專利名稱：酶法拆分制備l－蛋氨酸－的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種外消旋化合物的拆分方法，是一種生化制品的制備方法，尤其涉及一種酶法拆分制備L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法。
背景技術(shù)：
蛋氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位之一，是必需氨基酸中唯一含有硫的氨基酸，它除了參與動物體內(nèi)甲基的轉(zhuǎn)移及磷的代謝和腎上腺素、膽堿和肌酸的合成外，還是合成蛋白質(zhì)和胱氨酸的原料。蛋氨酸無法在動物體內(nèi)合成，需從食物中攝人，將它加入飼料中，可以促進(jìn)禽畜生長、增加瘦肉量和達(dá)到縮短飼養(yǎng)周期的效果。在動物飼料中添加1kg蛋氨酸，相當(dāng)于50kg魚粉的營養(yǎng)價(jià)值，一般添加量為0.05％～0.2％。畜禽缺少蛋氨酸時(shí)，表現(xiàn)為發(fā)育不良、體重減輕、肝和腎機(jī)能受到破壞，并伴有肌肉萎縮和毛質(zhì)變壞等現(xiàn)象。蛋氨酸不僅在飼料工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、保健業(yè)及食品業(yè)中有廣泛的用途、還可用于生化研究、照相技術(shù)、化妝品、香料等領(lǐng)域。L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N作為一種示蹤劑在生理和生命科學(xué)研究中得到了有效的應(yīng)用，國內(nèi)和國際市場前景廣闊，而且價(jià)格不菲。
L-蛋氨酸的生產(chǎn)方法主要有四種，即蛋白水解提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn)化法。D-蛋氨酸的生產(chǎn)方法主要有拆分法和生物法。拆分法主要包括結(jié)晶拆分法、手性試劑拆分法、色譜拆分法、膜拆分法、酶拆分法等。生物法主要是指對用化學(xué)合成法獲得的外消旋乙酰-蛋氨酸經(jīng)D-型氨基?；柑幚砗笊蒁-蛋氨酸的方法。
目前，世界上蛋氨酸的主要生產(chǎn)國是法國、美國、日本和德國、年總生產(chǎn)能力約為38萬噸，年總產(chǎn)量約為30萬噸。我國自50年代開始研究化學(xué)法合成蛋氨酸，并獲得成功，與國外相比存在的主要差距是生產(chǎn)規(guī)模小、以間歇操作為主?？刂扑降?、成本高、收率低。
中國專利CN1504577A所述發(fā)明涉及了一種利用大腸桿菌基因工程菌中的氨基?；负铣蒐-蛋氨酸的方法；中國專利CN1196392A所述發(fā)明涉及了一種氨基?；饷覆鸱只煨鞍彼嶂谱笮鞍彼岬姆椒ǎ恢袊鴮＠鸆N1263153A所述發(fā)明涉及了一種米曲霉菌體固定化制備氨基?；傅姆椒安鸱只煨被岬难b置；中國專利CN1306092A所述發(fā)明涉及了一種固定化氨基?；饷覆鸱滞庀被嵘a(chǎn)左旋氨基酸的方法，該法對混旋乙酰氨基酸進(jìn)行脫乙酰生成L-氨基酸后，對D-乙酰氨基酸進(jìn)行外消旋再混入下一步拆分；世界專利WO00/23598所述發(fā)明涉及了一種用D型氨基?；覆鸱种频肈型氨基酸的方法?；瘜W(xué)試劑，1992，14(1)，36～39涉及了一種固定化?；被崴饷傅闹苽浼捌湓贚-氨基酸和D-氨基酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了提供一種酶法拆分制備L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法，使用該方法獲得的L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N產(chǎn)品收率高、光學(xué)純度高、化學(xué)純度高、豐度不下降。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)酶法拆分制備L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法，其特征在于，該方法采用游離米曲霉菌體細(xì)胞或直接用氨基?；覆鸱諨L-蛋氨酸-15N，以外消旋乙酰-蛋氨酸-15N(N-AC-DL-Met-15N)為原料，以游離米曲霉菌體細(xì)胞中的氨基?；?EC.3，5，14)或氨基酰化酶粉為水解催化劑，將外消旋乙酰-蛋氨酸-15N按照0.05-0.3mol/L的濃度，每克底物加入1～8g游離米曲霉菌體細(xì)胞或0.05～0.3g氨基酰化酶酶粉，于37℃，一定的搖床轉(zhuǎn)速下，反應(yīng)35～60小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液濃縮至一定濃度后經(jīng)1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂處理后，有效的分離了酶反應(yīng)液中的N-乙酰-D-蛋氨酸-15N和L-蛋氨酸-15N，并去除雜酸，同時(shí)得到產(chǎn)品L-蛋氨酸-15N和初級產(chǎn)品N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；接下來對N-乙酰-D-蛋氨酸-15N經(jīng)鹽酸水解后，采用1500H型強(qiáng)酸性離子交換樹脂處理去除雜質(zhì)和雜酸，可得到D-蛋氨酸-15N產(chǎn)品。
該方法的具體工藝路線如下
該方法拆分DL-蛋氨酸-15N制備L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的步驟如下(1)游離米曲霉菌體細(xì)胞的制備由于菌種長時(shí)間使用、傳代次數(shù)頻繁、雜菌污染等原因，經(jīng)常會引起菌種退化，因此，在使用前要進(jìn)行純化，篩選出一株酶活較高、遺傳性能穩(wěn)定的菌株備用；取一支儲存斜面，用接種環(huán)挑取5環(huán)斜面孢子，放入裝有100ml無菌水的三角瓶中，充分搖蕩，并進(jìn)一步稀釋至10-4～10-8倍，各吸取0.1～0.3ml于直徑為9cm已裝有察氏培養(yǎng)基的平皿中，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4天；長出綠色孢子后，挑選單菌落轉(zhuǎn)入察氏培養(yǎng)基斜面，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天；長出綠色孢子后，向各管加入無菌水1～5ml，用玻璃棒輕輕攪拌，吸取0.2～1.0ml孢子懸液接入到裝有20～60ml黃豆汁培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于30℃，150～220rpm振蕩培養(yǎng)35～60h；下?lián)u床，抽濾，蒸餾水洗凈，收集直徑在2.0～3.0mm的米曲霉菌體小球備用；(2)酶反應(yīng)底物的配制取一定量的N-乙酰-DL-蛋氨酸-15N，用稀NaOH溶解后定容至0.05-0.30mol/L的濃度，再用稀鹽酸調(diào)至pH6～8，按照每克底物加入1～8g游離米曲霉菌體細(xì)胞或0.05～0.3g氨基?；该阜鄣谋壤尤胗坞x的米曲霉菌體細(xì)胞或氨基酰化酶酶粉；(3)37℃，一定的搖床轉(zhuǎn)速下，保溫反應(yīng)35～60小時(shí)；(4)反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液濃縮至原體積的1/6～1/3，用2mol/L鹽酸調(diào)pH至1～3，以0.01～0.05ml/min.g載體的流速勻速流過裝有1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的離子交換柱，開始收集流出的N-乙酰-D L-蛋氨酸-15N；(5)反應(yīng)液流凈后用水洗3遍以減少損失，然后用蒸餾水洗至流出液無色，pH中性，無N-乙酰-D L-蛋氨酸-15N流出時(shí)，結(jié)束收集N-乙酰-D L-蛋氨酸-15N；改用0.05～0.5mol/L的氯化銨洗脫，此時(shí)用自動收集器收集流出液，紙層析點(diǎn)樣，確定含有L-蛋氨酸-15N的管數(shù)；(6)合并上述氯化銨洗脫液體，在40～60℃下對其進(jìn)行濃縮后，以0.01～0.05ml/min.g載體的流速勻速流過裝有1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的離子交換柱，水洗以除去氯化銨，待流出液無Cl-后，改用0.05～0.3mol/L的氨水洗脫，收集單斑，在40～60℃下濃縮，趕氨，經(jīng)活性炭脫色，最后在60～90℃下用乙醇結(jié)晶，-18℃結(jié)晶過夜，抽濾晶體，并用-18℃的無水乙醇反復(fù)洗滌，經(jīng)真空干燥得到獲得L-蛋氨酸-15N產(chǎn)品；(7)合并(5)中水洗脫液體，在40～60℃下濃縮，獲得初級產(chǎn)品N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；將其在80～100℃下，以氮?dú)獗Ｗo(hù)，用2～6mol/L的鹽酸水解，N-乙酰-D-蛋氨酸-15N與鹽酸的質(zhì)量體積比在1∶5～1∶20之間，回流反應(yīng)時(shí)間為1.5～10小時(shí)之間，直至水解完全；(8)水解反應(yīng)結(jié)束后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下降至室溫，用10mol/L的NaOH調(diào)pH至1～3，以0.01～0.05ml/min.g載體的流速勻速流過裝有1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的離子交換柱，水洗以除去氯化鈉等雜質(zhì)，待流出液無色無Cl-后改用0.05～0.3mol/L的氨水洗脫，收集單斑后在40～60℃下濃縮，趕氨，經(jīng)活性炭脫色，最后在60～90℃下用乙醇結(jié)晶，-18℃結(jié)晶過夜，抽濾晶體，并用-18℃的無水乙醇反復(fù)洗滌，經(jīng)真空干燥得到D-蛋氨酸-15N產(chǎn)品。
本發(fā)明方法簡練，設(shè)備易得，采用兩步水解法，從N-乙酰-DL-蛋氨酸-15N中獲得了L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N兩種產(chǎn)品。通過1500H型強(qiáng)酸性離子交換樹脂處理，有效的分離了酶反應(yīng)液中的N-乙酰-D-蛋氨酸-15N和L-蛋氨酸-15N，并實(shí)現(xiàn)了L-蛋氨酸-15N和雜酸的完全分離，使用該方法獲得的L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N產(chǎn)品收率高、光學(xué)純度高、化學(xué)純度高、豐度不下降。采用氮?dú)獗Ｗo(hù)回流有效地解決了高溫時(shí)蛋氨酸遇氧分解的問題。
本發(fā)明，以N-乙酰-DL-蛋氨酸-15N為原料，同時(shí)獲得化學(xué)純和光學(xué)純的L和D兩種類型蛋氨酸-15N產(chǎn)品。外消旋N-乙酰-DL-蛋氨酸-15N經(jīng)L-型氨基?；柑幚?，脫乙?；缮蒐-蛋氨酸-15N，未反應(yīng)的N-乙酰-蛋氨酸-15N經(jīng)水解可得蛋氨酸-15N。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1取儲存斜面一支，用接種環(huán)挑取5環(huán)斜面孢子，放入裝有100ml無菌水的三角瓶中，充分搖蕩，并進(jìn)一步稀釋至10-4～10-8倍。各吸取0.2ml于直徑為9cm的裝有察氏培養(yǎng)基的平皿中，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。長出綠色孢子后，挑選單菌落轉(zhuǎn)入察氏培養(yǎng)基斜面，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，長出綠色孢子后，向各管加入無菌水3ml，用玻璃棒輕輕攪拌，吸取0.5ml孢子懸液接入到裝有50ml黃豆汁培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)50h。下?lián)u床后抽濾，用蒸餾水洗凈，收集直徑在2.0～3.0mm的米曲霉菌體小球備用。
實(shí)施例2稱取5g乙酰-DL-蛋氨酸固體，先用稀的NaoH溶解，然后定容至500ml，再用稀鹽酸調(diào)至pH7.0左右，稱取25g濕的游離米曲霉菌體細(xì)胞或0.5g氨基酰化酶酶粉混入配制的底物中，將裝有底物和酶的三角燒瓶放入水域搖床中37℃下，120轉(zhuǎn)/min保溫反應(yīng)48小時(shí)后停止反應(yīng)，此時(shí)水解率接近100％。反應(yīng)液于45℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸至原體積的1/5，用2mol/L鹽酸調(diào)pH至2左右，以0.04ml/min.g載體的流速勻速流過裝有300ml的1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的離子交換柱。開始收集流出的N-乙酰-D L-蛋氨酸-15N，上柱液流凈后用蒸餾水洗滌3遍，然后用蒸餾水洗柱子，至流出液無色，pH中性，無N-乙酰-D L-蛋氨酸-15N流出時(shí)，結(jié)束收集N-乙酰-D L-蛋氨酸-15N。改用0.1～0.2mol/L的氯化銨梯度洗脫，用自動收集器收集流出液，紙層析點(diǎn)樣以確定含有L-蛋氨酸-15N的管數(shù)。合并上述氯化銨洗脫液體，在45℃下對其進(jìn)行濃縮后，再次以0.04ml/min.g載體的流速勻速流過裝有300ml的1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的離子交換柱，水洗以除去氯化銨，待流出液無Cl-后改用0.1mol/L的氨水洗脫，收集單斑，在45℃下濃縮、趕氨，經(jīng)活性炭脫色，最后在80℃下用乙醇結(jié)晶，-18℃結(jié)晶過夜，抽濾晶體，并用-18℃的無水乙醇反復(fù)洗滌，經(jīng)真空干燥得到L-蛋氨酸-15N產(chǎn)品1.69g，豐度為98.36at.％，純度為99.5％，收率為86.7％，旋光度[α]D21＝+21.7±1°(c＝1，HCl)。
實(shí)施例3合并實(shí)施例2中第一次上柱的水洗脫液體，在45℃下對其進(jìn)行濃縮，獲得N-乙酰-D-蛋氨酸-15N濃縮液，將其在90℃下，以氮?dú)獗Ｗo(hù)，用4mol/L的鹽酸水解，N-乙酰-D-蛋氨酸-15N與鹽酸的質(zhì)量體積比在1∶10，回流反應(yīng)時(shí)間為5小時(shí)。水解反應(yīng)結(jié)束后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下待溫度降至室溫后，用10mol/L的NaoH調(diào)pH至2左右，以0.04ml/min.g載體的流速勻速流過裝有300ml的1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的離子交換柱，水洗以除去氯化鈉等雜質(zhì)，待流出液無色無Cl-后改用0.2mol/L的氨水洗脫，收集單斑后在45℃下濃縮、趕氨，經(jīng)活性炭脫色，最后在80℃下用乙醇結(jié)晶，-18℃結(jié)晶過夜，抽濾晶體，并用-18℃的無水乙醇反復(fù)洗滌，經(jīng)真空干燥得到D-蛋氨酸-15N產(chǎn)品1.54g，豐度為98.35at.％，純度為99.5％，收率為78.97％，旋光度[α]D21＝-21.7±1°(c＝1，HCl)。
權(quán)利要求
1.酶法拆分制備L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法，其特征在于，該方法采用游離米曲霉菌體細(xì)胞或直接用氨基?；覆鸱諨L-蛋氨酸-15N，以外消旋乙酰-蛋氨酸-15N(N-AC-DL-Met-15N)為原料，以游離米曲霉菌體細(xì)胞中的氨基酰化酶(EC.3，5，14)或氨基?；阜蹫樗獯呋瘎?，將外消旋乙酰-蛋氨酸-15N按照0.05-0.3mol/L的濃度，每克底物加入1～8g游離米曲霉菌體細(xì)胞或0.05～0.3g氨基?；该阜?，于37℃，一定的搖床轉(zhuǎn)速下，反應(yīng)35～60小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液濃縮至一定濃度后經(jīng)1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂處理后，有效的分離了酶反應(yīng)液中的N-乙酰-D-蛋氨酸-15N和L-蛋氨酸-15N，并去除雜酸，同時(shí)得到產(chǎn)品L-蛋氨酸-15N和初級產(chǎn)品N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；接下來對N-乙酰-D-蛋氨酸-15N經(jīng)鹽酸水解后，采用1500H型強(qiáng)酸性離子交換樹脂處理去除雜質(zhì)和雜酸，可得到D-蛋氨酸-15N產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法拆分制備L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法，其特征在于，該方法的具體工藝路線如下
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法拆分制備L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的方法，其特征在于，該方法拆分DL-蛋氨酸-15N制備L-蛋氨酸-15N和D-蛋氨酸-15N的步驟如下(1)游離米曲霉菌體細(xì)胞的制備由于菌種長時(shí)間使用、傳代次數(shù)頻繁、雜菌污染等原因，經(jīng)常會引起菌種退化，因此，在使用前要進(jìn)行純化，篩選出一株酶活較高、遺傳性能穩(wěn)定的菌株備用；取一支儲存斜面，用接種環(huán)挑取5環(huán)斜面孢子，放入裝有100ml無菌水的三角瓶中，充分搖蕩，并進(jìn)一步稀釋至10-4～10-8倍，各吸取0.1～0.3ml于直徑為9cm已裝有察氏培養(yǎng)基的平皿中，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4天；長出綠色孢子后，挑選單菌落轉(zhuǎn)入察氏培養(yǎng)基斜面，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天；長出綠色孢子后，向各管加入無菌水1～5ml，用玻璃棒輕輕攪拌，吸取0.2～1.0ml孢子懸液接入到裝有20～60ml黃豆汁培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于30℃，150～220rpm振蕩培養(yǎng)35～60h；下?lián)u床，抽濾，蒸餾水洗凈，收集直徑在2.0～3.0mm的米曲霉菌體小球備用；(2)酶反應(yīng)底物的配制取一定量的N-乙酰-DL-蛋氨酸-15N，用稀NaOH溶解后定容至0.05-0.30mol/L的濃度，再用稀鹽酸調(diào)至pH6～8，按照每克底物加入1～8g游離米曲霉菌體細(xì)胞或0.05～0.3g氨基?；该阜鄣谋壤尤胗坞x的米曲霉菌體細(xì)胞或氨基?；该阜?；(3)37℃，一定的搖床轉(zhuǎn)速下，保溫反應(yīng)35～60小時(shí)；(4)反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液濃縮至原體積的1/6～1/3，用2mol/L鹽酸調(diào)pH至1～3，以0.01～0.05ml/min.g載體的流速勻速流過裝有1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的離子交換柱，開始收集流出的N-乙酰-D L-蛋氨酸-15N；(5)反應(yīng)液流凈后用水洗3遍以減少損失，然后用蒸餾水洗至流出液無色，pH中性，無N-乙酰-D L-蛋氨酸-15N流出時(shí)，結(jié)束收集N-乙酰-D L-蛋氨酸-15N；改用0.05～0.5mol/L的氯化銨洗脫，此時(shí)用自動收集器收集流出液，紙層析點(diǎn)樣，確定含有L-蛋氨酸-15N的管數(shù)；(6)合并上述氯化銨洗脫液體，在40～60℃下對其進(jìn)行濃縮后，以0.01～0.05ml/min.g載體的流速勻速流過裝有1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的離子交換柱，水洗以除去氯化銨，待流出液無Cl-后，改用0.05～0.3mol/L的氨水洗脫，收集單斑，在40～60℃下濃縮，趕氨，經(jīng)活性炭脫色，最后在60～90℃下用乙醇結(jié)晶，-18℃結(jié)晶過夜，抽濾晶體，并用-18℃的無水乙醇反復(fù)洗滌，經(jīng)真空干燥得到獲得L-蛋氨酸-15N產(chǎn)品；(7)合并(5)中水洗脫液體，在40～60℃下濃縮，獲得初級產(chǎn)品N-乙酰-D-蛋氨酸-15N；將其在80～100℃下，以氮?dú)獗Ｗo(hù)，用2～6mol/L的鹽酸水解，N-乙酰-D-蛋氨酸-15N與鹽酸的質(zhì)量體積比在1∶5～1∶20之間，回流反應(yīng)時(shí)間為1.5～10小時(shí)之間，直至水解完全；(8)水解反應(yīng)結(jié)束后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下降至室溫，用10mol/L的NaOH調(diào)pH至1～3，以0.01～0.05ml/min.g載體的流速勻速流過裝有1500H型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂的離子交換柱，水洗以除去氯化鈉等雜質(zhì)，待流出液無色無Cl-后改用0.05～0.3mol/L的氨水洗脫，收集單斑后在40～60℃下濃縮，趕氨，經(jīng)活性炭脫色，最后在60～90℃下用乙醇結(jié)晶，-18℃結(jié)晶過夜，抽濾晶體，并用-18℃的無水乙醇反復(fù)洗滌，經(jīng)真空干燥得到D-蛋氨酸-15N產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶法拆分制備L－蛋氨酸－
文檔編號C12P41/00GK1884566SQ20051002711
公開日2006年12月27日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者呂志賢, 羅鳳山, 孫建春, 杜曉寧, 李良君 申請人:上?；ぱ芯吭?br>