且產(chǎn)生IFN-γ能力的降低。在肝中也發(fā)現(xiàn)了HBV特異性CD8+T細(xì)胞，這里它們可以造成炎性反應(yīng)但是在清除HBV感染是無效的(Jung等，Virology.261165-72，1999；Maini等，2000同上)。
宿主病毒關(guān)系是動態(tài)過程，其中許多病毒(例如HBV)試圖使它們的不可見最大化，而宿主試圖阻止和清除感染。最初，病毒必須結(jié)合并進(jìn)入靶細(xì)胞并且為了復(fù)制和感染其它的細(xì)胞而遷移到合適的細(xì)胞腔室。病毒可以激發(fā)感染的細(xì)胞以產(chǎn)生抑制一個(gè)或多個(gè)階段的病毒復(fù)制循環(huán)因而限制感染程度的細(xì)胞因子(例如TNF-α和IFN-γ)。
宿主單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在對病毒的早期反應(yīng)中有關(guān)鍵的作用，因?yàn)樗鼈兎置趯Ω腥揪哂虚g接和直接作用的促炎性細(xì)胞因子，例如IL-1、TNF-α、IL-6、IL-12和IL-18。它們還能夠招募單核細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞行使功能并且它們還能夠幫助轉(zhuǎn)換到合適的Th功能以幫助清除病毒。
作為Toll樣蛋白樣受體(TLR)激活的結(jié)果，發(fā)生了導(dǎo)致這些促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的對微生物病原體的天然免疫。TLR被鑒定為主要類型的模式識別受體。最近闡明了TLR參與細(xì)菌產(chǎn)物例如內(nèi)毒素和肽聚糖的作用(Akashi等，J Immunol.1643471-3475，2000；Takeuchi等，Immunity，11443-451，1999；Tapping等，J Immunol.1655780-5787，2000)。已經(jīng)鑒別了超過13個(gè)TLR并且它們在許多不同細(xì)菌的激活中有重要的作用。最近，這個(gè)被延伸到病毒，鼠模型中證實(shí)呼吸合胞體病毒(RSV)刺激了TLR-4(Kurt-Jones等，Nat Immunol.1398-401，2000；Haeberle等，J Infect Dis.1861199-1206，2002)。另外，已經(jīng)顯示麻疹病毒(MV)激活TLR-2依賴性信號(Bieback等，JVirol.768729-8736，2002)，并且已經(jīng)顯示雙鏈RNA(許多病毒的核心)通過TLR-3直接介導(dǎo)反應(yīng)(Matsumoto等，BiochemBiophys Res Commun.2931364-1369，2002)。
TLR的配體對TLR的刺激啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的復(fù)合網(wǎng)絡(luò)的激活以協(xié)調(diào)接著發(fā)生的炎性反應(yīng)。這些信號網(wǎng)絡(luò)的重要組分是銜接(adaptor)蛋白MyD88(及相關(guān)蛋白)、一些蛋白激酶(包括IRAK-1、p38 MAP激酶和IкB激酶)、TRAF6和轉(zhuǎn)錄因子NF-кB(圖7)。NF-кB的激活導(dǎo)致各種促炎性介質(zhì)(例如TNFα、IL-1、IL-6和MCR-1)的表達(dá)(Akira，S.J Biol Chem 278，38105-8；2003；Barton，G.M.&Medzhitov，R.Science300，1524-52003；Beutler，B.等，J LeukocBiol 74，479-85；2003)。TLR3和TLR4也能經(jīng)由MyD88非依賴性途徑傳導(dǎo)信號，涉及銜接分子TRIF(對于TLR3和4)和TRAM(對于TLR4)(Lien，E.& Golenbock，D.T.Nat Immunol 4，1162-4，2003)。
經(jīng)TLR激活而誘導(dǎo)的信號反過來控制特異性免疫反應(yīng)的激活。有證據(jù)證明特異性免疫系統(tǒng)只在病原體被天然免疫系統(tǒng)識別和處理后對病原體產(chǎn)生反應(yīng)。為了激活的發(fā)生，T細(xì)胞受體需要共刺激分子，例如CD80和CD86，與肽-MHC復(fù)合物一起表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞的表面。這些共刺激分子的表達(dá)部分受控于TLR(Pasare，C.& Medzhitov，R.Curr Opin Immunol 15，677-82，2003)。它們在激活B細(xì)胞產(chǎn)生類風(fēng)濕因子也是重要的(Leadbetter，E.A.等Nature416，603-72002)。
調(diào)查病原體介導(dǎo)的TLR的下調(diào)的作用以及開發(fā)通過輔助天然免疫系統(tǒng)抵抗感染的機(jī)制是需要的。
發(fā)明簡述除非上下文另外的需要，本說明書中自始自終，單詞“包含”或變體例如“包括”或“含有”將理解為意在包括陳述的元件或整體或者元件或整體組，但不排除任何其它元件或整體或者元件或整體組。
本發(fā)明鑒別了細(xì)胞表面標(biāo)記物，通過HBV特異性效應(yīng)分子的存在或不存在調(diào)節(jié)它們的表達(dá)或活性。有人提出細(xì)胞表面標(biāo)記物參與天然免疫，HBV指導(dǎo)的分子特異性調(diào)節(jié)這些標(biāo)記物的水平或活性。所以細(xì)胞表面標(biāo)記物和HBV特異性效應(yīng)分子是有用的治療和/或診斷靶點(diǎn)。特別是，本發(fā)明鑒別了在HBV特異性抗原存在下Toll樣蛋白樣受體(TLR)的調(diào)節(jié)，因而抗原和TLR是HBV感染有用的治療和診斷標(biāo)記物并監(jiān)測治療試驗(yàn)方案是有用的。在更加特定的實(shí)施方案中，HBV特異性效應(yīng)分子是前核心蛋白，例如細(xì)胞內(nèi)形式P22或P25或其分泌形式例如HBeAg。共同地，這些分子此處稱為“HBeAg/P22”。
依據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，鑒別出來TLR尤其是TLR-2和TLR-4在HBV或其突變形式的感染后受肝細(xì)胞上或內(nèi)HBeAg/P22的存在或不存在的差異影響。HBV突變形式包括前核心突變體和/或BCP突變體。前核心蛋白(P22)或其分泌形式(HBeAg)和TLR特別是TLR-2和TLR-4因而是治療或預(yù)防試劑的有用的靶點(diǎn)，包括治療或幫助預(yù)防HBV感染的疫苗。它們也是有用的診斷靶點(diǎn)以確定研究對象是否被HBV感染或已經(jīng)被HBV感染，或者研究對象是否容易被持續(xù)感染或具有持續(xù)感染或具有另外的疾病狀態(tài)，并且能用作臨床或流行病管理工具。
特別是，HBV感染導(dǎo)致了TLR的下調(diào)，這促進(jìn)了感染過程。突變HBV例如前核心突變體的感染導(dǎo)致了TLR的上調(diào)。
所以本發(fā)明提供了能夠調(diào)節(jié)HBV特異性效應(yīng)分子例如HBeAg/P22和/或TLR例如TLR-2和TLR-4的水平的治療和/或預(yù)防試劑。HBV特異性效應(yīng)分子包括上調(diào)或下調(diào)(即調(diào)節(jié))TLR例如TLR-2或TLR-4的任何分子。HBV中，例如，效應(yīng)分子是HBeAg/P22。
本發(fā)明還提供了檢測HBV感染或疾病狀態(tài)的存在或?qū)ζ湟赘行缘姆椒?，所述方法包括確定調(diào)節(jié)TLR信號傳遞水平的HBV特異性效應(yīng)分子的存在或不存在，其中效應(yīng)分子的存在或不存在或者TLR或TLR信號傳遞途徑內(nèi)組分的水平的升高或降低是HBV感染或相關(guān)疾病狀態(tài)的存在或?qū)ζ湟赘行缘闹刚鳌?br> 本發(fā)明還提供了通過調(diào)節(jié)TLR水平的HBV特異性效應(yīng)分子之存在和/或水平，或確定肝細(xì)胞上TLR(例如TLR-2和/或TLR-4)的水平，診斷或評價(jià)HBV感染的方法。
本發(fā)明還提供了通過確定調(diào)節(jié)TLR信號傳遞水平的HBV特異性效應(yīng)分子的存在和/或水平或者確定肝細(xì)胞上TLR和信號傳遞途徑組分例如TLR-2和/或TLR-4和NF-кB的水平診斷或評價(jià)HBV感染的方法。
所以本發(fā)明構(gòu)思了在HBV或其突變體感染或感染的易感性或持續(xù)性或清除的治療、預(yù)防和/或診斷中有用的治療和診斷試劑以及包含它們的組合物。本發(fā)明的這個(gè)方面特別延伸到HBV感染的治療和診斷以及有或沒有前核心突變的HBV感染之間的區(qū)別。
本發(fā)明也提供了治療感染了HBV或具有疾病狀態(tài)或?qū)ζ渚哂幸赘行缘难芯繉ο蟮姆椒?，所述方法包括給予所述研究對象有效量的試劑包括疫苗，該試劑下調(diào)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外前核心表達(dá)產(chǎn)物的水平或者上調(diào)或下調(diào)TLR水平。
本發(fā)明還提供了監(jiān)測對治療的反應(yīng)以及確定治療方案的效力的方法。
另外，本發(fā)明構(gòu)思了監(jiān)測對旨在抗HBV感染或疾病狀態(tài)發(fā)展的治療試驗(yàn)方案的反應(yīng)的方法，所述方法包括確定調(diào)節(jié)TLR信號傳遞的HBV特異性效應(yīng)分子的水平或活性，其中效應(yīng)分子的存在或不存在或者TLR或TLR信號傳遞途徑內(nèi)組分水平的升高或降低是HBV感染或相關(guān)疾病狀態(tài)的存在或?qū)ζ湟赘行缘闹刚鳌?br> 優(yōu)選的哺乳動物是人。本發(fā)明也構(gòu)思了動物模型。
附圖簡述

圖1是顯示了與前核心突變HBV感染的細(xì)胞相比，HBV野生型感染的細(xì)胞中TLR-2和TLR-4水平的圖解表示。采用了桿狀病毒系統(tǒng)。
圖2是顯示了與前核心突變HBV感染的細(xì)胞相比，HBV野生型感染的細(xì)胞中TLR-2和TLR-4水平的圖解表示。采用100moi桿狀病毒系統(tǒng)。
圖3是肝細(xì)胞上TLR2水平的圖解表示。上圖脂肪變性實(shí)例病人(陰影線)、慢性HBV患者(陰影)和同型對照(虛線)肝活檢組織肝細(xì)胞TLR2和TLR4的單個(gè)細(xì)胞懸浮液流式細(xì)胞儀柱狀圖。這個(gè)證實(shí)了與正常干活檢組織個(gè)體相比慢性HBV患者肝細(xì)胞表面上TLR2的下調(diào)。
下圖檢查了三個(gè)HBeAg陽性HBV感染患者、五個(gè)HBeAg陰性HBV感染患者和五個(gè)脂肪變性對照(C)的外周血和肝活檢組織。分析外周血(血液)CD14陽性單核細(xì)胞上的TLR2和TLR4。肝活檢組織分離成為單個(gè)細(xì)胞懸浮液并且在流式細(xì)胞儀上運(yùn)行。然后選擇枯否細(xì)胞和肝細(xì)胞并測量TLR2和TLR4。幾何平均熒光表達(dá)為與同型對照抗體的幾何平均熒光的比例。數(shù)據(jù)表示為TLR的改變％。顯示了各個(gè)試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。星號指出與對照相比p值＜0.05。
圖4是TLR2、TLR4和TNF-α水平改變的圖解表示。肝素化全血用各種劑量HBV病毒刺激20個(gè)小時(shí)，測量CD14陽性單核細(xì)胞上TLR2水平(B)和TLR4(A)。幾何平均熒光表達(dá)為與同型對照抗體的幾何平均熒光相比的比例。數(shù)據(jù)表示為TLR的改變％。圖(C)代表如ELISA測量的上清中的TNF-α。顯示了不同供者5個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。TLR2的結(jié)果是顯著的，有p＜0.02，如TNF結(jié)果有p＜0.02。
圖5是TLR水平和TNF-α水平的改變的圖解表示。肝素化全血用培養(yǎng)基(C)、野生型1×107個(gè)HBV病毒顆粒(WT)、肝炎B表面抗原(sAg)、HBV前核心蛋白(PC)和HBV核心蛋白(Co)刺激20個(gè)小時(shí)。測量CD14陽性單核細(xì)胞上TLR2和TLR4水平(上圖)。幾何平均熒光表達(dá)為與同型對照抗體的幾何平均熒光的比例。下圖代表如上證明的對于刺激的ELISA所測量的上清中的TNF-α。另外，證明了兩個(gè)不同基因型的HBV(A和D)。數(shù)據(jù)表示為TLR的改變％。顯示了不同供者5個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。星號指出與對照相比p值＜0.05。
圖6是顯示了TLR和TNF水平改變的圖解表示。流式細(xì)胞儀上運(yùn)行假感染(M)、前核心(PC)和核心(C)桿狀病毒構(gòu)建體的HepG2細(xì)胞并測量TLR2和TLR4。幾何平均熒光表達(dá)為與同型對照抗體的幾何平均熒光的比例(上圖)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為TLR的改變％。下圖代表進(jìn)行TaqMan即時(shí)PCR(QPCR)的相同細(xì)胞。這個(gè)在384孔平板上使用Assays-On-Demand基因表達(dá)產(chǎn)物(Applied Biosystems)和ABI Prism7900HT序列檢測儀(Applied Biosystems)進(jìn)行。使用比較Ct法確定PCR產(chǎn)物的相對量，這里靶DNA的量用18s標(biāo)準(zhǔn)化并是相對于假cDNA(2-ΔΔCT)。如前所述，通過定向誘變和共轉(zhuǎn)染使用1.3基因組長度的野生型(WT)HBV模板(基因型D，亞型ayw)(Invitrogen，Stratagene，CA)產(chǎn)生重組HBV桿狀病毒構(gòu)建體。平行地用每個(gè)細(xì)胞50個(gè)空斑形成單位(PFU)的復(fù)合感染(MOI)的WT、PC、BCP和PC/BCP重組HBV桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)HepG2細(xì)胞。染色進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析前，使用無胎牛血清的MEM制成單個(gè)懸浮細(xì)胞。數(shù)據(jù)代表三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。星號指出如非參數(shù)Mann Whitney-U測試所確定地與對照相比p值＜0.05。
圖7是TLR信號傳遞途徑的圖解表示。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明部分取決于如下的確定，即產(chǎn)生前核心蛋白或其分泌形式(例如HBeAg)的HBV的感染導(dǎo)致肝細(xì)胞(包括肝細(xì)胞和枯否細(xì)胞)和PBMC(包括外周單核細(xì)胞)中TLR-2和TLR-4水平的降低，而攜帶前核心突變和/或BCP突變的HBV的感染導(dǎo)致TLR-2和TLR-4的上調(diào)，并且也可以調(diào)節(jié)TLR信號傳遞。通過HBV特異性效應(yīng)分子、前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg確定TLR-2和TLR-4水平的調(diào)節(jié)。前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg的存在、不存在或水平或者TLR-2和TLR-4的水平和/或前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg的功能或活性提供了HBV感染或者造成感染或?qū)BV感染的易感性或其持續(xù)性的HBV的類型的診斷指征。另外，前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg、TLR-2和TLR-4成了包括疫苗的試劑的治療靶點(diǎn)，所述試劑調(diào)節(jié)前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg或TLR-2和/或TLR-4水平或TLR信號傳遞途徑組分。
前核心蛋白或其分泌形式例如HBeAg此后稱為“前核心蛋白/HBeAg”。本發(fā)明延伸到攜帶了前核心突變例如截?cái)?、點(diǎn)突變或無效突變的HBV變異體以及有下調(diào)HBV前核心基因轉(zhuǎn)錄的BCP突變的HBV變異體。
所以，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)前核心蛋白/HBeAg和/或TLR尤其是TLR-2和/或TLR-4的水平或者TLR信號傳遞途徑組分的試劑，確定前核心蛋白/HBeAg和/或TLR-2和/或TLR-4和/或TLR信號傳遞途徑組分的水平的診斷試劑，以及治療和/或預(yù)防感染的方法包括HBV感染的疫苗的開發(fā)。
本發(fā)明還構(gòu)思了監(jiān)測對治療試驗(yàn)方案的反應(yīng)的方法以及確定治療方案效力的方法。特別是，本發(fā)明提供了動物例如哺乳動物特別是人的感染和其它疾病狀態(tài)發(fā)展的臨床或流行病學(xué)管理工具。
本發(fā)明還允許有產(chǎn)生前核心蛋白/HBeAg的HBV或不基于TLR水平或TLR信號傳遞途徑組分的病毒(即，前核心和/或BCP突變體)的感染之間的區(qū)別。
相應(yīng)地，本發(fā)明的一個(gè)方面構(gòu)思了檢測HBV感染或疾病狀態(tài)或?qū)ζ湟赘行缘拇嬖诘姆椒ǎ龇椒òù_定調(diào)節(jié)TLR水平或活性的HBV特異性效應(yīng)分子的存在或不存在或者確定TLR或其同源物的水平或活性，其中效應(yīng)分子的存在或不存在或者TLR或其同源物水平的升高或降低是HBV感染或相關(guān)疾病狀態(tài)存在或?qū)ζ湟赘行缘闹刚鳌?br> 特別是，本發(fā)明提供了檢測HBV感染或疾病狀態(tài)或?qū)ζ湟赘行缘拇嬖诘姆椒?，所述方法包括確定調(diào)節(jié)TLR信號傳遞水平的HBV特異性效應(yīng)分子的存在或不存在，其中效應(yīng)分子的存在或不存在或者TLR或TLR信號傳遞途徑內(nèi)組分水平的升高或降低是HBV感染或相關(guān)疾病狀態(tài)的存在或?qū)ζ湟赘行缘闹刚鳌?br> 另外，本發(fā)明的另一個(gè)方面構(gòu)思了檢測HBV感染或疾病狀態(tài)或?qū)ζ湟赘行缘拇嬖诘姆椒?，所述方法包括確定調(diào)節(jié)TLR水平或活性的HBV特異性效應(yīng)分子的存在或不存在或者確定TLR或其同源物或TLR信號傳遞途徑的組分的水平或活性，其中效應(yīng)分子的存在或不存在或者TLR或其同源物或TLR信號傳遞途徑組分水平的升高或降低是HBV感染或相關(guān)疾病狀態(tài)存在或?qū)ζ湟赘行缘闹刚鳌?br> 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了監(jiān)測針對抗HBV感染或疾病狀態(tài)發(fā)展的治療試驗(yàn)方案的反應(yīng)的方法，所述方法包括確定HBV特異性效應(yīng)分子的水平或活性或者TLR或其同源物的水平或活性，其中效應(yīng)分子的存在或不存在或者TLR或其同源物水平的升高或降低、TLR信號傳遞途徑組分是HBV感染或相關(guān)疾病狀態(tài)存在或?qū)ζ湟赘行缘闹刚鳌?br> 本發(fā)明另一方面還涉及治療感染HBV或具有疾病狀態(tài)或?qū)ζ渚哂幸赘行缘难芯繉ο蟮姆椒?，所述方法包括給予所述研究對象有效量的試劑包括疫苗，所述試劑下調(diào)前核心蛋白/HBeAg或者上調(diào)或下調(diào)TLR或信號途徑組分的水平。
詳細(xì)描述本發(fā)明之前，將理解除非另外指出地，本發(fā)明不限于組分的特異性制劑、生產(chǎn)方法、給藥方案等等，因?yàn)檫@些可以不同。也將理解此處使用的術(shù)語只是為了描述特定實(shí)施方案的目的，而不是意在限制。
必須注意如本詳述中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述的”包括復(fù)數(shù)方面，除非上下文另外清楚地指出。因而，例如提到的“化合物”包括單個(gè)化合物以及兩個(gè)或多個(gè)化合物，提到的“活性劑”包括單個(gè)活性劑以及兩個(gè)或多個(gè)活性劑等等。
在描述和要求保護(hù)的本發(fā)明中，使用與下面設(shè)置的定義一致的如下的術(shù)語。
此處交叉使用術(shù)語“化合物”、“活性劑”、“藥理活性劑”、“藥劑”、“活性物(active)”和“藥物”，指的是誘導(dǎo)期望藥理和/或生理作用的化學(xué)化合物。術(shù)語也包含此處特別提到的那些活性劑的藥物可接受和藥理活性成分，包括但不限于鹽、酯、酰胺、前藥、活性代謝物、類似物等等。當(dāng)使用術(shù)語“化合物”、“活性劑”、“藥理活性劑”、“藥劑”、“活性物”和“藥物”時(shí)，將理解這包括活性劑本身以及藥物可接受的藥理活性鹽、酯、酰胺、前藥、代謝物、類似物等等。術(shù)語“化合物”不僅僅解釋為化學(xué)化合物，還延伸到肽、多肽和蛋白質(zhì)以及遺傳分子例如RNA、DNA和其化學(xué)類似物。提到的“肽”、“多肽”或“蛋白質(zhì)”包括有多糖或脂多糖組分的分子。術(shù)語“拮抗劑”是下調(diào)前核心蛋白/HBeAg或其它病原體特異性效應(yīng)分子的水平或者下調(diào)TLR的化合物、活性劑、藥理活性劑、藥劑、活性物和藥物的實(shí)例?！凹觿被颉霸鰪?qiáng)劑”上調(diào)前核心蛋白/HBeAg或TLR例如TLR-2或TLR-4的水平。
本發(fā)明延伸到疫苗以及化合物或試劑的組合，例如TLR-2和/或4的激動劑或拮抗劑和核苷類似物或抗前核心/HBeAg抗體，或者抗病毒細(xì)胞因子(例如，IFN-∝、IFN-γ、IL-2、TNF-∝)或其它免疫調(diào)節(jié)劑。
所以本發(fā)明構(gòu)思了用于調(diào)節(jié)前核心蛋白/HBeAg或TLR例如TLR-2和/或TLR-4的水平或者增強(qiáng)一般或特異性TLR信號傳遞的化合物。化合物對于降低或預(yù)防或治療HBV感染或治療另一個(gè)疾病狀態(tài)有作用。攜帶要調(diào)節(jié)的TLR的優(yōu)選細(xì)胞包括肝臟細(xì)胞。肝臟細(xì)胞包括肝細(xì)胞。提到的“化合物”、“活性劑”、“藥理活性劑”、“藥劑”、“活性物”和“藥物”包括兩個(gè)或多個(gè)活性物的組合，例如前核心蛋白/HBeAg的拮抗劑或TLR或TLR信號傳遞的激動劑或增強(qiáng)子?！敖M合”也包括多個(gè)部分，例如兩個(gè)部分的藥物組合物，這里試劑分別提供，分別給予或分發(fā)或者分發(fā)前混合到一起。
例如，多部分藥物包裝可以具有前核心蛋白/HBeAg或TLR的調(diào)節(jié)劑以及一個(gè)或多個(gè)抗微生物或抗病毒的試劑。使用術(shù)語“調(diào)節(jié)”或其衍變物例如“調(diào)控”或“調(diào)整”描述上調(diào)或下調(diào)。
如此處使用的術(shù)語“有效量”和“治療有效量”的試劑指提供期望的治療或生理作用的足夠量的試劑。另外，“有效調(diào)節(jié)HBeAg或調(diào)解TLR的量”的試劑是足夠量的試劑直接或間接上調(diào)或下調(diào)前核心蛋白/HBeAg的功能或者上調(diào)或下調(diào)特異性TLR例如TLR-2或TLR-4或者增強(qiáng)TLR信號傳遞。這個(gè)可以通過例如起前核心蛋白/HBeAg拮抗劑或TLR或其信號組分的激動劑(即增強(qiáng)子)作用的試劑來完成，例如本身是或模仿LTR信號途徑組分的試劑，或者通過經(jīng)由其它細(xì)胞受體誘導(dǎo)TLR信號傳遞途徑的試劑或者拮抗TLR信號傳遞組分的抑制劑的試劑來完成。非期望的作用例如副作用有時(shí)和期望的治療作用一起呈現(xiàn)；因而，執(zhí)業(yè)醫(yī)生權(quán)衡可能的利益和可能的危險(xiǎn)決定什么是合適的“有效量”。所需的確切量將隨著研究對象不同而不同，依賴于物種、研究對象的年齡和一般狀態(tài)、給藥模式等等。因而，明確確切的“有效量”是不可能的。然而，任何個(gè)體情況下合適的“有效量”可由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員只是用常規(guī)試驗(yàn)確定。
“藥物可接受的”載體、賦形劑或稀釋劑指的是藥物載體，包含不是生物學(xué)上或其它非期望的材料，即材料可以和所選的活性劑一起給予研究對象而不造成任何或基本副反應(yīng)。載體包括賦形劑和其它添加劑例如稀釋劑、去污劑、染色劑、濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑、防腐劑等等。藥物組合物根據(jù)制劑也可描述為疫苗組合物。
相似地，如此處提供的“藥物可接受的”鹽、酯、酰胺、前藥或化合物的衍生物是非生物學(xué)上或其它非期望的鹽、酯、酰胺、前藥或衍生物。
如此處使用的術(shù)語“治療的”和“治療”指的是感染或疾病的癥狀的嚴(yán)重程度和/或頻率、癥狀和/或潛在原因的消除、感染癥狀和/或它們的潛在原因發(fā)生的預(yù)防以及損傷的改善或糾正。間接損傷例如在病毒感染之后可以是肝損傷例如肝硬化或肝臟的肝細(xì)胞癌。
“治療”患者涉及通過抑制感染或其它疾病狀態(tài)或下游狀態(tài)例如肝損傷或癌癥對易感個(gè)體感染或其它疾病狀態(tài)或不良生理事件的預(yù)防以及有臨床癥狀的個(gè)體的治療。一般地，這樣的狀態(tài)或紊亂是感染，更加特別的是病毒感染，甚至更加特別的是HBV的感染。因而，例如，“治療”有感染或?qū)θ菀装l(fā)展感染的患者的主題方法包括感染或其它疾病狀態(tài)的預(yù)防以及一旦確立感染或其它疾病狀態(tài)的治療。
提到的“HBV”或其全名“乙型肝炎病毒”包括所有的變異體，包括對特定治療試劑例如核苷類似物或免疫試劑耐受的變異體。特別重要的變異體是HBV的前核心和/或BCP突變體。
如此處使用的“患者”指的是能從藥物制劑和本發(fā)明的方法受益的動物，優(yōu)選地是哺乳動物，更加優(yōu)選的是人。對于能從目前描述的藥物制劑和方法受益的動物類型沒有限制。不管是人或非人的動物患者可以稱為個(gè)體、研究對象、動物、宿主或接受者。本發(fā)明的化合物和方法可以應(yīng)用于人醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)以及一般的家畜或野生動物的飼養(yǎng)。
本發(fā)明的化合物可以是大或小分子、核酸分子(包括反義或正義分子)、肽、多肽或蛋白質(zhì)或雜交分子例如RNAi或siRNA復(fù)合物(包括RISC復(fù)合物和Dicer復(fù)合物)、核酶或DNAzyme?；衔镄枰揎検沟眠M(jìn)入細(xì)胞更容易。如果化合物與細(xì)胞外受體相互作用那么這個(gè)修飾不是必需的。試劑的實(shí)例包括與前核心蛋白/HBeAg或TLR或調(diào)節(jié)前核心表達(dá)的遺傳分子相互作用的化學(xué)試劑以及抗體。
如上面指出地，優(yōu)選的動物是人。
實(shí)驗(yàn)室測試動物(包括動物模型)的實(shí)例包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和倉鼠。兔和嚙齒類動物例如大鼠和小鼠提供了方便的測試系統(tǒng)或動物模型。家畜類動物包括綿羊、牛、豬、山羊、馬和驢。也構(gòu)思了非哺乳動物動物例如鳥類(例如鴨)、斑馬魚、兩棲動物(包括甘蔗蟾蜍)和果蠅類例如黑素原果蠅(Drosophila melanogaster)。
所以本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)(例如激動或拮抗)前核心蛋白/HBeAg或調(diào)節(jié)(即增強(qiáng)或激活或拮抗)TLR例如TLR-2和/或TLR-4的試劑。
本發(fā)明構(gòu)思了篩選如下試劑的方法，包括例如候選藥物與前核心蛋白/HBeAg或TLR例如TLR-2或TLR-4或其部分接觸。前核心蛋白/HBeAg或TLR分子此處稱為是“靶”或“靶分子”。篩選步驟包括分析(i)藥物和靶點(diǎn)之間復(fù)合物的存在，或(ii)編碼靶點(diǎn)的核酸分子的表達(dá)水平的改變。一種形式的試驗(yàn)涉及競爭結(jié)合試驗(yàn)。這樣的競爭結(jié)合試驗(yàn)中，靶點(diǎn)一般是標(biāo)記的。游離的靶點(diǎn)從任何推測的復(fù)合物中分離，游離(即未復(fù)合的)標(biāo)記物的量是受試試劑與靶分子結(jié)合的測量指標(biāo)。也可以測量結(jié)合而不是游離靶點(diǎn)的量。標(biāo)記化合物而不是靶點(diǎn)并且測量化合物在受試藥物存在和不存在下與靶點(diǎn)結(jié)合的量也是可能的。這樣的化合物可以抑制對于例如發(fā)現(xiàn)前核心蛋白/HBeAg的調(diào)節(jié)劑或HBV感染的治療或預(yù)防所需的TLR的調(diào)節(jié)劑是有用的靶點(diǎn)。
藥物篩選的另一個(gè)技術(shù)提供了對靶點(diǎn)具有合適的結(jié)合親和力并且在Geysen(國際專利
發(fā)明者S·盧卡尼尼, K·維斯瓦納坦 申請人:墨爾本保健公司, 默多克兒童研究所