蘇云金芽孢桿菌cryl基因、基因組合及表達載體的制作方法

專利名稱：蘇云金芽孢桿菌cryl基因、基因組合及表達載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物防治技術領域。進一步，本發(fā)明涉及一種對鱗翅目害蟲具有活性地蘇云金芽孢桿菌cry1基因、該基因的組合及其相應的表達載體。更進一步，本發(fā)明涉及對鱗翅目害蟲高毒力的Bt cry1Ie基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質的氨基酸序列，涉及協(xié)同組合使用cry1Ie基因與cry1Ab、cry1Ba等基因表達產物，還涉及表達上述基因序列的引物序列和本發(fā)明構建的廣宿主穿梭表達載體pSXY422b。本發(fā)明的
背景技術：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細菌。它在形成芽孢的同時，能產生蛋白性質的伴孢晶體(parasporal crystal)，對鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動物具有特異性的殺蟲活性(Schnepf，E.，N.等，Microbiol.And Molecular BiologyReview，1998，623 775-806)。這種殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又稱δ-內毒素(delta-endotoxin)，對人畜無害，不污染環(huán)境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了最廣泛的應用。
目前人們已經克隆了200多種編碼殺蟲晶體蛋白的Bt殺蟲基因，它們分屬94種模式基因。其中cry1I基因是一類十分特殊的cry1類基因，主要具有以下的特點(1)編碼81kDa的蛋白，對鱗翅目和鞘翅目昆蟲具有殺蟲活性；(2)在Bt菌株中是沉默的，序列分析發(fā)現其上游不存在啟動子序列；(3)距編碼區(qū)上游500bp左右，一般與cry1類基因相鄰，也稱cry1-cry1I連鎖(linkage of cry1-cry1I gene)，這種現象在Bt菌株中十分普遍；(4)在cry1與cry1I基因的間隔區(qū)存在強的轉錄終止序列(Gleave，A.P.等，Appl.Environ.Microbiol.，1993，591683-1687；Shin，B.S.等，Appl.Environ.Microbiol.，1995.61(6)2402-2407；Tailor，R.等，Mol.Microbiol.1992，61211-1217)。
1992年Tailor等從B.thuringiensis菌株4835中克隆了第一個cry1I基因，由于其具有雙重的殺蟲活性，命名為cryV。根據1998年Crickmore的分類系統(tǒng)更正為cry1Ia1(Crickmore等，1998)，該基因在菌株4835中是沉默的，但在轉入大腸桿菌后獲得表達，編碼81.2kDa的毒蛋白，對鱗翅目的歐洲玉米螟(European corn borer，ECB)和鞘翅目的馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decernlineata)具有高活性。之后又發(fā)現多種cry1I類基因(Gleave，A.P.等，Appl.Environ.Microbiol.，1993，591683-1687；Shin，B.S.等，Appl.Environ.Microbiol.，1995，61(6)2402-2407；Choi，S.K.等，Curr.Microbiol.，2000，4165-69；Kostichka，K.等，J.Bacteriol.，1996，1782141-2144)。
Sekar等研究了Cry1Ia1蛋白的毒性區(qū)如果在C-末端去除71個氨基酸，則該蛋白對ECB的活性保持100％，而若去除184個氨基酸，則該蛋白的毒性完全喪失；而用胰蛋白酶處理得到的核心蛋白區(qū)(156-655或659)，只有全長蛋白的20％的活性；N端去除45個氨基酸的毒蛋白，則仍保持100％的毒性(Sekar，V.等，Appl.Environ.Microbiol.，1997，63(7)2798-2801)。
但是，目前世界上防治鱗翅目害蟲所使用的Bt制劑以及轉基因產品具有基因品種單一、害蟲容易產生抗性、殺蟲譜較窄等不足，如何改進它們就成為本領域的技術人員尤為關注的問題。本發(fā)明的內容
本發(fā)明的目的
針對上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種對亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)等鱗翅目重要害蟲具有極高毒力的一種新的cry1I模式基因cry1Ie1序列和一種對亞洲玉米螟明顯的增效作用cry1Ie1和cry1Ab基因的組合，以應用于轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。進一步，為便于研究Bt殺蟲蛋白基因在Bt受體菌中的表達，本發(fā)明構建一種含有cry3Aa7基因強啟動子的Bt-Ecoli穿梭的表達載體；并通過建立一套有效的cry基因的Bt表達系統(tǒng)，為cry基因的Bt表達研究奠定基礎；通過將cry1Ie1基因插入到上述載體，本發(fā)明可獲得高效表達。
本發(fā)明的技術方案
1.在Btc007菌株中進行cry1Ie1基因的克隆。
人們通過利用cry基因的CAPS鑒定體系，鑒定了菌株Btc007的cry基因型(Kuo，W.S.和Chak，K.F.，Appl.Envir.Micro.1996，621369-1377；宋福平等，《中國農業(yè)科學》，1998，31(3)，13-18)。本發(fā)明發(fā)現它含有cry1Db、cry1Gb、cry1Fb、cry2Ab和一種新型cry1I基因。對其PCR產物及酶切進行電泳分析，得到電泳圖譜(圖1)。
通過Southern雜交(參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》(第二版)，金冬雁等譯，1992，科學出版社)，得到Southern雜交結果(圖2)，確定新的crylI基因在菌株Btc007質粒DNA上的位置。結果顯示，cry1I基因位于2.5kb的Hind III和4.8kb的ClaI酶切片段上。
本發(fā)明用大腸桿菌-熒光假單胞菌穿梭載體pUCP19，克隆2.5kb HindIII酶切片段，重組質粒命名為pBTC191。對pBTC191進行酶切分析和PCR鑒定，得到電泳結果(圖3)，結果證明該片段被克隆。通過酶切分析，選擇EeoRI酶切pBTC191，產生三個片段1.0kb、1.1kb、5.0kb(0.5kb+pUCP19)。其中1.0kb、1.1kb兩個片段用pBluescript SK(+)亞克隆命名為pSI-2、pSI-1，0.5kb+pUCP19自連命名為pSI-3。
亞克隆流程圖參見附圖(圖4)。對亞克隆進行酶切，得出鑒定結果(圖5)。將上述片段分別進行測序，發(fā)現缺少編碼區(qū)5’末端的序列。為克隆全長cry1I基因，用載體pBluescript SK(+)克隆Btc007質粒DNA 4.8kb的ClaI酶切片段，命名為pXYI46，pXYI46的質粒圖譜和酶切分析電泳圖譜參見附圖(圖6)。
測定重組質粒pXY146所含cry1I基因的5’端序列，與pBTC191所含cry1I因序列進行拼接，得到完整的cry1I基因核苷酸序列，并推測出該基因編碼蛋白質的氨基酸序列(cry1I基因的核苷酸序列和氨基酸序列及其配對，參見SEQ ID NO 1)。
進一步分析該cry1I因與已知四種cry1I基因的同源性，分別為cry1Ia1 93.1％、cry1Ib194.3％、cry1Ic1 92.6％和cry1Id1 89.2％。進一步分析該基因編碼的蛋白質，編碼區(qū)是308-2476bp，由719個氨基酸組成，氨基酸組成分析參見表1和附圖(圖7)。結果表明，其中的絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和亮氨酸(Leu)含量最高。測得其等電點為pH5.91。
Cry1Ie蛋白的滴定曲線參見附圖(圖8)，其結果表明它是一種弱酸性蛋白質，分子量為81.0KDa。進行同源分析比較，確定Cry蛋白共有5個保守區(qū)(Block)，參見SEQ ID NO 1。其中，保守區(qū)1在186-202、保守區(qū)2在253-298、保守區(qū)3在491-536、保守區(qū)4在557-567、保守區(qū)5在634-643氨基酸之間。在編碼區(qū)前未發(fā)現RBS序列，這也進一步證明cry1Ie1基因在Btc007菌株中是沉默的。
對Cry1Ie蛋白進行氨基酸序列同源性分析，表明它與其它四種Cry1I蛋白的同源性均低于95％，結果見表2。說明cry1Ie1基因是一種新型cry1I基因。本發(fā)明人在GenBank進行登記，登錄號(Accession number)為AF211190。該基因也由Bt毒蛋白基因國際命名委員會命名為cry1Ie1基因。這是目前我國所發(fā)現的cry基因中分類等級最高的、第一個cry模式基因。
本發(fā)明比較了Cry1I模式(holotype)蛋白質氨基酸序列，結果見SEQ ID NO 2。用DNASIS等軟件分析cry1Ie1基因序列，發(fā)現在同一開放閱讀框下，有8個不同的起始密碼子，共用一個終止密碼子，編碼8種蛋白，其起始位點、終止位點及編碼蛋白質分子量參見表3。
2.cry1I基因在大腸桿菌中的表達及活性測定。
根據cry1Ie1基因序列，本發(fā)明設計了擴增全長cry1Ie1基因的一對引物S51Ie和S31Ie，并在5’-端引物加進BamHI切點，3`-端引物加進SalI切點，序列如下
BamHI
S51Ie5`-CGCGGATCCGATGAAACTAAAGAATCCAG-3`
SalI
S31Ie 5`-ACGCGTCGACGGCATGTTACGCTCAATATGG-3`
以pXYI46(含有cry1Ie1全長基因)為模板，本發(fā)明用S51Ie/S31Ie PCR擴增得到cry1Ie1全長基因片段(2.1kb)，導入載體pET-21b中，獲得重組質粒命名為pETB-1IE。對pETB-1IE進行酶切和PCR檢測，結果參見附圖(圖9)。pETB-1IE構建流程圖見附圖(圖10)。測序結果表明pETB-1IE中的cry1Ie基因與cry1Ie1完全相同。
將cry1Ie1基因的表達載體pETB-1IE導入E.coli BL21(DE3)中，獲得高效表達。對cry1Ie1基因表達產物進行SDS-PAGE，得到電泳結果(圖11)。cry1Ie1基因表達產物為多條，分子量分別為83、81、60、57kDa，原因可能是因為不同的ATG起始造成的，參見表3。
誘導、收集菌體，超聲破碎完全后，離心，把上清液和沉淀同時電泳，發(fā)現cry1Ie1基因表達產物在沉淀中，說明表達產物形成了包涵體。上清液與對照BL21(pET-21b)條帶相似。而對于Cry1Ie1的出發(fā)菌株Btc007，沒有發(fā)現表達81kDa的蛋白帶。說明cry1Ie1基因在Btc007中是沉默的。
本發(fā)明通過SDS-PAGE分析，確定cry1Ie1基因表達產物的含量，完成對小菜蛾2齡幼蟲和玉米螟初孵幼蟲的殺蟲活性測定。表4、表5分別為Cry1Ie1蛋白對亞洲玉米螟的生測結果。Cry1Ie1對亞洲玉米螟具有高毒力，LC50為16.21ppm，接近對玉米螟毒力最高的Cry1Ab蛋白。
表6為Cry1Ie1毒蛋白對小菜蛾的殺蟲活性測定結果，表明對小菜蛾均具有毒力，LC50分別為197.88ng/mL(見表7)。Cry1Ie1活性較高。表8為Cry1Ie1對榆蘭葉甲的生測結果，表明Cry1Ie1對鞘翅目害蟲榆蘭葉甲沒有活性。
3.對Bt-E.coli穿梭強啟動子表達載體的構建。
利用重疊引物PCR法，本發(fā)明把pET-21b載體的表達區(qū)啟動子替換成cry3Aa7基因的啟動子。設計了兩對引物用于PCR擴增。以含cry3Aa7基因的質粒pBY33為模板，用SPE1/SPE2引物擴增得到cry3Aa7基因啟動子片段，大小為560bp；以pET-21b載體為模板，用SPE3/SPE4引物擴增得到無啟動子的pET-21載體的表達區(qū)片段，大小為226bp，SPE2、SPE3為一對重疊引物。以上述兩個片段為模板，用SPE1/SPE4擴增得到帶有cry3Aa7基因啟動子、含pET-21載體的表達區(qū)序列的片段，大小為786bp，命名為3Aa-21b。SPE1、SPE4 5`端均引入SmaI切點。各引物序列見SEQ ID NO 3。
對PCR擴增產物進行檢測，得到檢測結果(圖12)。結果顯示，擴增得到了786bp的3Aa-21b片段。將片段3Aa-21用SmaI酶切，導入pHT315載體EcoRI/HindIII雙酶切補平位點，得到重組質粒命名為pSXY422b。pSXY422b載體的構建流程圖見附圖(圖13)。對pSXY422b進行酶切分析及PCR檢測(圖14)。測定pSXY422b的表達區(qū)序列(SEQ ID NO4)，結果標明cry3Aa7基因的啟動子、STAB-SD序列、pET-21b中的T7 Tag、His Tag、轉錄終止子和酶切位點。
4.cry1Ie1基因在Bt菌株中的表達。
本發(fā)明把pETB-1IE中的cry1Ie1全長基因插入pSXY422b中的BamHI/SalI位點，得到重組質粒pSHY-1IE，對pSHY-1IE質粒進行酶切分析及PCR檢測，得到電泳圖譜(圖15)。pSHY-1IE質粒的物理圖譜參見附圖(圖16)。
用pSHY-1IE分別轉化無晶體突變株BE20和Bt自然菌株UV-17，得到工程菌BiotIE01和BiotIE02，得到它們的PCR鑒定結果(圖17)，證明表達載體轉化成功。獲得工程菌BiotIE01和BiotIE02在1/2LB平板上，30℃培養(yǎng)30個小時后，在光學顯微鏡下觀察晶體，并拍攝照片(圖18)。
對于Biot1IE01，觀察不到典型的晶體形狀，為不規(guī)則形狀的包涵體。說明Cry1Ie1蛋白本身不能在無晶體突變株BE20中形成典型的晶體。BiotIE02觀察到的晶體也不是典型的雙錐體形。本發(fā)明比較了BiotIE01、BiotIE02、BE20、UV-17菌株的生長曲線(圖19)，發(fā)現表達載體pSHY-1IE導入無晶體突變株BE20和野生菌株UV-17中，對它們的生長速率無影響。
在LB培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)BE20、BiotIE01，30小時后，分別收集沉淀與上清，進行SDS-PAGE電泳檢測，得到電泳結果(圖20)。發(fā)現cry1Ie1基因在BE20中的表達產物處于上清液部分，分子量大約為83kDa。
30℃培養(yǎng)(LB)UV-17、BiotIE02，分別于6、10、14、18、22、26、30、34小時取樣，離心收集沉淀，進行SDS-PAGE分析，結果表明(圖21)，由于UV-17在80kDa左右也有一條帶表達，所以無法判斷BiotIE02是否表達了cry1Ie1基因。
用工程菌BiotIE01和BiotIE02培養(yǎng)液檢測對小菜蛾的生物活性，結果見表9，說明工程菌株對小菜蛾表現出明顯的活性。進一步驗證了cry1Ie1基因在BE20獲得表達。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明涉及對鱗翅目害蟲高毒力的Bt cry1Ie基因。利用本發(fā)明構建的廣宿主穿梭表達載體pSXY422b，可將cry1Ie基因導入大腸桿菌菌株BL21(DE3)、Bt菌株無晶體突變株BE20和自然菌株Bt17等菌株中，實現cry1Ie基因的高效表達。通過cry1Ie基因與cry1Ab、cry1Ba等基因表達產物組合，以產生對鱗翅目害蟲的毒力高于出發(fā)菌株和單基因表達產物；而且cry1Ie基因與cry1Ab、cry1Ba等基因表達產物組合，擴大了對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目害蟲的殺蟲譜。通過應用于轉化微生物和植物，使它們表現出對相關害蟲的毒性，克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。
此外，蘇云金芽孢桿菌沉默基因cry1Ie DNA和氨基酸序列、鑒定該基因的引物序列和擴增全長基因的引物序列、基因組合增效方式以及穿梭表達載體為發(fā)明所獨有。


圖1為Btc007菌株PCR產物及酶切檢測電泳結果；
圖2為Btc007質粒DNA酶切及Southern雜交結果；
圖3為重組質粒pBTC191的酶切及PCR鑒定結果；
圖4為cry1I基因克隆及亞克隆流程圖5為p1I-1、p1I-2和p1I-3質粒的酶切分析；
圖6為pXYI46的質粒圖譜和酶切分析電泳圖7為Cry1Ie1氨基酸組成；
圖8為Cry1Ie1的滴定曲線；
圖9為重組質粒pETB-1IE的酶切分析及PCR檢測；
圖10為重組質粒pETB-1IE構建流程圖11為cry1Ie1基因表達產物SDS-PAGE分析；
圖12為3Aa-21b片段的擴增；
圖13為pSXY422b的構建流程圖14為pSXY422b的酶切及PCR檢測結果；
圖15為pSHY-1IE的酶切分析及PCR檢測結果；
圖16為pSHY-1IE質粒的物理圖譜；
圖17為工程菌BiotIE01、BiotIE02菌株中cry1Ie1基因的PCR檢測；
圖18為BiotIE01和BiotIE02的晶體觀察(光學顯微鏡)；
圖19為Bt菌株的生長曲線；
圖20為BE20、BiotIE01的SDS-PAGE分析；
圖21為Bt-17和BiotIE02不同時間的SDS-PAGE分析。具體實施方案
以下敘述本發(fā)明的實施例。應該說明的是，本發(fā)明的實施例對于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。
需特別指出的是，在本發(fā)明的實施例中，盡管詳細描述了沉默基因的表達及其與不同基因的組合，但是這不意味著本發(fā)明的基因、基因組合只限于對Bt菌株進行轉化和用于生產對上述害蟲有抗性的Bt工程菌。因此，使用本發(fā)明所描述的新基因cry1Ie，使用本領域的普通技術人員所掌握的任何一種方法突變(含誘變)所獲得的、對任何害蟲有抗性的基因，使用cry1Ie與crylAb基因組合、cry1Ie與cry1Ba基因組合以提高對害蟲的毒力和抗性、擴大殺蟲范圍，使用本發(fā)明構建的廣宿主載體pSXY422b，以本領域的普通技術人員所掌握的任何一種方法導入任何微生物、植物或其組織、細胞中，以及由此所獲得具有任何抗蟲活性的微生物、植物，以及該類植物后代的種子、雜交和轉育后代，均包括在本發(fā)明所要求的權利范圍之內。
實施例1、cry1Ie1基因的鑒定與定位
利用cry基因的CAPS鑒定體系，本發(fā)明鑒定了菌株Btc007的cry基因型。發(fā)現含有cry1Db、cry1Gb、cry1Fb、cry2Ab和一種新型cry1I基因。圖1為PCR產物及酶切分析電泳圖譜。利用Southern雜交，確定了這一新的cry1I基因在菌株Btc007質粒DNA上的位置，圖2為Southern雜交結果。發(fā)現該基因定位于2.5kb的HindIII和4.8kb的ClaI酶切片段上。
實施例2、cry1Ie1基因的克隆與亞克隆
用大腸桿菌-熒光假單胞菌穿梭載體pUCP19，本發(fā)明克隆了2.5kb HindIII酶切片段，重組質粒命名為pBTC191。圖3為pBTC191的酶切分析及PCR鑒定電泳結果，證明克隆了該片段。通過酶切分析選擇EcoRI酶切pBTC191，產生三個片段1.0kb、1.1kb、5.0kb(0.5kb+pUCP19)。其中1.0kb、1.1kb兩個片段用pBluescript SK(+)亞克隆命名為pSI-2、pSI-1，0.5kb+pUCP19自連命名為pSI-3。圖4為亞克隆流程圖。圖5為亞克隆酶切鑒定結果。將上述片段分別進行測序，發(fā)現缺少編碼區(qū)5`末端的序列。為了克隆全長的cry1I基因，用載體pBluescript SK(+)克隆了Btc007質粒DNA 4.8kb的ClaI酶切片段，命名為pXYI46，圖6為pXYI46的質粒圖譜和酶切分析電泳圖譜。
實施例3、cry1Ie1基因的序列分析
本發(fā)明測定重組質粒pXYI46所含cry1I基因5’端序列，并通過與pBTC191所含cry1基因序列拼接，得到完整的cry1I基因核苷酸序列，推測出該基因編碼蛋白質的氨基酸序列，見SEQ ID NO 1。本發(fā)明進一步分析了該cry1I因與已知四種cry1I基因的同源性，分別為cry1Ia1 93.1％、cry1Ib1 94.3％、cry1Icl 92.6％和cry1Id1 89.2％。通過分析該基因編碼的蛋白質，得知該基因的編碼區(qū)是308～2476bp，由719個氨基酸組成，氨基酸組成分析見表1和圖7，結果表明，絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和亮氨酸(Leu)含量最高。該蛋白質的等電點為pH5.91。由Cry1Ie蛋白的滴定曲線(圖8)，可知該蛋白質是弱酸性蛋白質，分子量為81.0KDa。通過同源比較，確定了Cry蛋白共有5個保守區(qū)(SEQ ID NO 1)，其中，保守區(qū)1在186-202、保守區(qū)2在253-298、保守區(qū)3在491-536、保守區(qū)4在557-567、保守區(qū)5在634-643氨基酸之間。在編碼區(qū)前未發(fā)現RBS序列，這也進一步證明cry1Ie1基因在Btc007菌株中是沉默的。
表1 Cry1Ie1氨基酸組成分析
通過氨基酸序列同源性分析，可知該蛋白質與其它四種Cry1I蛋白的同源性均低于95％(表2)。
表2 Cry1I蛋白質序列同源性(Identity)比較結果CryCry1Ie1 Cry1Ia1 Cry1Ib1Cry1Ic1 Cry1Id1Cry1Ie11.0000.934 0.949 0.916 0.877Cry1Ia1--- 1.000 0.927 0.899 0.897Cry1Ib1--- --- 1.000 0.949 0.872Cry1Ic1--- --- ---1.000 0.834Cry1Id1--- --- ------ 1.000
本發(fā)明比較Cry1I模式蛋白質氨基酸序列，結果見SEQ ID NO 2。用DNASIS等軟件分析cry1Ie1基因序列，發(fā)現在同一開放閱讀框下，有8個不同的起始密碼子，共用一個終止密碼子，編碼8種蛋白，其起始位點、終止位點及編碼蛋白質分子量見表3。
表3 cry1Ie1基因同一開放閱讀框下編碼的蛋白質
實施例4、PCR擴增cry1Ie1全長基因
根據cry1Ie1基因的序列，本發(fā)明設計了擴增全長cry1Ie1基因的一對引物，并在5’-端引物加進BamHI切點，3’-端引物加進Sal I切點，序列如下
BamHI
S51Ie5`-CGCGGATCCGATGAAACTAAAGAATCCAG-3`
SalI
S31Ie 5`-ACGCGTCGACGGCATGTTACGCTCAATATGG-3`
以pXYI46(含有cry1Ie1全長基因)為模板，用S51Ie/S31Ie PCR擴增得到cry1Ie1全長基因片段(2.1kb)。
實施例5、cry1Ie1基因在大腸桿菌中的表達
把在實施例4中得到的產物克隆于載體pET-21b中，獲得重組質粒命名為pETB-1IE。圖9為pETB-1IE的酶切及PCR檢測結果，圖10為pETB-1IE構建流程圖。測序結果表明pETB-1IE中的cry1Ie基因與cry1Ie1完全相同。
將cry1Ie1基因的表達載體pETB-1IE導入E.coli BL21(DE3)中，獲得高效表達。圖11為cry1Ie1基因表達產物的SDS-PAGE電泳結果。cry1Ie1基因表達產物為多條，分子量分別為83、81、60、57kDa，原因可能是不同的ATG起始(表3)。誘導、收集菌體超聲破碎完全后，離心，上清液和沉淀同時電泳，發(fā)現cry1Ie1基因表達產物在沉淀中，說明表達產物形成了包涵體。上清液與對照BL21(pET-21b)條帶相似。Cry1Ie1的出發(fā)菌株Btc007，沒有發(fā)現表達81kDa的蛋白帶。說明cry1Ie1基因在Btc007中是沉默的。實施例6、cry1Ie基因殺蟲活性研究
通過SDS-PAGE分析，確定cry1Ie1基因表達產物的含量，完成了對小菜蛾2齡幼蟲和玉米螟初孵幼蟲的殺蟲活性測定。小菜蛾采用甘藍葉片秤重后浸葉法，96小時調查結果；玉米螟采用人工飼料飼喂法，7天調查結果。表4、表5為Cry1Ie1蛋白對亞洲玉米螟的生測結果。Cry1Ie1對亞洲玉米螟具有高毒力，LC50為16.21ppm，接近對玉米螟毒力最高的Cry1Ab蛋白。表6為Cry1Ie1毒蛋白對小菜蛾的殺蟲活性測定結果，表明對小菜蛾具有毒力，LC50分別為197.88ng/mL(見表7)。Cry1Ie1活性較高。
表4 Cry1Ie1對亞洲玉米螟(公主嶺種群)殺蟲活性處理代表 幼蟲個數幼蟲體重死亡率校正死亡率
感染 存活(mg) ％ 平均CK 1 48 46 400.4 4.17 4.86CK 2 48 48 416.1 0CK34843415.910.420.5ppm2 14844294.48.33 3.650.5ppm24845327.66.25 1.460.5ppm34843274.910.4210.425.1755ppm 1483780.5 22.9218.985ppm 2483456.8 29.1725.555ppm 3484262.2 12.5 8.03 17.5250ppm 148131.0 72.9271.5350ppm 248151.6 68.7567.1550ppm 348131.4 72.9271.5370.07100ppm1483 0.3 93.7593.43100ppm2485 0.5 89.5889.05100ppm3486 0.8 87.5 86.8689.78500ppm1480 100 100500ppm2480 100 100500ppm3480 100 100 100a1ppm10-6mg蛋白/mg干人工飼料
表5 Cry蛋白對亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的毒力測定毒素LC50(低-高)ppma LC90(低-高)ppmCry1Ab 0.39(0.28-0.54) -Cry1Ie1 16.21(5.35-39.58) 134.39(2.43-998.70)a1ppm10-6mg蛋白/mg人工飼料干重
表6 Cry1Ie1對小菜蛾(Plutella xylostella)殺蟲活性(48hr)樣品濃度(ng/mL)Repeat 總計死亡死亡率(％)1 5.4×103 345 44 97.82 1.8×103 345 42 93.33 900345 39 86.74 300345 26 57.85 100345 15 33.3CK 無菌水 345 45 0
表7 Cry1I蛋白對小菜蛾殺蟲活性毒素 LC50(90％confidence)ng/mL LC90(90％confidence)ng/mLCry1Ie1197.88(128.94-274.60) 1376.72(939.28-2426.94)
實施例7、Bt-E.coli穿梭強啟動子及表達序列的擴增
利用重疊引物PCR法，本發(fā)明把pET-21b載體的表達區(qū)啟動子替換成cry3Aa7基因的啟動子。設計了兩對引物用于PCR擴增。以含cry3Aa7基因的質粒pBY33為模板，用SPE1/SPE2引物擴增得到cry3Aa7基因啟動子片段，大小為560bp(PCR條件同上)；以pET-21b載體為模板，用SPE3/SPE4引物擴增得到無啟動子的pET-21載體的表達區(qū)片段(PCR條件同上)，大小為226bp，SPE2、SPE3為一對重疊引物，以上述兩個片段為模板，用SPE1/SPE4擴增得到帶有cry3Aa7基因啟動子、含pET-21載體的表達區(qū)序列的片段，大小為786bp，命名為3Aa-21b。SPE1、SPE45`端均引入SmaI切點，各引物序列見SEQ IDNO 3。圖12為PCR擴增產物檢測結果。
實施例8、Bt-E.coli穿梭的構建
把在實施例7中擴增得到的786bp 3Aa-21b片段用SmaI酶切，導入pHT315載體EcoRI/HindIII雙酶切補平位點，得到重組質粒命名為pSXY422b。圖13為pSXY422b載體的構建流程圖，圖14為pSXY422b的酶切分析及PCR檢測。測定了pSXY422b的表達區(qū)序列，SEQ ID NO 4為表達區(qū)的序列，標明了cry3Aa7基因的啟動子，STAB-SD序列、pET-21b中的T7 Tag、His Tag、轉錄終止子和酶切位點。
實施例9、cry1Ie1基因的Bt表達載體構建
把pETB-1IE中的cry1Ie1全長基因插入pSXY422b中的BamHI/SalI位點，得到重組質粒pSHY-1IE，圖15為pSHY-1IE質粒酶切分析及PCR檢測電泳圖譜。圖16為pSHY-1IE質粒的物理圖譜。
實施例10、cry1Ie1基因在Bt菌株中的表達
把pSHY-1IE分別轉化無晶體突變株BE20和Bt自然菌株Bt-17，得到工程菌BiotIE01和BiotIE02，圖17為它們的PCR鑒定結果，證明表達載體轉化成功。獲得工程菌BiotIE01和BiotIE02在1/2LB平板上30℃培養(yǎng)30個小時后，在光學顯微鏡下觀察晶體。圖18為光學顯微鏡下觀察晶體的結果。Biot1IE01觀察不到典型的晶體形狀，為不規(guī)則形狀的包涵體。說明Cry1Ie1蛋白本身不能在無晶體突變株BE20中形成典型的晶體。BiotIE02觀察到的晶體電不是典型的雙錐體形。比較了BiotIE01、BiotIE02、BE20、Bt-17菌株的生長曲線，發(fā)現表達載體pSHY-1IE導入無晶體突變株BE20和野生菌株Bt-17中，對它們的生長速率無影響。圖19為它們的生長曲線。
在LB培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)BE20、BiotIE01，30小時后，分別收集沉淀與上清，SDS-PAGE電泳檢測(圖20)，發(fā)現cry1Ie1基因在BE20中的表達產物在上清液，分子量大約為83kDa。
30℃培養(yǎng)(LB)Bt-17、BiotIE02，分別于6、10、14、18、22、26、30、34小時取樣，離心收集沉淀，SDS-PAGE分析(如圖21)，結果表明，cry1Ie1基因表達了80kDa左右的條帶。
用工程菌BiotIE01和BiotIE02培養(yǎng)液檢測對小菜蛾的生物活性，結果見表8，說明工程菌株對小菜蛾表現出明顯的活性，從而進一步驗證了cry1Ie1基因在BE20獲得表達。
表8 Bt菌株對小菜蛾幼蟲的活性測定樣品 重復總蟲數 死蟲數 死亡率％校正死亡率％BiotIE01/cry1Ie1 3 36 36 100 100BiotIE02/cry1Ie1 3 36 36 100 100BE20/cry- 3 36 7 19.4-附本發(fā)明所涉及的DNA序列和蛋白質序列SEQ ID NO 1(cry1Ie1基因的核苷酸序列和氨基酸序列)1CGATGAAAATATCTCTGCTTTTTCTTTCTTTATTTGGTATATGCTTTACTTGTAATCGAA 6061AATAAAGCACTAATAAGAGTATTTATAGGTGTTTGAAGTCATTTCAGTTCATTTTTAAAG 120121GAGGTTTAAAAGTGTTAGAAAGTTATTAAGGAATAATACTTACAGTAAATCCTACCTATA 180181TTTTACAATTAATTATGATATTTATGCATAAATTAAAAATGCTTTATTTGACATTACAGC 240241TAAGTATAATTTTTTATGAATAAAATTTTATTTGAAAATTAAATAATATTATATGTGAGG 300301GATTAATATGAAACTAAAGAATCCAGATAAGCATCAAAGCTTGTCTAGCAATGCGAAAGT 360 1 M K L K N P D K H Q S L S S N A K V18361AGATAAAATCGCTACGGATTCACTAAAAAATGAAACAGATATAGAATTGAAAAATATTAA 420 19 D K I A T D S L K N E T D I E L K N I N38421TCATGAGGATTTCCTAAGAATGTCTGAGCATGAGAGTATTGATCCGTTTGTTAGTGCATC 480 39 H E D F L R M S E H E S I D P F V S A S58481AACAATTCAAACGGGTATTGGAATTGCTGGTAAGATTCTTGGTACTCTAGGTGTTCCTTT 540 59 T I Q T G I G I A G K I L G T L G V P F78541TGCTGGACAAATAGCTAGCCTCTATAGTTTTATCTTAGGGGAGCTTTGGCCTAAAGGGAA 600 79 A G Q I A S L Y S F I L G E L W P K G K98601AAGTCAATGGGAAATCTTTATGGAACATGTAGAAGAGCTTATTGACCAAAAAATATCAAC 660 99 S Q W E I F M E H V E E L I D Q K I S T118661TTACGCAAGAAACATAGCACTTGCAGATTTAAAAGGCTTAGGAGATGCTTTGGCTGTCTA 720119 Y A R N I A L A D L K G L G D A L A V Y138721CCATGAATCGCTTGAAAGTTGGATTAAAAATCGCAACAACGCAAGGGCTACAAGTGTTGT 780139 H E S L E S W I K N R N N A R A T S V V159781CAAGAGCCAATATATTGCTTTAGAACTATTGTTTGTTCAAAGCTGCCTTCTTTTGCAGT 840159 K S Q Y I A L E L L F V Q K L P S F A V178841ATCAGGTGAGGAAGTACCATTATTGCCAATATATGCACAAGCTGCAAATTTACACTTATT 900179 S G E E V P L L P I Y A Q A A N L H L L198
Block1901ATTACTAAGAGATGCTTCTGTTTTTGGAAAAGAGTGGGGATTATCTAATTCGCAAATTTC 960199 L L R D A S V F G K E W G L S N S Q I S218961TACATTTTATAATCGTCAAGTCGAAAGAACGAGTGACTATTCCGACCATTGTGTGAAATG 1020219 T F Y N R Q V E R T S D Y S D H C V K W2381021GTATAGTACAGGTCTAAATAACTTGAGAGGTACAAATGCCGAAAGCTGGGTCCGTTATAA 1080239 Y S T G L N N L R G T N A E S W V R Y N2581081TCAATTTCGTAAAGATATGACATTAATGGTACTAGATTTAATCGCATTATTCCCAAGCTA 1140259 Q F R K D M T L M V L D L I A L F P S Y278
Block21141TGATACACTTGTATATCCAATTAAAACCACTTCTCAACTTACAAGAGAAGTATATACAGA 1200279 D T L V Y P I K T T S Q L T R E V Y T D2981201CGCAATTGGGACAGTACATCCAAATGCAAGTTTTGCAAGTACGACCTGGTATAATAATAA 1260299 A I G T V H P N A S F A S T T W Y N N N3181261TGCACCTTCGTTCTCTGCCATAGAGTCTGCTGTTGTTCGAAACCCGCATCTACTCGATTT 1320319 A P S F S A I E S A V V R N P H L L D F3381321TTTAGAACAAGTTACAATTTACAGCTTATTAAGTAGGTGGAGTAACACTCAGTATATGAA 1380339 L E Q V T I Y S L L S R W S N T Q Y M N3581381TATGTGGGGAGGACATAGACTGGAATTCCGAACAATAGGTGGAGTGTTAAATACCTCAAC 1440359 M W G G H R L E F R T I G G V L N T S T3781441ACAAGGGTCTACTAATACTTCTATTAATCCTGTAACATTACCGTTCACGTCTCGAGACGT 1500379 Q G S T N T S I N P V T L P F T S R D V3981501CTATAGGACTGAATCATTGGCAGGGCTGAATCTATTTTTAACTCAACCTGTTAATGGAGT 1560399 Y R T E S L A G L N L F L T Q P V N G V4181561ACCTAGGGTTGATTTTCATTGGAAATTCGCCACACTTCCGATTGCATCTGATAATTTTTA 1620419 P R V D F H W K F A T L P I A S D N F Y4381621TTATCTAGGGTATGCTGGAGTTGGTACGCAATTACAAGATTCAGAAAATGAATTACCACC 1680439 Y L G Y A G V G T Q L Q D S E N E L P P4581681TGAAACAACAGGACAGCCAAATTATGAATCATATAGTCATAGATTATCCCATATAGGACT 1740459 E T T G Q P N Y E S Y S H R L S H I G L4781741CATTTCAGCATCCCACGTGAAAGCATTGGTATATTCTTGGACACATCGTAGTGCAGATCG 1800479 I S A S H V K A L V Y S W T H R S A D R4981801TACAAATACAATTGAGCCAAATAGCATTACACAAATACCATTAGTAAAAGCGTTCAATCT 1860499 T N T I E P N S I T Q I P L V K A F N L518
Block31861GTCTTCAGGTGCCGCTGTAGTGAGAGGACCAGGATTTACAGGTGGGGATATCCTTCGAAG 1920519 S S G A A V V R G P G F T G G D I L R R5381921AACGAATACTGGTACATTTGGGGATATACGAGTAAATATTAATCCACCATTTGCACAAAG 1980539 T N T G T F G D I R V N I N P P F A Q R5581981ATATCGCGTGAGGATTCGCTATGCTTCTACTACAGATTTACAATTCCATACGTCAATTAA 2040559 Y R V R I R Y A S T T D L Q F H T S I N578
Block42041CGGTAAAGCTATTAATCAAGGTAATTTTTCAGCAACTATGAATAGAGGAGAGGACTTAGA 2100579 G K A I N Q G N F S A T M N R G E D L D5982101CTATAAAACCTTTAGAACTGTAGGCTTTACCACTCCATTTAGCTTTTCAGATGTACAAAG 2160599 Y K T F R T V G F T T P F S F S D V Q S6182161TACATTCACAATAGGTGCTTGGAACTTCTCTTCAGGTAACGAAGTTTATATAGATCGAAT 2220619 T F T I G A W N F S S G N E V Y I D R I638
Block52221TGAATTTGTTCCGGTAGAAGTAACATATGAGGCAGAATATGATTTTGAAAAAGCGCAAGA 2280639 E F V P V E V T Y E A E Y D F E K A Q E6582281GAAGGTTACTGCACTGTTTACATCTACGAATCCAAGAGGATTAAAAACAGATGTAAAGGA 2340659 K V T A L F T S T N P R G L K T D V K D6782341TTATCATATTGACCAGGTATCAAATTTAGTAGAGTCTCTATCAGATGAATTCTATCTTGA 2400679 Y H I D Q V S N L V E S L S D E F Y L D6982401TGAAAAGAGAGAATTATTCGAGATAGTTAAATACGCGAAGCAAATCCATATTGAGCGTAA 2460699 E K R E L F E I V K Y A K Q I H I E R N7182461CATGTAGAATTAAAATCTACCTAAATCCAGAAAAATAAAAGGGTTAAATATACAATTCTT 2520719 M *2521GTACCAATATTTTGAGTGATTAGATGTAGGATGAAATTTAATTGTATGCTATTTAACAGT 25802581AGAGATATTAAAAATTAATTTATCTATACATTAATAGTATAGACATACAAACATAAGAGA 26402641GCATTGTCTTTTCGTAGGCTACAATGCTCTCTATTTACTATTTATTTTTCTTTTGTATCT 27002701TCAAATTGACGTTGTTCTAAGCGTTCTATTGCAGCTCGTCGTTTAGTATCATCAATGTTT 27602761GTATAAAGAGATGTTGTTTCCATAGAATTATGTCCCATTTGATTTGCTAATAATACTAAA 28202821TCTTTATTTTCATTATAGTGATTAGTAGCATAAGTATGACGTAATTTATGAGGGCTTTTC 28802881 TTTTCATCAAAAGCCCTTGTGTATTTCTCTGTAAGCTT2918SEQ ID NO 2(Cry1I蛋白的氨基酸序列比較)
10 20 30 40 50 60Cry1Ie1MKLKNPDKHQ SLSSNAKVDK IATDSLKNET DIELKNINHE DFLRMSEHES IDPFVSASTICry1Ia1MKLKNQDKHQ SFSSNAKVDK ISTDSLKNET DIELQNINHE DCLKMSEYEN VEPFVSASTICry1Ib1MKLKNPDKHQ SLSSNAKVDK IATDSLKNET DIELKNMNNE DYLRMSEHES IDPFVSASTICry1Ic1MKLKNPDKHQ TLSSNAKVDK IATDSLKNET DIELKNMNNE DYLRMSEHES IDPFVSASTICry1Id1MKSKNQNMYR SFSSNATVDK SFIDPLEHNT NMELQNSNHE DCLKMSEYES VEPFVSVSTI
70 80 90100110120Cry1Ie1QTGIGIAGKI LGTLGVPFAG QIASLYSFIL GELWPKGKSQ WEIFMEHVEE LIDQKISTYACry1Ia1QTGIGIAGKI LGTLGVPFAG QVASLYSFIL GELWPKGKNQ WEIFMEHVEE IINQKISTYACry1Ib1QTGIGIAGKI LGTLGVPFAG QIASLYSFIL GELWPKGKSQ WEIFMEHVEE IINQKILTYACry1Ic1QTGIGIAGKI LGTLGVPFPG QIASLYSFIL GELWPKGKSQ WEIFMEHVEA IINRKISTYACry1Id1QTGIGIAGKI LGNLGVPFAG QVASLYSFIL GELWPKGKSQ WEIFMEHVEE LINQKISTYA
130140150160170180Cry1Ie1RNIALADLKG LGDALAVYHE SLESWIKNRN NARATSVVKS QYIALELLFV QKLPSFAVSGCry1Ia1RNKALTDLKG LGDALAVYHD SLESWVGNRN NTRARSVVKS QYIALELMFV QKLPSFAVSGCry1Ib1RNKALSDLRG LGDALAVYHE SLESWVENRN NTRARSVVKN QYIALELMFV QKLPSFAVSGCry1Ic1RNKALTDLKG LGDALAVYHE SLESWVGNRN NTRARSVVKN QYIALELMFV QKLPSFAVSGCry1Id1RNKALADLKG LGDALAVYHE SLESWIENRN NTRVRSVVKN QYIALELMFV QKLPSFAVSG
190200210220230240Cry1Ie1EEVPLLPIYA QAANLHLLLL RDASVFGKEW GLSNSQISTF YNRQVERTSD YSDHCVKWYSCry1Ia1EEVPLLPIYA QAANLHLLLL RDASIFGKEW GLSSSEISTF YNRQVERAGD YSYHCVKWYSCry1Ib1EEVPLLPIYA QAANLHLLLL RDASIFGKEW GLSASEISTF YNRQVERTRD YSDHCIKWYNCry1Ic1EEVPLLPIYA QAANLHLLLL RDASIFEKNG GLSASEISTF YNRQVERTRD YSYHCVKWNNCry1Id1EEVPLLPIYA QAANLHLLLL RDASIFGKEW GLSESEISTF YNRQSSQTQE YSDYCSEWYN
250260270280290300Cry1Ie1TGLNNLRGTN AESWVRYNQF RKDMTLMVLD LIALFPSYDT LVYPIKTTSQ LTREVYTDAICry1Ia1TGLNNLRGTN AESWVRYNQF RRDMTLMVLD LVALFPSYDT QMYPIKTTAQ LTREVYTDAICry1Ib1TGLNNLRGTN AKSWVRYNQF RKDMTLMVLD LVALFPSYDT LVYPIKTTSQ LTREVYTDAICry1Ic1TGLNNLRATN GQSWVRYNQF RKDIELMVLD LVRVFPSYDT LVYPIKTTSQ LTREVYTDAICry1Id1TGLNRLRGTN AESWVRYNQF RRDMTLMVLD LVALFPSYDT RMYPIPTSAQ LTREVYTDAI
310320330340350360Cry1Ie1 GTVHPNASFA STTWYNNNAP SFSAIESAVV RNPHLLDFLE QVTIYSLLSR WSNTQYMNMWCry1Ia1 GTVHPHPSFT STTWYNNNAP SFSAIEAAVV RNPHLLDFLE QVTIYSLLSR WSNTQYMNMWCry1Ib1 GTVHPNQAFA STTWYNNNAP SFSAIEAAVI RSPHLLDFLE KVTIYSLLSR WSNTQYMNMWCry1Ic1 GTVDPNQALR STTWYNNNAP SFSAIEAAVI RSPHLLDFLE KVTIYSLLSR WSNTQYMNMWCry1Id1 GTVHPNASFA STTWYNNNAP SFSTIEAAVV RNPHLLDFLE QVTIYSLLSR WSNTQYMNMW
370380390400410420Cry1Ie1 GGHRLEFRTI GGVLNTSTQG STNTSINPVT LPFTSRDVYR TESLAGLNLF LTQPVNGVPRCry1Ia1 GGHKLEFRTI GGTLNISTQG STNTSINPVT LPFTSRDVYR TESLAGLNLF LTQPVNGVPRCry1Ib1 GGHRLESRPI GGALNTSTQG STNTSINPVT LQFTSRDVYR TESLAGLNLF LTQPVNGVPRCry1Ic1 GGHRLESRPI GGALNTSTQG STNTSINPVT LQFTSRDFYR TESWAGLNLF LTQPVNGVPRCry1Id1 GGHKLEFRTI GGTLNTSTQG STNTSINPVT LPFTSRDVYR TESLAGLNLF LTQPVNGVPR
430440450460470480Cry1Ie1 VDFHWKFATL PIASDNFYYL GYAGVGTQLQ DSENELPPET TGQPNYESYS HRLSHIGLISCry1Ia1 VDFHWKFVTH PIASDNFYYP GYAGIGTQLQ DSENELPPEA TGQPNYESYS HRLSHIGLISCry1Ib1 VDFHWKFPTL PIASDNFYYL GYAGVGTQLQ DSENELPPET TGQPNYESYS HRLSHIGLISCry1Ic1 VDFHWKFPTL PIASDNFYYL GYAGVGTQLQ DSENELPPET TGQPNYESYS HRLSHIGLISCry1Id1 VDFHWKFVTH PIASDNFYYP GYAGIGTQLQ DSENELPPET TGQPNYESYS HRLSHIGLIS
490500510520530540Cry1Ie1 ASHVKALVYS WTHRSADRTN TIEPNSITQI PLVKAFNLSS GAAVVRGPGF TGGDILRRTNCry1Ia1 ASHVKALVYS WTHRSADRTN TIEPNSITQI PLVKAFNLSS GAAVVRGPGF TGGDILRRTNCry1Ib1 ASHVKALVYS WTHRSADRTN TIEPNSITQI PLVKAFNLSS GAAVVRGPGF TGGDILRRTNCry1Ic1 GSHVKALVYS WTHRSADRTN TIEPNSITQI PLVKAFNLSS GAAVVRGPGF TGGHILRRTKCry1Id1 ASHVKALVYS WTHRSADRTN TINSDSITQI PLVKAFNLPS GASVVRGPGF TGGDILQRTN
550560570580590600Cry1Ie1 TGTFGDIRVN INPPFAQRYR VRIRYASTTD LQFHTSINGK AINQGNFSAT MNRGEDLDYKCry1Ia1 TGTFGDIRVN INPPFAQRYR VRIRYASTTD LQFHTSINGK AINQGNFSAT MNRGEDLDYKCry1Ib1 TGTFGDIRVN INPPFAQRYR VRIRYASTTD LQFHTSINGK AINQGNFSAT MNRGEDLDYKCry1Ic1 SGTFGHIRVN INPPFAQRYR VRMSYASTTD LQFHTSINGK AINQGNFSAT MNRGEDLDYKCry1Id1 TGTFGDIRVN INPPFAQRYR LRIRYASTTN LEFHTSINGK AINQGNFSAT MNRGEDLDYK
610620630640650660Cry1Ie1 TFRTVGFTTP FSFSDVQSTF TIGAWNFSSG NEVYIDRIEF VPVEVTYEAE YDFEKAQEKVCry1Ia1 TFRTVGFTTP FSFLDVQSTF TIGAWNFSSG NEVYIDRIEF VPVEVTYEAE YDFEKAQEKVCry1Ib1 TFRTIGFTTP FSFSDVQSTF TIGAWNFSSG NEVYIDRIEF VPVEVTYEAE YDFEKAQEKVCry1Ic1 TFRTVGFTTP FSFSDVQSTF TIGAWNFSSG NEVYIGRIEF VPVEVTYEAE YDFEKAQEKVCry1Id1 AFRTVGFTTP FSFSNAQSTF TIGAWNFSLG NEVYIDRIEF VPVEVTYEAE YDLKKAQDEI
670680690700710Cry1Ie1 TALFTSTNPR GLKTDVKDYH IDQVSNLVES LSDEFYLDEK RELFEIVKYA KQIHIERNMCry1Ia1 TALFTSTNPR GLKTDVKDYH IDQVSNLVES LSDEFYLDEK RELFEIVKYA KQLHIERNMCry1Ib1 TALFTSTNPR GLKTDVKDYH IDQVSNLVES LSDEFYLDEK RELFEIVKYA KQIHIERNMCry1Ic1 TALFTSTNPR GLKTDVKDYH IDQVSNLVES LSDELYLDEK RELFEIVKYA KQIHIERNMCry1Id1 TAMFTSTNLR RLKTNVTDCH IDQVSNLVES LSDEFYLDEK RELFEIVKYA KQLNIERNMSEQID NO 3
SmaI
SPE15`-TCCCCCGGGAGCTTAATTAAAGATAATATC-3`
SPE25`-TTTTCTTCCTCCCTTTC-3`
Complement sequence
SPE35`-GGAGGAAGAAAAATGGCTAGCATGACTGGTGGAC-3`
SmaI
SPE45`-TCCCCCGGGCAAAAAACCCCTCAAGACCCG-3`SEQ ID NO 4(pSXY422b表達區(qū)序列及分析)1GGGAGCTTAATTAAAGATAATATCTTTGAATTGTAACGCCCCTCAAAAGTAAGAACTACA 60
cry3Aa7 promoter→61AAAAAAGAATACGTTATATAGAAATATGTTTGAACCTTCTTCAGATTACAAATATATTCG 120121GACGGACTCTACCTCAAATGCTTATCTAACTATAGAATGACATACAAGCACAACCTTGAA 180181AATTTGAAAATATAACTACCAATGAACTTGTTCATGTGAATTATCGCTGTATTTAATTTT 240241CTCAATTCAATATATAATATGCCAATACATTGTTACAAGTAGAAATTAAGACACACTTGA 300301TAGCCTTACTATACCTAACATGATGTAGTATTAAATGAATATGTAAATATATTTATGATA 360361AGAAGCGACTTATTTATAATCATTACATATTTTTCTATTGGAATGATTAAGATTCCAATA420
STAB-SD421GAATAGTGTATAAATTATTTATCTTGAAAGGAGGGATGCCTAAAAACGAAGAACATTAAA 480481AACATATATTTGCACCGTCTAATGGATTTATGAAAAATCATTTTATCAGTTTGAAAATTA 540
T7 Tag541TGTATTATGATAAGAAAGGGAGGAAGAAAAATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATG 600
M A S M T G G Q Q M
BamHI EcoRI SacI SalI HindIII NotI XhoI601GGTCGGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCAC 660 G R D P N S S S V D K L A A A L E H H H661CACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCC 720
H H H T7 terminator 721ACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTT 780781TTGCCC78權利要求
1.一種Bt基因cry1Ie1的基因序列，其特征是該序列具有如SEQ ID NO 1所示的DNA序列，且編碼具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的蛋白質；
2.權利要求1的基因序列，其中所說的基因序列包括該基因序列的部分序列；
3.權利要求1的基因序列，其中所說的基因序列包括該基因序列的同源序列；
4.權利要求1的基因序列，其中所說的基因序列編碼對昆蟲具有活性的蛋白質；
5.權利要求1的基因序列，其中所說的基因序列編碼對鱗翅目昆蟲具有活性的蛋白質；
6.一種對昆蟲具有活性的蛋白質的氨基酸序列，其特征是該蛋白質的氨基酸序列是由權利要求1的基因序列所編碼，且具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；
7.權利要求6的氨基酸序列，其中所說的氨基酸序列是如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的部分序列；
8.權利要求6的氨基酸序列，其中所說的氨基酸序列是如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的同源序列；
9.權利要求6的氨基酸序列，其中所說的昆蟲是鱗翅目昆蟲；
10.一種用于擴增權利要求1的基因序列的引物序列，其特征是該引物序列具有如SEQID NO 3所示的核苷酸序列，且具有SmaI酶切位點；
11.一種來自Bt-E.coli的穿梭表達載體，其特征是該穿梭表達載體是由權利要求1的基因序列、一個來自E.coli的表達載體、一個來自Bt-E.coli的穿梭載體和一個來自Btcry3Aa7基因的強啟動子Pcry3Aa7所構建；
12.一種蘇云金芽孢桿菌基因工程菌，其特征是該基因工程菌是通過使用權利要求11的穿梭表達載體轉化細胞而得到，且對昆蟲具有高毒力；
13.權利要求12的基因工程菌，其中所說的細胞是Bt細胞；
14.權利要求12的基因工程菌，其中所說的昆蟲是鱗翅目昆蟲；
15.一種基因cry1Ie1與cry1Ab13的組合，其特征是該組合可應用于轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，并克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生；
16.一種蛋白質Cry1Ie1和Cry1Ab13的組合，其特征是該組合可應用于轉化微生物和植，使之表現出對相關害蟲的毒性，并克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。
全文摘要
本發(fā)明為“蘇云金芽孢桿菌cryl基因、基因組合及表達載體”，屬生物防治技術領域。進一步，本發(fā)明涉及對鱗翅目害蟲高毒力的Bt crylle基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質的氨基酸序列，涉及協(xié)同組合使用crylle基因與crylAb、crylBa等基因表達產物，還涉及表達上述基因序列的引物序列和本發(fā)明構建的廣宿主穿梭表達載體pSXY422b。通過使用上述基因或其組合，可使它們對鱗翅目害蟲的毒力高于出發(fā)菌株和單基因表達產物，擴大它們對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目害蟲的殺蟲譜，并通過應用于轉化微生物和植物，使它們表現出對相關害蟲的毒性，克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。
文檔編號C12N1/21GK1401772SQ0112416
公開日2003年3月12日 申請日期2001年8月20日 優(yōu)先權日2001年8月20日
發(fā)明者宋福平, 張 杰, 黃大昉, 陳中義, 潘映紅 申請人:中國農業(yè)科學院植物保護研究所