專利名稱：一種缺失e1a編碼序列的重組腺病毒構(gòu)建體的獲得及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在人類5型腺病毒(Human adenovirus type 5)的基因組中定點(diǎn)缺失(delete)E1A編碼序列的構(gòu)建方案，以及通過該方案得到的具有腫瘤治療、診斷作用的腺病毒構(gòu)建體，屬于醫(yī)學(xué)基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
近年腫瘤細(xì)胞生物學(xué)、基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，已經(jīng)為滿足這一社會需求提供了現(xiàn)實(shí)的可能性，其中基因治療方法在腫瘤治療的臨床試用中，已經(jīng)顯示出良好的應(yīng)用前景。從1989年至2000年底，美國生物制品評價(jià)和研究中心(Center for Biologics Evaluationsand Research，CBER)批準(zhǔn)的臨床基因治療試驗(yàn)項(xiàng)目已超過350項(xiàng)，其中約有70％的項(xiàng)目為腫瘤基因治療，部分已經(jīng)進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)，取得了較好的療效，如以單純皰疹病毒胸苷酸激酶(HSV-TK)基因及胞苷脫氧酶(CD)基因?yàn)榇淼摹白詺ⅰ被蛑委?，部分臨床試驗(yàn)結(jié)果令人振奮。
目前腫瘤臨床試用的絕大部分載體為缺失了E1及E3區(qū)的復(fù)制缺陷性腺病毒，進(jìn)入腫瘤病灶后，對腫瘤的殺滅效應(yīng)依賴于體外高濃度治療腺病毒的輸入，距離注射點(diǎn)較遠(yuǎn)的病灶的殺滅效應(yīng)較弱。為此，近年來，出現(xiàn)了從復(fù)制缺陷性腺病毒載體向條件復(fù)制性腺病毒載體(conditionally replicative adenovirus)轉(zhuǎn)化的新的發(fā)展趨勢，所謂條件性復(fù)制腺病毒載體是指載體能選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，將腫瘤細(xì)胞作為生產(chǎn)腺病毒的場所，最終達(dá)到裂解殺滅腫瘤細(xì)胞的治療目的，腫瘤細(xì)胞裂解釋放出高濃度的腺病毒后，可進(jìn)一步感染距離注射點(diǎn)較遠(yuǎn)的病灶腫瘤細(xì)胞，形成新一輪的感染波，周而復(fù)始形成一種正反饋，達(dá)到最大的治療效應(yīng)。此類載體另一個(gè)非常理想的優(yōu)勢是它們不能在正常細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制，因此對正常細(xì)胞無任何殺傷效應(yīng)，某些權(quán)威醫(yī)學(xué)雜志通俗地將之比喻為殺滅腫瘤的“聰明炸彈”(smart bomb)。在實(shí)際應(yīng)用中，已經(jīng)取得了較好的預(yù)期效果，在第21屆美國腫瘤研究年會上，來自休斯頓Anderson腫瘤中心的一份研究報(bào)告表明局部注射后，復(fù)制缺陷性腺病毒在人體惡性膠質(zhì)瘤病灶中的分布較局限，在一定程度上影響了療效的發(fā)揮，與此形成鮮明的對比，能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制的腺病毒ONYX-015，通過在腫瘤局部的增殖，其分布遍及全瘤灶，取得顯著療效。ONYX-015是美國ONYX藥物生物技術(shù)公司近年研制出的能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制的腺病毒，其構(gòu)建特點(diǎn)是在野生型人類5型腺病毒(wild-type)的基因組上，部分缺失(delete)E1B55kDa的編碼序列，并加入翻譯終止信號，但保留19kDa E1B的編碼序列。在正常情況下，野生型腺病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖依賴于E1B 55 kDa蛋白對p53蛋白功能的滅活。在攜帶正常p53基因的正常細(xì)胞，ONYX-015由于缺乏E1B 55 kDa，不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖。相反，由于惡性腫瘤患者p53基因的失活率高達(dá)50-70％，ONYX-015因而能在腫瘤細(xì)胞中增殖復(fù)制最終裂解細(xì)胞，因而ONYX-015具有殺滅腫瘤細(xì)胞的高度選擇性，而對正常細(xì)胞無殺傷效應(yīng)。
作為條件復(fù)制性腺病毒載體代表產(chǎn)品的ONYX-015在1996年進(jìn)入臨床試驗(yàn)以來，已經(jīng)取得了非常令人鼓舞的臨床療效，國際著名的醫(yī)學(xué)期刊《The Lancet》在以“基因治療的新希望”為題的述評中，高度評價(jià)ONYX-015的臨床應(yīng)用前景，國際最著名的醫(yī)學(xué)期刊如《Science》《Nature Medicine》發(fā)表了臨床試驗(yàn)結(jié)果及評論性文章。目前，美國輝瑞(pfzer)藥物公司已從ONYX生物技術(shù)公司購買了專利，并已對多種腫瘤進(jìn)行臨床期試驗(yàn)，其中，對復(fù)發(fā)性、難治性頭頸部腫瘤的治療正進(jìn)行臨床III期試驗(yàn)，已取得非常滿意的療效，對其他腫瘤如轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、口腔粘膜白斑病(oral leukoplakia)和惡性膠質(zhì)瘤的臨床I-II期試驗(yàn)正在進(jìn)行中，同時(shí)，ONYX已經(jīng)獲得以O(shè)NYX-015為載體的一些相關(guān)的基因治療重組腺病毒載體(如插入治療基因TK，CD)的專利，正從臨床前期試驗(yàn)向臨床期試驗(yàn)過渡?？梢灶A(yù)見，ONYX-015及其相關(guān)的基因治療產(chǎn)品在不久的將來，在美國將正式進(jìn)入臨床應(yīng)用，在癌癥基因治療的臨床開發(fā)產(chǎn)品中顯示出非常良好的臨床應(yīng)用前景。國內(nèi)已有兩例與ONYX-015類似原理的專利申請，其中專利申請99124030.8(一種缺陷型病毒及其構(gòu)建方法)通過缺失E1B 55 kDa位于2809-3329bp編碼序列，并在缺失部位插入終止碼的方法得到E1B 55 kDa部分缺失的構(gòu)建體。專利申請98113494.7(缺失凋亡抑制基因病毒的構(gòu)建及在腫瘤基因治療中的應(yīng)用)部分缺失E1B 55 kDa編碼序列，并在該缺失部位插入標(biāo)志基因LacZ，得到E1B 55 kDa部分缺失同時(shí)攜帶標(biāo)志基因的病毒構(gòu)建體，該構(gòu)建體的另一特點(diǎn)是有E3區(qū)的缺失。
現(xiàn)有的國內(nèi)外發(fā)明均有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即用不同方法缺失(delete)E1B 55 kDa的編碼序列，該重組腺病毒構(gòu)建體只能在攜帶異常p53基因的腫瘤細(xì)胞中增殖復(fù)制，而對具有正常p53基因表型的腫瘤細(xì)胞治療效應(yīng)較弱，在某些大病種腫瘤，如急性白血病p53基因的突變率很低，成為ONYX-015及其相關(guān)產(chǎn)品臨床應(yīng)用的不足之處。
為實(shí)現(xiàn)以上目的，采用的技術(shù)方案是用定點(diǎn)突變、PCR擴(kuò)增、酶切、連接等技術(shù)，缺失pCX1質(zhì)粒(該載體包含腺病毒-21nt至-5790nt序列)中E1A的編碼區(qū)(382-1630nt)，組成新的載體pCX1-E1A，該載體包含病毒包裝信號(packaging signal)(-194至-358nt)，與除缺失病毒包裝信號外，包含腺病毒全部基因組的載體pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，篩選出不能表達(dá)E1A功能蛋白的重組腺病毒構(gòu)建體。
與現(xiàn)有的重組腺病毒構(gòu)建體相比，采用本發(fā)明達(dá)到了以下效果(1)該重組腺病毒構(gòu)建體缺失了E1A蛋白的全部編碼區(qū)(382-1630nt)，E1A蛋白編碼功能完全喪失，除此之外，包含ADV5的全部基因組序列。(2)對攜帶異常Rb基因表型的腫瘤細(xì)胞系及正常對照細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該重組腺病毒構(gòu)建體對正常細(xì)胞無殺傷效應(yīng)，而對攜帶異常Rb基因表型腫瘤細(xì)胞具有非常顯著的殺滅作用，當(dāng)與順鉑等一線化療藥物聯(lián)用時(shí)，增效作用極其顯著。初步結(jié)果表明，該重組腺病毒構(gòu)建體是一種可用于制備腫瘤臨床治療藥物的工具。(3)對正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該重組腺病毒構(gòu)建體對正常細(xì)胞系活性無明顯影響，而腫瘤細(xì)胞系轉(zhuǎn)染腺病毒后96小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)部分細(xì)胞裂解死亡，因此該重組腺病毒構(gòu)建體有較可靠的診斷腫瘤細(xì)胞的價(jià)值。(4)本發(fā)明所用的技術(shù)方法和流程獲得的重組腺病毒構(gòu)建體，是一種新型的可選擇性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖復(fù)制的基因治療重組腺病毒載體。
四
附圖1為質(zhì)粒pCX1的結(jié)構(gòu)示意圖。該載體全長9905bp，包含腺病毒-21nt至-5790nt序列。
附圖2為用定點(diǎn)突變技術(shù)在質(zhì)粒pCX1的378nt-381nt中引入酶切位點(diǎn)。
附圖3為構(gòu)建缺失382-1630 nt E1A蛋白編碼序列的質(zhì)粒pCX1-E1A。
附圖4為pBHGE3的結(jié)構(gòu)示意圖，該質(zhì)粒包含人類5型腺病毒除包裝信號(194-358nt)外的全部基因組序列，全長37436bp。
附圖5為缺失382-1630 nt E1A蛋白編碼序列的重組腺病毒載體ADV/dE1A的構(gòu)建。
五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例(除特別注明外，本技術(shù)流程中所用的酶和PCR引物均購自美國Gibco公司)。
例1用定點(diǎn)突變技術(shù)在pCX1質(zhì)粒的376-381nt中引入Xba I酶切位點(diǎn)。
pCX1購于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目錄號PD-01-03)，該質(zhì)粒包含人類5型腺病毒21-5790 nt序列，其質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖見附圖1。用定點(diǎn)突變試劑盒QuikChangeTMSite-DirectedMutagenesis Kit(Strategene，U.S.A.)在pCX1質(zhì)粒的376-38 1 nt中引入Xba I酶切位點(diǎn)，即將TGG AGA突變?yōu)門CTAGA，具體操作參照Strategene提供的說明書進(jìn)行(附圖2)。
用于突變的PCR引物為引物1＝5′-GGG ACT TTG ACC GTT TAC GTC TAG ACTCGC CCA GGT GTT TT-3′(-358nt至-398nt)；引物2＝5′-C ACC TGG GCG AGT CTA GAC GTA AAC GGTCAA AGT CCC CGC GGC-3′(-394nt至-352nt)(下標(biāo)橫線為突變位點(diǎn))。
PCR反應(yīng)的條件為95℃ 30秒；95℃ 30秒、55℃ 1分鐘、68℃ 20分鐘共15次循環(huán)；68℃延伸20分鐘。
用Xba I酶切鑒定、篩選陽性克隆，即得到在376-381nt中引入XbaI酶切位的pCX1新質(zhì)粒，將該載體用XbaI酶切，得到的6.6kb的片段，常規(guī)電泳分離純化后用于連接反應(yīng)(附圖3)。
例2構(gòu)建缺失382-1630 nt E1A蛋白編碼序列的質(zhì)粒pCX1-E1A。
PCR反應(yīng)引物為引物3＝5′-CCG CTC TAG ATA ACT TGC ATG GCG TGTTAA-3′(-382nt至-401nt，下標(biāo)橫線為引入的酶切位點(diǎn)XbaI)；引物4＝5′-CCG CTC TAG ATC ATG GTC ATG TCA AACACC-3′(-1630nt至-1610nt，下標(biāo)橫線為引入的酶切位點(diǎn)XbaI)；以pCX1為模板，用引物3及引物4進(jìn)行PCR反應(yīng)。
反應(yīng)體系總體為50μl，包括5×PCR緩沖液10μl；50mMMgCl22μl；10mMdNTP 1μl；10μM引物3 1μl；10μM引物4 1μl；pCX1 10ng；Taq 2.5 u；加水至50μl。
反應(yīng)條件為95℃ 30秒；94℃ 30秒、55℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘共25次循環(huán)；72℃延伸7分鐘。
PCR產(chǎn)物為1.7 Kb片段，用Xba I酶切，常規(guī)電泳分離純化后用于連接反應(yīng)。
用DNA T4連接酶連接6.6kb的pCX1、1.7Kb片段，轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)菌，用DNA測序鑒定篩選陽性克隆，得到包含缺失E1A的全部編碼區(qū)(382-1630nt)的質(zhì)粒pCX1-E1A(附圖3)。
例3缺失E1A的全部編碼序列(382-1630nt)重組腺病毒構(gòu)建體的構(gòu)建。
pBHGE3購于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目錄號PD-01-12)，該質(zhì)粒包含人類5型腺病毒除包裝信號(194-358nt)外的全部基因組序列，其結(jié)構(gòu)見附圖4。293細(xì)胞系是經(jīng)剪切的人類5型腺病毒(Ad5)DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞，獲取的永久傳代細(xì)胞系，購自ATCC(American typical culturecollection，ATCC，U.S.A.，目錄號ATCC CRL-1573，1972年公開)。獲取時(shí)，細(xì)胞的傳代次數(shù)為32代。293細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，低三倍體，其中30％細(xì)胞有64條染色體，4.2％細(xì)胞有更高倍體。將pBHGE3和pCX1-E1A共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，當(dāng)包含人類5型腺病毒包裝信號的pCX1-E1A(20nt-381nt及1631nt-5790nt)置換整合入pBHGE3時(shí)，即產(chǎn)生在293細(xì)胞內(nèi)有增殖能力的重組腺病毒構(gòu)建體，該構(gòu)建體缺失E1A的全部編碼序列(382-1630nt)，命名為AD5/dE1A，其結(jié)構(gòu)見附圖5。腺病毒經(jīng)過復(fù)制，包裝產(chǎn)生腺病毒顆粒。通過挑取噬菌斑(plaques)，獲取多個(gè)單克隆的重組腺病毒構(gòu)建體，經(jīng)過DNA測序，得到重組腺病毒構(gòu)建體陽性克隆，經(jīng)過常規(guī)的腺病毒擴(kuò)增、純化，得到高濃度的重組腺病毒構(gòu)建體AD5/dE1A。
例4重組腺病毒構(gòu)建體選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。
選取以下細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)對象U-2OS(ATCC，HTB96)P53+，RB-人成骨細(xì)胞瘤細(xì)胞系；HS700T(ATCC，HTB147)P53-，RB-，人轉(zhuǎn)移性腺瘤細(xì)胞系；DLD-1(ATCC，CCL221)P53-，RB-，人結(jié)腸癌細(xì)胞系；IMR90(ATCC，CCL186)P53+，RB+，人肺成纖維細(xì)胞系；293(ATCC，CRL1573)P53+，RB+，人胚腎細(xì)胞系，為腺病毒的轉(zhuǎn)代細(xì)胞。
細(xì)胞在10％ FBS DMEM、37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)于6孔板，每孔5×105細(xì)胞。
用于實(shí)驗(yàn)的腺病毒野生型人類腺病毒5；重組腺病毒構(gòu)建體AD5/dE1A；重組E1、E3缺失重組腺病毒作為對照。
用于腺病毒轉(zhuǎn)染的腺病毒感染指數(shù)(MOI)為10，將腺病毒懸浮于1mlPBS中，在10％ FBS DMEM，37℃，CO2條件下轉(zhuǎn)染1小時(shí)，轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞置于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。分別在4、8、12天用0.5％的龍膽紫/20％甲醇溶液染色，死細(xì)胞懸浮被沖出培養(yǎng)皿，活細(xì)胞染色保留在培養(yǎng)皿中。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽性對照腺病毒野生型人腺病毒5無選擇性地裂解腫瘤細(xì)胞；復(fù)制缺陷型腺病毒(重組E1、E3缺失重組腺病毒)只裂解病毒生產(chǎn)293細(xì)胞系。重組腺病毒構(gòu)建體AD5/dE1A選擇性地裂解細(xì)胞系U-2OS、HS700T和DLD-1，對正常對照細(xì)胞系IMR90無明顯影響。因此，重組腺病毒構(gòu)建體AD5/dE1A能選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞，其作用見下表
進(jìn)一步用化療藥物順鉑聯(lián)用以上腺病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組ADV/dE1A腺病毒載體選擇性地顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞系U-2OS、HS700T和DLD-1對順鉑的敏感性，而對正常對照細(xì)胞系IMR90無明顯的增效作用。因此，重組ADV/dE1A腺病毒載體具有選擇性增強(qiáng)順鉑殺滅腫瘤細(xì)胞的作用，其效應(yīng)見下表
權(quán)利要求
1.一種重組腺病毒構(gòu)建體，其特征在于該重組腺病毒構(gòu)建體缺失了ADV5 E1A蛋白的全部編碼區(qū)(382-1630nt)，E1A蛋白編碼功能喪失，除此之外，包含ADV5的全部基因組序列。
2.構(gòu)建權(quán)利要求1的重組腺病毒構(gòu)建體的方法，其特征方法在于用定點(diǎn)突變、PCR擴(kuò)增、酶切、連接等技術(shù)，缺失(包含腺病毒-21nt至-5790nt序列)的pCX1質(zhì)粒中E1A的編碼382nt-1630nt組成新的載體pCX1-E1A，該載體包含病毒包裝信號-194至-358nt，與除缺失病毒包裝信號外，包含腺病毒全部基因組的載體pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，篩選出不能表達(dá)E1A功能蛋白的重組腺病毒構(gòu)建體ADV/dE1A，及擴(kuò)增、純化重組腺病毒構(gòu)建體ADV/dE1A。
3.權(quán)利要求1所述的重組腺病毒構(gòu)建體在制備用于腫瘤治療的藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的重組腺病毒構(gòu)建體在制備腫瘤診斷的試劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的重組腺病毒構(gòu)建體在制備基因治療載體中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在人類5型腺病毒(Humanadenovirus type5)的基因組中定點(diǎn)缺失(delete)E1A編碼序列的構(gòu)建方案，以及獲得的重組腺病毒構(gòu)建體在腫瘤治療、診斷中的具體用途。用定點(diǎn)突變、PCR擴(kuò)增、酶切、連接、亞克隆、轉(zhuǎn)染、重組腺病毒單克隆純化等技術(shù)，缺失E1A(382－1630nt)序列，篩選出不能表達(dá)E1A功能蛋白的重組腺病毒構(gòu)建體。該構(gòu)建體能選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，從而特異性裂解殺滅腫瘤細(xì)胞，并對順鉑等一線化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺滅有顯著的增效效應(yīng)，另一方面該重組腺病毒構(gòu)建體在正常細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制增殖，因而對正常細(xì)胞無毒性效應(yīng)。該重組腺病毒構(gòu)建體在用于腫瘤治療藥物、診斷試劑的制備中具有良好的實(shí)用價(jià)值，同時(shí)也是一種良好的基因治療載體。
文檔編號C12N15/86GK1427075SQ01144628
公開日2003年7月2日 申請日期2001年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者周劍鋒, 馬丁, 盧運(yùn)萍, 王世宣, 徐鋼, 王世安, 李震中 申請人:周劍鋒