專利名稱：一種合成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食用菌的制備方法，尤其涉及一種合成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的方法。
背景技術(shù)：
點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌(5^ 77"5.gra/wJaiiAs (L.: Fr.) 0.Kuntce),別名栗殼牛肝菌。夏秋季松林及混交林地上散生、群生或叢生。分布在河北、黑龍江、吉林、遼寧、山東、福建等地?？墒秤茫遁^好，東北地區(qū)曾大量加工出口。據(jù)報(bào)道該菌有抗癌作用，對(duì)小白鼠肉瘤的抑制率為80%，對(duì)艾氏癌的抑制率為70%。其與多種樹木形成外生菌根，因?yàn)槭峭馍覂?nèi)栽培存在一定困難，目前野生資源的減少與消費(fèi)者的需求逐年增高，資源破壞嚴(yán)重，為了解決此問(wèn)題，一方面保護(hù)野生資源，合理開(kāi)發(fā)利用；另一方面研究人工栽培新技術(shù)，這是解決供不應(yīng)求最根本的辦法，但是解決人工栽培技術(shù)首先必須解決菌根的人工合成技術(shù)。目前還沒(méi)有報(bào)道關(guān)于點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌與板栗苗外生菌根人工合成的技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種合成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的方法，以人工合成的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根，方便菌根食用菌的人工栽培。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種合成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的方法，其包括以下步驟:
A、采用組織分離法，在無(wú)菌條件下取點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌的菌柄與菌蓋之間的組織接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，得到點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲，將所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與PDA試管斜面培養(yǎng)基分離，得到純凈的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲，將純凈的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與無(wú)菌水混合后用攪拌機(jī)攪碎得到點(diǎn)柄粘蓋牛肝`菌菌劑；
B、將待栽培板栗無(wú)菌苗的根系沾滿所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑后移栽在培養(yǎng)缽中，培養(yǎng)缽中填充有真菌與無(wú)菌土的混合物，7天-10天后向培養(yǎng)缽中澆灌所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑進(jìn)行補(bǔ)接，然后以水澆灌，栽培三個(gè)月至一年，從板栗苗木的根系上得到所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根。所述的方法，其中，所述步驟A具體的包括:將所述組織接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，待所述組織上長(zhǎng)出少量點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲后，將其轉(zhuǎn)接到新的PDA試管斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)在所述新的PDA試管培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與所述新的PDA試管培養(yǎng)基進(jìn)行分離。所述的方法，其中，所述步驟A中PDA試管斜面培養(yǎng)基由馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉與水組成，其重量份分別為:
馬鈴薯為100份-200份，葡萄糖10份-20份，瓊脂粉15份-20份，水500份-1000份。所述的方法，其中，所述步驟A中對(duì)在所述新的PDA試管培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與所述新的PDA試管培養(yǎng)基進(jìn)行分離的過(guò)程為:用無(wú)菌水對(duì)新的PDA試管培養(yǎng)基與點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲洗滌三次，然后按照一升無(wú)菌水中菌絲鮮重為40g的比例，用攪拌機(jī)攪碎30秒制成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑待用。所述的方法，其中，所述步驟B具體的包括:
B1、將板栗種子用1%的高錳酸鉀浸泡4-5小時(shí)表面消毒，之后無(wú)菌水洗滌至水無(wú)色，盛放在鋪滿脫脂棉的培養(yǎng)盤中，然后將所述培養(yǎng)盤放置于25°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天，每間隔10小時(shí)-14小時(shí)用無(wú)菌水對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行保濕。所述的方法，其中，所述步驟B具體的包括:待所述步驟BI中70%以上的板栗種子裂口后，將所有板栗種子播種于裝填有無(wú)菌培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)缽中，將培養(yǎng)缽放置于培養(yǎng)室內(nèi)，所述培養(yǎng)室濕度為60%-75%，溫度為20°C _25°C，并且每間隔5天-8天對(duì)培養(yǎng)缽澆水一次，培養(yǎng)一年得到所述待栽培板栗無(wú)菌苗。所述的方法，其中，所述步驟B具體的還包括:所述無(wú)菌培養(yǎng)基質(zhì)由珍珠巖、蛭石與草炭土組成，珍珠巖、蛭石與草炭土按照體積比為1:4:5的比例混合。本發(fā)明提供的一種 合成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的方法，通過(guò)板栗根系制備點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根，獲得穩(wěn)定的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根，為人工栽培點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，方便了人工栽培。
圖1為本發(fā)明中合成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根方法的流程示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種合成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種合成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的方法，如圖1所示的，其包括以下步驟:
步驟101:采用組織分離法，在無(wú)菌條件下取點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌的菌柄與菌蓋之間的組織接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，得到點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲，將所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與PDA試管斜面培養(yǎng)基分離，得到純凈的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲，將純凈的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與無(wú)菌水混合后用攪拌機(jī)攪碎得到點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑；
步驟102:將待栽培板栗無(wú)菌苗的根系沾滿所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑后移栽在培養(yǎng)缽中，培養(yǎng)缽中填充有真菌與無(wú)菌土的混合物，7天-10天后向培養(yǎng)缽中澆灌所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑進(jìn)行補(bǔ)接，然后以水澆灌，栽培三個(gè)月至一年，從板栗苗木的根系上得到所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根。采用板栗根系制備點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根，獲得穩(wěn)定的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根，使人工栽培點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌成為可能，徹底解決了點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌不能人工栽培的技術(shù)問(wèn)題。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述步驟101具體的包括:將所述組織接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，待所述組織上長(zhǎng)出少量點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲后，將其轉(zhuǎn)接到新的PDA試管斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)在所述新的PDA試管培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與所述新的PDA試管培養(yǎng)基進(jìn)行分離。更進(jìn)一步的，上述的PDA試管斜面培養(yǎng)基由馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉與水組成，其重量份分別為:
馬鈴薯為100份-200份，葡萄糖10份-20份，瓊脂粉15份-20份，水500份-1000份。在本發(fā)明的另一較佳實(shí)施例中，所述步驟102中對(duì)在所述新的PDA試管培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與所述新的PDA試管培養(yǎng)基進(jìn)行分離的過(guò)程為:用無(wú)菌水對(duì)新的PDA試管培養(yǎng)基與點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲洗滌三次，然后按照一升無(wú)菌水中菌絲鮮重為40g的比例，用攪拌機(jī)攪碎30秒制成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑待用。更進(jìn)一步的，所述步驟102具體的包括:將板栗種子用1%的高錳酸鉀浸泡4-5小時(shí)表面消毒，之后無(wú)菌水洗滌至水無(wú)色，盛放在鋪滿脫脂棉的培養(yǎng)盤中，然后將所述培養(yǎng)盤放置于25°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天，每間隔10小時(shí)-14小時(shí)用無(wú)菌水對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行保濕。然后等待70%以上的板栗種子裂口后，將所有板栗種子播種于裝填有無(wú)菌培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)缽中，將培養(yǎng)缽放置于培養(yǎng)室內(nèi)，所述培養(yǎng)室濕度為60%-75%，溫度為20°C _25°C，并且每間隔5天-8天對(duì)培養(yǎng)缽澆水一次，培養(yǎng)一年得到所述待栽培板栗無(wú)菌苗。并且所述無(wú)菌培養(yǎng)基質(zhì)由珍珠巖、蛭石與草炭土組成，珍珠巖、蛭石與草炭土按照體積比為1:4:5的比例混合。為了更進(jìn)一步的描述本發(fā)明的方法，其更為詳盡的描述為。點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌子實(shí)體鑒別:點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌子實(shí)體中等大，菌蓋直徑為
5.2cm-10cm，扁半球形或近扁平，淡黃色或黃褐色，很粘，干后有光澤。菌肉淡黃色。菌管直生或稍延生，菌管角形，菌柄長(zhǎng)3cm-10cm,粗0.8cm_l.6cm,淡黃褐色,頂端偶有約Icm長(zhǎng)的網(wǎng)紋，腺點(diǎn)通常不超過(guò)柄長(zhǎng)的一半或全柄有腺點(diǎn)，孢子長(zhǎng)橢圓形，無(wú)色到淡黃色，
6.5 μ m -9.1 (10) μ mX 2.6 μ m _3.9 μ m。管緣囊體成束，淡黃色到黃褐色，多棒狀，31.2 μ m-52 μ mX 5.2 μ m _7.8 μ m。
點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌種分離、純化:采用組織分離法，在無(wú)菌條件下，挑取菌柄與菌蓋之間的組織接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，待所述組織上長(zhǎng)出菌絲，將其轉(zhuǎn)接到新的PDA試管斜面培養(yǎng)基上。其中PDA培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15-20g，水IOOOmLo菌株鑒定:采用分子生物學(xué)的方法，將分離得到菌絲體進(jìn)行rDNA ITS序列測(cè)定，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，證明分離得到的菌絲體為點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌。固體培養(yǎng):將新的PDA試管斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌絲移植到PDA固體培養(yǎng)基上，在溫度為28°C，濕度為70%-75%的條件下，進(jìn)行避光培養(yǎng)。菌劑制備:將菌絲與PDA固體培養(yǎng)基分離，先用無(wú)菌水洗滌三次，最后加入無(wú)菌水，按照IL無(wú)菌水中菌絲鮮重為40g的比例，用攪拌機(jī)攪碎30秒制成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑待用。板栗種子處理:用清水對(duì)板栗種子進(jìn)行清理洗滌，去除雜質(zhì)，用1%的高錳酸鉀浸泡4小時(shí)-5小時(shí)對(duì)其進(jìn)行表面消毒，之后使用無(wú)菌水洗滌消毒后的板栗種子至無(wú)菌水無(wú)色，然后將洗滌后的板栗種子盛放在鋪滿脫脂棉的培養(yǎng)缽中，放置于25°C條件下的培養(yǎng)箱2天，約每間12小時(shí)用無(wú)菌水對(duì)板栗種子進(jìn)行保濕。無(wú)菌苗培養(yǎng)基質(zhì)配比與處理:將珍珠巖、蛭石、草炭土按照體積比為1:4:5的比例混合，然后在121 °C條件下滅菌2小時(shí)。選用聚乙烯材質(zhì)，體積為60 X 40 X 60cm的培養(yǎng)缽進(jìn)行培養(yǎng)，使用之前用75%的乙醇對(duì)培養(yǎng)缽的表面擦拭消毒。無(wú)菌苗培養(yǎng):板栗種子處理后，待70%以上的板栗種子裂口，將板栗種子播種于裝填有無(wú)菌培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)缽中，然后將培養(yǎng)缽放置在培養(yǎng)室內(nèi)。使培養(yǎng)室內(nèi)的濕度保持在60%-75%，溫度保持在20°C -25°C，每間隔7天澆水一次，根據(jù)時(shí)節(jié)，調(diào)整供水量，以保證苗木正常生長(zhǎng)，培養(yǎng)一年。接種:采用點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑蘸根與補(bǔ)接相結(jié)合的方法。將栽培滿一年后的待栽培板栗無(wú)菌苗的根系外圍側(cè)根簡(jiǎn)略處理，沾點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑后移植到填滿真菌與無(wú)菌土混合的培養(yǎng)缽中，澆透水。約七天左右，補(bǔ)接菌劑，用點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑澆灌苗木，而后，以十天為一周期，以水澆灌苗木，栽培三月后，觀察板栗無(wú)菌苗的根系，得到所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根。菌根形態(tài)觀察:將天然點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌置于有水的培養(yǎng)皿中，用MOTIC SMZ-140解剖鏡觀察外延菌絲并測(cè)量并記錄。取所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根根尖20個(gè)，固定于FAA固定液中，制成菌根石蠟切片，用番紅和固綠兩種燃料復(fù)染。用MOTIC SMZ-140解剖鏡和顯微鏡觀察天然點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌與點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，并測(cè)量拍照，其結(jié)果
表明完全一致。驗(yàn)證菌根來(lái)源:采用分子手段，提取點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的DNA，驗(yàn)證板栗苗所形成的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根是接種的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌形成的，其結(jié)果表明點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根與天然點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌完全一致。為了更進(jìn)一步描述本發(fā)明的方法，以下列舉幾個(gè)實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例1
點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌子實(shí)體鑒別:點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌子實(shí)體中等大，菌蓋直徑為
5.2cm-10cm，扁半球形或近扁平，淡黃色或黃褐色，很粘，干后有光澤。菌肉淡黃色。菌管直生或稍延生，菌管角形，菌柄長(zhǎng)3cm-10cm,粗0.8cm_l.6cm,淡黃褐色,頂端偶有約Icm長(zhǎng)的網(wǎng)紋，腺點(diǎn)通常不超過(guò)柄長(zhǎng)的一半`或全柄有腺點(diǎn)，孢子長(zhǎng)橢圓形，無(wú)色到淡黃色，
6.5 μ m -9.1 (10) μ mX 2.6 μ m _3.9 μ m。管緣囊體成束，淡黃色到黃褐色，多棒狀，31.2 μ m-52 μ mX 5.2 μ m _7.8 μ m。點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌種分離、純化:采用組織分離法，在無(wú)菌條件下，挑取菌柄與菌蓋之間的組織接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，待所述組織上長(zhǎng)出菌絲，將其轉(zhuǎn)接到新的PDA試管斜面培養(yǎng)基上。其中PDA培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15-20g，水IOOOmLo菌株鑒定:采用分子生物學(xué)的方法，將分離得到菌絲體進(jìn)行rDNA ITS序列測(cè)定，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，證明分離得到的菌絲體為點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌。固體培養(yǎng):將新的PDA試管斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌絲移植到PDA固體培養(yǎng)基上，在溫度為28°C，濕度為70%-75%的條件下，進(jìn)行搖床避光培養(yǎng)，其中搖床轉(zhuǎn)數(shù)160轉(zhuǎn)/分。菌劑制備:將培養(yǎng)15天-20天的菌絲與PDA固體培養(yǎng)基分離，先用無(wú)菌水洗滌三次，最后加入無(wú)菌水，按照IL無(wú)菌水中菌絲鮮重為40g的比例，用攪拌機(jī)攪碎30秒制成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑待用。板栗種子處理:用清水對(duì)板栗種子進(jìn)行清理洗滌，去除雜質(zhì)，用1%的高錳酸鉀浸泡4小時(shí)-5小時(shí)對(duì)其進(jìn)行表面消毒，之后使用無(wú)菌水洗滌消毒后的板栗種子至無(wú)菌水無(wú)色，然后將洗滌后的板栗種子盛放在鋪滿脫脂棉的培養(yǎng)缽中，放置于25°C條件下的培養(yǎng)箱2天，約每間12小時(shí)用無(wú)菌水對(duì)板栗種子進(jìn)行保濕。
無(wú)菌苗培養(yǎng)基質(zhì)配比與處理:將珍珠巖、蛭石、草炭土按照體積比為1:4:5的比例混合，然后在121 °C條件下滅菌2小時(shí)。選用聚乙烯材質(zhì)，體積為60 X 40 X 60cm的培養(yǎng)缽進(jìn)行培養(yǎng)，使用之前用75%的乙醇對(duì)培養(yǎng)缽的表面擦拭消毒。無(wú)菌苗培養(yǎng):板栗種子處理后，待70%以上的板栗種子裂口，將板栗種子播種于裝填有無(wú)菌培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)缽中，然后將培養(yǎng)缽放置在培養(yǎng)室內(nèi)。使培養(yǎng)室內(nèi)的濕度保持在60%-75%，溫度保持在20°C -25°C，每間隔7天澆水一次，根據(jù)時(shí)節(jié)，調(diào)整供水量，以保證苗木正常生長(zhǎng)，培養(yǎng)一年。接種:采用點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑蘸根與補(bǔ)接相結(jié)合的方法。將栽培滿一年后的待栽培板栗無(wú)菌苗的根系外圍側(cè)根簡(jiǎn)略處理，沾點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑后移植到填滿真菌與無(wú)菌土混合的培養(yǎng)缽中，澆透水。約七天左右，補(bǔ)接菌劑，用點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑澆灌苗木，而后，以十天為一周期，以水澆灌苗木，栽培三月后，觀察板栗無(wú)菌苗的根系，得到所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根。菌根形態(tài)觀察: 將天然點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌置于有水的培養(yǎng)皿中，用MOTIC SMZ-140解剖鏡觀察外延菌絲并測(cè)量并記錄。取所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根根尖20個(gè)，固定于FAA固定液中，制成菌根石蠟切片，用番紅和固綠兩種燃料復(fù)染。用MOTIC SMZ-140解剖鏡和顯微鏡觀察天然點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌與點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，并測(cè)量拍照，其結(jié)果
表明完全一致。驗(yàn)證菌根來(lái)源:采用分子手段，提取點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的DNA，驗(yàn)證板栗苗所形成的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根是接種的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌形成的，其結(jié)果表明點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根與天然點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌完全一致。實(shí)施例2
點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌子實(shí)體鑒別:點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌子實(shí)體中等大，菌蓋直徑為
5.2cm-10cm，扁半球形或近扁平，淡黃色或黃褐色，很粘，干后有光澤。菌肉淡黃色。菌管直生或稍延生，菌管角形，菌柄長(zhǎng)3cm-10cm,粗0.8cm_l.6cm,淡黃褐色，頂端偶有約Icm長(zhǎng)的網(wǎng)紋，腺點(diǎn)通常不超過(guò)柄長(zhǎng)的一半或全柄有腺點(diǎn)，孢子長(zhǎng)橢圓形，無(wú)色到淡黃色，
6.5 μ m -9.1 (10) μ mX 2.6 μ m _3.9 μ m。管緣囊體成束，淡黃色到黃褐色，多棒狀，31.2 μ m-52 μ mX 5.2 μ m _7.8 μ m。點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌種分離、純化:采用組織分離法，在無(wú)菌條件下，挑取菌柄與菌蓋之間的組織接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，待所述組織上長(zhǎng)出菌絲，將其轉(zhuǎn)接到新的PDA試管斜面培養(yǎng)基上。其中PDA培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，水1000mL。菌株鑒定:采用分子生物學(xué)的方法，將分離得到菌絲體進(jìn)行rDNA ITS序列測(cè)定，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，證明分離得到的菌絲體為點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌。固體培養(yǎng):將新的PDA試管斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌絲移植到PDA固體培養(yǎng)基上，在溫度為28°C，濕度為70%-75%的條件下，進(jìn)行避光培養(yǎng)。菌劑制備:將菌絲與PDA固體培養(yǎng)基分離，先用無(wú)菌水洗滌三次，最后加入無(wú)菌水，按照IL無(wú)菌水中菌絲鮮重為40g的比例，用攪拌機(jī)攪碎30秒制成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑待用。板栗種子處理:用清水對(duì)板栗種子進(jìn)行清理洗滌，去除雜質(zhì)，用1%的高錳酸鉀浸泡4小時(shí)-5小時(shí)對(duì)其進(jìn)行表面消毒，之后使用無(wú)菌水洗滌消毒后的板栗種子至無(wú)菌水無(wú)色，然后將洗滌后的板栗種子盛放在鋪滿脫脂棉的培養(yǎng)缽中，放置于25°C條件下的培養(yǎng)箱2天，約每間12小時(shí)用無(wú)菌水對(duì)板栗種子進(jìn)行保濕。無(wú)菌苗培養(yǎng)基質(zhì)配比與處理:將珍珠巖、蛭石、草炭土按照體積比為1:4:5的比例混合，然后在121 °C條件下滅菌2小時(shí)。選用聚乙烯材質(zhì)，體積為60 X 40 X 60cm的培養(yǎng)缽進(jìn)行培養(yǎng)，使用之前用75%的乙醇對(duì)培養(yǎng)缽的表面擦拭消毒。無(wú)菌苗培養(yǎng):板栗種子處理后，待70%以上的板栗種子裂口，將板栗種子播種于裝填有無(wú)菌培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)缽中，然后將培養(yǎng)缽放置在培養(yǎng)室內(nèi)。使培養(yǎng)室內(nèi)的濕度保持在60%-75%，溫度保持在20°C -25°C，每間隔7天澆水一次，根據(jù)時(shí)節(jié)，調(diào)整供水量，以保證苗木正常生長(zhǎng)，培養(yǎng)一年。接種:采用點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑蘸根與補(bǔ)接相結(jié)合的方法。將栽培滿一年后的待栽培板栗無(wú)菌苗的根系外圍側(cè)根簡(jiǎn)略處理，沾點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑后移植到填滿真菌與無(wú)菌土混合的培養(yǎng)缽中，澆透水。約七天左右，補(bǔ)接菌劑，用點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑澆灌苗木，而后，以十天為一周期，以水澆灌苗木，栽培三月后，觀察板栗無(wú)菌苗的根系，得到所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根。菌根形態(tài)觀察:將天然點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌置于有水的培養(yǎng)皿中，用MOTIC SMZ-140解剖鏡觀察外延菌絲并測(cè)量并記錄。取所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根根尖20個(gè)，固定于FAA固定液中，制成菌根石蠟切片，用番紅和固綠兩種燃料復(fù)染。用MOTIC SMZ-140解剖鏡和顯微鏡觀察天然點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌與點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，并測(cè)量拍照，其結(jié)果
表明完全一致。驗(yàn)證菌根來(lái)源:采用分子手段，提取點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的DNA，驗(yàn)證板栗苗所形成的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根是接種的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌形成的，其結(jié)果表明點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根與天然點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌完全一致。應(yīng)當(dāng)理解的是， 本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種合成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的方法，其包括以下步驟: A、采用組織分離法，在無(wú)菌條件下取點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌的菌柄與菌蓋之間的組織接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，得到點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲，將所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與PDA試管斜面培養(yǎng)基分離，得到純凈的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲，將純凈的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與無(wú)菌水混合后用攪拌機(jī)攪碎得到點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑； B、將待栽培板栗無(wú)菌苗的根系沾滿所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑后移栽在培養(yǎng)缽中，培養(yǎng)缽中填充有真菌與無(wú)菌土的混合物，7天-10天后向培養(yǎng)缽中澆灌所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑進(jìn)行補(bǔ)接，然后以水澆灌，栽培三個(gè)月至一年，從板栗苗木的根系上得到所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A具體的包括:將所述組織接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，待所述組織上長(zhǎng)出少量點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲后，將其轉(zhuǎn)接到新的PDA試管斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)在所述新的PDA試管培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與所述新的PDA試管培養(yǎng)基進(jìn)行分離。
3.根據(jù)權(quán)利要2所述的方法，其特征在于，所述步驟A中PDA試管斜面培養(yǎng)基由馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉與水組成，其重量份分別為: 馬鈴薯為100份-200份，葡萄糖10份-20份，瓊脂粉15份-20份，水500份-1000份。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟A中對(duì)在所述新的PDA試管培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與所述新的PDA試管培養(yǎng)基進(jìn)行分離的過(guò)程為:用無(wú)菌水對(duì)新的PDA試管培養(yǎng)基與點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲洗滌三次，然后按照一升無(wú)菌水中菌絲鮮重為40g的比例，用攪拌機(jī)攪碎30秒制成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑待用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B具體的包括: B1、將板栗種子用1%的高錳酸鉀`浸泡4-5小時(shí)表面消毒，之后無(wú)菌水洗滌至水無(wú)色，盛放在鋪滿脫脂棉的培養(yǎng)盤中，然后將所述培養(yǎng)盤放置于25°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天，每間隔10小時(shí)-14小時(shí)用無(wú)菌水對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行保濕。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟B具體的包括:待所述步驟BI中70%以上的板栗種子裂口后，將所有板栗種子播種于裝填有無(wú)菌培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)缽中，將培養(yǎng)缽放置于培養(yǎng)室內(nèi)，所述培養(yǎng)室濕度為60%-75%，溫度為20°C _25°C，并且每間隔5天-8天對(duì)培養(yǎng)缽澆水一次，培養(yǎng)一年得到所述待栽培板栗無(wú)菌苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟B具體的還包括:所述無(wú)菌培養(yǎng)基質(zhì)由珍珠巖、蛭石與草炭土組成，珍珠巖、蛭石與草炭土按照體積比為1:4:5的比例混八口 ο
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種合成點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根的方法，其包括以下步驟采用組織分離法，在無(wú)菌條件下取點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌的菌柄與菌蓋之間的組織接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上，得到點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲，將所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與PDA試管斜面培養(yǎng)基分離，得到純凈的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲，將純凈的點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌絲與無(wú)菌水混合后用攪拌機(jī)攪碎得到點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑；將待栽培板栗無(wú)菌苗的根系沾滿所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑后移栽在培養(yǎng)缽中，培養(yǎng)缽中填充有真菌與無(wú)菌土的混合物，7天-10天后向培養(yǎng)缽中澆灌所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌劑進(jìn)行補(bǔ)接，然后以水澆灌，栽培三個(gè)月至一年，從板栗苗木的根系上得到所述點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌菌根。
文檔編號(hào)A01G1/04GK103181298SQ20131012036
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者冀瑞卿, 李玉, 朱姝蕊 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)