本發(fā)明涉及人工催熟領(lǐng)域，具體是一種頭足類的人工促熟方法。
背景技術(shù)：
近年來，海洋頭足類繁育和增養(yǎng)殖在國內(nèi)已開始起步，發(fā)展勢頭良好，但至今海洋頭足類的人工繁育仍依靠其自然繁殖和產(chǎn)卵，而人工催產(chǎn)和促熟方法還未形成，不利于頭足類規(guī)模化繁育和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?，F(xiàn)有技術(shù)如Wells M J， Wells J. Optic gland implants and their effects on the gonads of Octopus.[J]. Journal of Experimental Biology， 1975， 62(3):579-88.表明：二趾頭足類動物的視腺能分泌激素來控制性腺及其管道的狀態(tài)，可通過切除大腦中對視腺的抑制神經(jīng)，迫使動物早熟。只有在視腺存在條件下，卵巢片段才能進(jìn)行卵母細(xì)胞的分裂。并且視神經(jīng)腺的提取物能在體外控制軟黃蛋白的合成。因此，可通過切除和植入視腺來控制動物的生長狀態(tài)。
GnRH，也稱作LHRH，是負(fù)責(zé)卵泡刺激激素(FSH) 和促黃體激素(LH) 分泌的十肽激素。關(guān)于GnRH緩釋劑的制備已有研究，如歐洲專利號1001743 公開了含活性成分和完全包圍住核心的鞘。具有完全包圍核心的鞘降低了性能，具體在于：由于鞘阻斷了釋放，施用后短時間內(nèi)活性成分釋放的水平低。這種植入劑還有第二個缺點：其生產(chǎn)工藝相對復(fù)雜。美國專利號5，851，547 公開了一種控釋藥物制劑，其包含溶脹的內(nèi)層和控制著內(nèi)層溶脹的不能透水的外層。藥物僅通過內(nèi)層的至少一個開口端釋放，且內(nèi)層是不崩解的，其在藥物釋放的時間段里保持著原始形狀。該制劑的問題是藥物的釋放僅受一個參數(shù)控制：可通過開口端釋放的藥量。這是內(nèi)層是不崩解的后果，并且它限制了釋放期。中國專利號CN102413835B，公開了一種包含GnRH 類似物的緩釋制劑，包含生物可降解聚合物或共聚物的活性物質(zhì)的控釋和緩釋的藥物組合物。此外，還涉及用于至少一種活性物質(zhì)例如肽類或激素類及其類似物的控釋或緩釋的藥物組合物和這類藥物組合物的制備方法
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種能快速催熟，安全無害的頭足類的人工促熟方法。
本發(fā)明針對背景技術(shù)提到的問題，采取的技術(shù)方案為：
一種頭足類的人工促熟方法，具體步驟為：將頭足類浸泡在含2.5~3.8%聚氨酯的海水中進(jìn)行麻醉，防止植入GnRH緩釋包埋塊時噴墨，浸泡時間為60~100s。在頭足類眼窩竇處鉆孔，用鑷子將GnRH緩釋包埋塊推入，并使其自由浮動在竇中。其中，GnRH緩釋包埋塊的制備步驟為：
1. PLGA粉末的制備：將LA和LG按摩爾比70 ：30 ~90 ：10加入反應(yīng)釜中，抽真空，70~80℃減壓蒸餾0.8~1.2h，除去原料中10~20%的水，加入催化劑氯化亞錫，對甲基苯磺酸和花生四烯酸，加入量各為原料質(zhì)量的0.2~0.5%，0.4~0.8%，0.001~0.003%，加熱，溫度控制在120~130℃，低真空下反應(yīng)1.8~2.2h，繼續(xù)升溫，溫度為165~175℃熔融縮聚，系統(tǒng)壓力小于50~100Pa，反應(yīng)6~8h后出料，研磨成粉。加入催化劑能加快縮聚速度，反應(yīng)時間大大縮短，還能減少副反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率提高；
2. 聚合物核心制備：將GnRH粉末和步驟1制備的10~30%PLGA粉末過篩，，以避免團(tuán)塊存在于混合物中，混合20~30min，加入原料質(zhì)量0.1~0.4%的碳酸二甲酯，加熱攪拌擠壓，溫度為135~140℃，攪拌速率為8~12rpm，降溫制成直徑為0.6~1.2mm的小丸。小丸中GnRH結(jié)構(gòu)沒有被破壞，活性高，并且小丸中其他成分對GnRH有保護(hù)作用，緩釋時與GnRH一起流出，有助于GnRH融入到血液；
3. 聚合物套制備：往步驟1中制備的剩余PLGA粉末中加入三乙醇胺和尼泊金乙酯，加入量各為原料的0.1~0.3%和0.2~0.5%，加熱攪拌擠壓，溫度為140~150℃，攪拌速率為2~6rpm，切割擠成空心開口方形；上述成分結(jié)合可形成快速催熟的穩(wěn)定產(chǎn)物，具有緩釋時間長、對生物刺激小的特點。
4. GnRH緩釋包埋塊制備：將步驟2制備的核心置于步驟3制備的空心開口方形套中，在25kGy 以上進(jìn)行γ- 照射，得到GnRH緩釋包埋塊。上述制備的GnRH緩釋包埋塊的釋放時間長，釋放速度均勻，能完全釋放。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：在眼睛下放的眼窩竇中植入GnRH緩釋包埋塊，達(dá)到頭足類促熟和催產(chǎn)的目的，這種人工催熟的方法能將頭足類快速催熟，安全無害；制備的GnRH緩釋包埋塊釋放時間長，釋放速度均勻，可生物降解，能完全釋放，不會造成環(huán)境污染或能源浪費；操作步驟簡單，效果明顯，海洋頭足類的人工繁育不必再依靠其自然繁殖和產(chǎn)卵。
具體實施案例
下面通過實施例對本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步說明：
實施例1：
一種頭足類的人工促熟方法，具體步驟為：將頭足類浸泡在含2.5~3.8%聚氨酯的海水中進(jìn)行麻醉，防止植入GnRH緩釋包埋塊時噴墨，浸泡時間為60~100s。在頭足類眼窩竇處鉆孔，用鑷子將GnRH緩釋包埋塊推入，并使其自由浮動在竇中。其中，GnRH緩釋包埋塊的制備步驟為：
1. PLGA粉末的制備：將LA和LG按摩爾比70 ：30 ~90 ：10加入反應(yīng)釜中，抽真空，70~80℃減壓蒸餾0.8~1.2h，除去原料中10~20%的水，加入催化劑氯化亞錫，對甲基苯磺酸和花生四烯酸，加入量各為原料質(zhì)量的0.2~0.5%，0.4~0.8%，0.001~0.003%，加熱，溫度控制在120~130℃，低真空下反應(yīng)1.8~2.2h，繼續(xù)升溫，溫度為165~175℃熔融縮聚，系統(tǒng)壓力小于50~100Pa，反應(yīng)6~8h后出料，研磨成粉。加入催化劑能加快縮聚速度，反應(yīng)時間大大縮短，還能減少副反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率提高；
2. 聚合物核心制備：將GnRH粉末和步驟1制備的10~30%PLGA粉末過篩，，以避免團(tuán)塊存在于混合物中，混合20~30min，加入原料質(zhì)量0.1~0.4%的碳酸二甲酯，加熱攪拌擠壓，溫度為135~140℃，攪拌速率為8~12rpm，降溫制成直徑為0.6~1.2mm的小丸。小丸中GnRH結(jié)構(gòu)沒有被破壞，活性高，并且小丸中其他成分對GnRH有保護(hù)作用，緩釋時與GnRH一起流出，有助于GnRH融入到血液；
3. 聚合物套制備：往步驟1中制備的剩余PLGA粉末中加入三乙醇胺和尼泊金乙酯，加入量各為原料的0.1~0.3%和0.2~0.5%，加熱攪拌擠壓，溫度為140~150℃，攪拌速率為2~6rpm，切割擠成空心開口方形；
4.GnRH緩釋包埋塊制備：將步驟2制備的核心置于步驟3制備的空心開口方形套中，在25kGy 以上進(jìn)行γ- 照射，得到GnRH緩釋包埋塊。上述制備的GnRH緩釋包埋塊的釋放時間長，釋放速度均勻，可生物降解，能完全釋放。
實施例2：
一種頭足類的人工促熟方法，以海螵蛸為例進(jìn)行試驗，將海螵蛸麻醉，在眼睛下方的眼窩竇中植入視腺或GnRH緩釋包埋塊，達(dá)到海螵蛸促熟和催產(chǎn)的目的。由于海螵蛸是石灰質(zhì)的內(nèi)骨骼，植入后應(yīng)該是無損傷的；同時由于其疏松多孔，也容易讓激素釋放到體內(nèi)發(fā)揮作用。
具體步驟為：將海螵蛸浸泡在含3%聚氨酯的海水中進(jìn)行麻醉，防止植入GnRH緩釋包埋塊時噴墨，浸泡時間為70s。在海螵蛸眼窩竇處鉆孔，用鑷子將GnRH緩釋包埋塊推入，并使其自由浮動在竇中。其中，GnRH緩釋包埋塊的制備步驟為：
1. PLGA粉末的制備：將LA和LG按摩爾比7:1加入反應(yīng)釜中，抽真空，75℃減壓蒸餾1h，除去原料中18%的水，加入催化劑氯化亞錫，對甲基苯磺酸和花生四烯酸，加入量各為原料質(zhì)量的0.3%，0.6%，0.001%，加熱，溫度控制在125℃，低真空下反應(yīng)2h，繼續(xù)升溫，溫度為170℃熔融縮聚，系統(tǒng)壓力小于70Pa，反應(yīng)7h后出料，研磨成粉。加入催化劑能加快縮聚速度，反應(yīng)時間大大縮短，還能減少副反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率提高；
2. 聚合物核心制備：將GnRH粉末和步驟1制備的20%PLGA粉末過篩，，以避免團(tuán)塊存在于混合物中，混合20min，加入原料質(zhì)量0.2%的碳酸二甲酯，加熱攪拌擠壓，溫度為138℃，攪拌速率為10rpm，降溫制成直徑為0.8mm的小丸。小丸中GnRH結(jié)構(gòu)沒有被破壞，活性高，并且小丸中其他成分對GnRH有保護(hù)作用，緩釋時與GnRH一起流出，有助于GnRH融入到血液；
3. 聚合物套制備：往步驟1中制備的剩余PLGA粉末中加入三乙醇胺和尼泊金乙酯，加入量各為原料的0.2%和0.3%，加熱攪拌擠壓，溫度為145℃，攪拌速率為4rpm，切割擠成空心開口方形；
4. GnRH緩釋包埋塊制備：將步驟2制備的核心置于步驟3制備的空心開口方形套中，在30kGy進(jìn)行γ- 照射，得到GnRH緩釋包埋塊。上述制備的GnRH緩釋包埋塊的釋放時間長，釋放速度均勻，可生物降解，能完全釋放。
以上所述的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。