專利名稱：以花椰菜小孢子胚為外植體建立高效再生體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以小孢子胚為外植體建立花椰菜高效再生體系的方法。
背景技術(shù)：
花椰菜(Ara1S1Sica oleracea var . botrytis )屬十字花科蕓薹屬植物，其花球營養(yǎng)豐富，除含蛋白質(zhì)、纖維素和各種礦物質(zhì)外，還含有多種吲哚衍生物，具有顯著的防癌、抗癌功效，越來越受到消費(fèi)者的青睞，近年來栽培面積迅速擴(kuò)大，已成為我國的主要蔬菜作物之一。但花椰菜生長期間病蟲害嚴(yán)重、不耐貯藏、品質(zhì)差等問題一直困擾著廣大菜農(nóng)與菜商。因此，對(duì)花椰菜品種進(jìn)行改良勢(shì)在必行，而常規(guī)育種方法已不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對(duì)花椰菜品種改良的要求?，F(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展為人們選育和轉(zhuǎn)化具有優(yōu)良園藝性狀基因的突破性品種提供了可能。然而，國內(nèi)外關(guān)于花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)還很不成熟，遺傳轉(zhuǎn)化率極低，難以適應(yīng)花椰菜分子育種的要求，其原因在于尚未真正解決并建立起適宜于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花椰菜高頻率植株的再生技術(shù)。
前人雖對(duì)花椰菜組織培養(yǎng)研究已進(jìn)行了多方面的探索，通過對(duì)不同基因型品種及外植體、不同培養(yǎng)基成分(包括蔗糖濃度和激素配比等)、不同培養(yǎng)條件對(duì)愈傷的誘導(dǎo)、增殖及分化再生能力的影響進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，也獲得了一些高頻率的再生體系，但僅限少數(shù)幾個(gè)品種，且每個(gè)外植體上再生芽數(shù)較少，增殖能力低。另一方面，以上研究大多是以花椰菜的下胚軸和子葉為外植體，截止目前為止，以花椰菜小孢子胚為外植體的相關(guān)研究國內(nèi)外尚未見有報(bào)道。小孢子胚是植物小孢子通過分離、純化和培養(yǎng)后形成的胚狀體，其特點(diǎn)是分化能力強(qiáng)，周體都可以再生出不定芽，增殖系數(shù)高；其次，小孢子胚周體都可以被農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化，故有利于外源基因的成功導(dǎo)入；再次，小孢子胚具有遺傳背景一致性，大大方便了對(duì)轉(zhuǎn)化陽性株表型差異的觀察和特異基因的功能研究。但花椰菜小孢子培養(yǎng)一直以來被認(rèn)為是在蕓薹屬中最難成功的技術(shù)之一。為此，發(fā)明人對(duì)花椰菜小孢子培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了創(chuàng)新、改進(jìn)和完善，突破了花椰菜小孢子培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸，使誘導(dǎo)成功率達(dá)84. 6%，最高每花蕾胚狀體產(chǎn)量達(dá)112胚，實(shí)現(xiàn)了小孢子胚的流水線生產(chǎn)。在此基礎(chǔ)上，本研究以花椰菜小孢子胚為外植體，對(duì)影響其芽再生的相關(guān)因素進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，獲得了芽誘導(dǎo)率達(dá)100%的再生體系，且每個(gè)外植體的芽誘導(dǎo)數(shù)為30-50個(gè)。該方法既大幅度提高了花椰菜組培的增殖率，又為提高花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化率提供了一個(gè)新的途徑，從而為今后的花椰菜基因工程遺傳改良奠定了繁苗技術(shù)基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對(duì)傳統(tǒng)花椰菜再生芽誘導(dǎo)以其下胚軸和子葉為外植體，所存在的再生芽數(shù)少、增殖能力低，遺傳轉(zhuǎn)化率低等的缺陷，提供一種外植體再生芽數(shù)多、增殖能力強(qiáng)、遺傳背景一致性好，具高效遺傳轉(zhuǎn)化潛力的花椰菜高頻率植株再生的方法。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。以花椰菜小孢子胚為外植體建立高效再生體系的方法，該方法按如下步驟進(jìn)行
(1)培養(yǎng)基的配制包括，
1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 2,4-D1. 0-2. O mg/L + ZT O. 5-1. O mg/L + AgNO3
4.0-5. O mg/L + 30 g/L 鹿糖 + 9 g/L 瓊脂，pH 5. 8,高溫滅菌；
2)分化培養(yǎng)基MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ ZT O. 5-1. Omg/L + BAP1. 0-2. Omg/L + NM O. 05mg/L + AgNO3 4. 0-5. Omg/L + 30g/L 鹿糖 + 9g/L 瓊脂，pH 5. 8,高溫滅菌；
3)再分化培養(yǎng)基MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+AgNO3 4. O mg/L + 30 g/L蔗糖+ 10-11 g/L瓊脂，pH 5. 8,聞溫滅囷；
4)生根培養(yǎng)基1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ NAA 1.0 mg/L + 30 g/L蔗糖+ 9 g/L瓊脂，pH 5. 8,高溫滅菌；
(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養(yǎng)
O小孢子胚的選取選取雙單倍體材料花蕾分離的小孢子在25-28°C暗培養(yǎng)30-35天獲得的發(fā)育正常、生長良好的子葉胚，備用；
2)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)將足夠量的子葉胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25-28°C光培養(yǎng)I周至小孢子胚明顯膨大并形成淺綠色愈傷組織；
3)愈傷分化培養(yǎng)將愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，于26-28°C、每天光照16小時(shí)條件下培養(yǎng)2-3周至出芽點(diǎn)；
4)愈傷再分化培養(yǎng)將帶芽點(diǎn)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到再分化培養(yǎng)基中，于26°C、每天光照16小時(shí)條件下培養(yǎng)2-3周至出苗成再生苗；
5)生根培養(yǎng)將再生苗移入生根培養(yǎng)基中，于26°C、每天光照16小時(shí)條件下培養(yǎng)1-2周至出根。本發(fā)明的有益效果是
一、本發(fā)明通過植物激素配比、培養(yǎng)基成分、添加劑濃度調(diào)試等因素對(duì)花椰菜小孢子胚培養(yǎng)影響的比較試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加玉米素O. 5-1. O mg/L后對(duì)花椰菜小孢子胚愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽再生具有明顯的促進(jìn)作用，芽誘導(dǎo)率和每外植體芽誘導(dǎo)數(shù)分別比對(duì)照提高約1.1倍和3. 2倍；同時(shí)在培養(yǎng)基中添加4. 0-5. O mg/L AgNO3后可以一定程度減輕褐化現(xiàn)象，褐化率比對(duì)照降低10%左右，同時(shí)也促進(jìn)了芽誘導(dǎo)率的提高，比對(duì)照提高5%左右。二、本發(fā)明利用花椰菜小孢子胚為外植體，采用特定的培養(yǎng)基成分，不同的培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)、分化，直至植株再生，本發(fā)明能得到高達(dá)100%的芽誘導(dǎo)率，且平均每個(gè)外植體的芽數(shù)可達(dá)30-50個(gè)，比以前報(bào)道的花椰菜其它外植體組織的芽誘導(dǎo)數(shù)要高1-3 倍。三、本發(fā) 明以花椰菜小孢子胚為外植體的高頻再生體系的建立，既可大幅度提高花椰菜組培的芽誘導(dǎo)率和增殖率，同時(shí)由該法再生的小孢子胚具有遺傳背景一致、易被農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化，有利于外源基因?qū)氲忍攸c(diǎn)，故又為提高花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化率提供了一個(gè)新的途徑，從而為今后的花椰菜基因工程的遺傳改良奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例1 :(花椰菜小孢子胚高頻率芽再生的培養(yǎng)方法I)
該方法按如下步驟進(jìn)行
(1)培養(yǎng)基的配制包括外植體芽再生各階段的培養(yǎng)基，它們的組分與各組分在每升培養(yǎng)基中所含重量為
1)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 2,4-D 1.0 mg/L + ZT O. 8 mg/L + AgNO3 4.0mg/L + 30g/L鹿糖+ 9g/L瓊脂，pH 5. 8,高溫滅菌；
2)愈傷分化培養(yǎng)基MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + ZT O. 5 mg/L + BAP 2. O mg/L + NAA O. 05mg/L + AgNO3 4. O mg/L + 30 g/L 鹿糖 + 9 g/L 瓊脂，pH 5. 8,高溫滅菌；
3)愈傷再分化培養(yǎng)基MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+AgNO3 4. O mg/L + 30 g/L蔗糖+ 10 g/L瓊脂，pH 5. 8,聞溫滅囷；
4)生根培養(yǎng)基1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ NAA I mg/L + 30 g/L蔗糖+ 9 g/L瓊脂，pH
5.8,聞溫滅囷；
(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養(yǎng)
O小孢子胚的選擇選取雙單倍體材料花蕾分離的小孢子在26°C暗培養(yǎng)32天獲得的發(fā)育正常、生長良好的子葉胚200個(gè),備用； 2)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基高壓滅菌后分裝于直徑9cm的玻璃培養(yǎng)皿中；將選取的200個(gè)小孢子胚從培養(yǎng)液中揀出、無菌濾紙吸干后，放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25°C，每天光照16小時(shí)，培養(yǎng)I周至胚狀體明顯膨大并形成淺綠色愈傷組織；
3)愈傷分化培養(yǎng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基高壓滅菌后分裝于5X9cm(底X高)圓柱形玻璃瓶中；將愈傷組織轉(zhuǎn)接到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于26°C每天光照16小時(shí)條件下培養(yǎng)2-3周至愈傷組織出現(xiàn)可見芽點(diǎn)；
4)愈傷再分化培養(yǎng)愈傷再分化培養(yǎng)基高壓滅菌后分裝于5X9cm(底X高)圓柱形玻璃瓶中；選取帶有綠色芽點(diǎn)的外植體轉(zhuǎn)接到愈傷再分化培養(yǎng)基上，于26°C每天光照16小時(shí)條件下培養(yǎng)2-3周至出苗成再生苗；
5)再生植株的生根培養(yǎng)切取萌發(fā)有正常生長點(diǎn)的再生植株，插于生根培養(yǎng)基中，于26°C每天光照16小時(shí)條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)1-2周至出根；
以花椰菜小孢子胚為外植體，用上述方法進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了高達(dá)100%的芽誘導(dǎo)率，平均每個(gè)外植體的再生芽數(shù)為30-50個(gè)，且芽長勢(shì)良好，芽生根率達(dá)100%。實(shí)施例2 (花椰菜小孢子胚高頻率芽再生的培養(yǎng)方法2)
本實(shí)施例中，步驟(I)培養(yǎng)基的配制其中，I)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2，4-D為1.5 mg/L、ZT 為 1.0 mg/L、AgNO3 為 4. 5 mg/L ;2)愈傷分化培養(yǎng)基中的 ZT 為 0.8 mg/L、BAP 為1. 5 mg/L、AgNO3為4. 5 mg/L ；3)愈傷再分化培養(yǎng)基上中的瓊脂為10. 5 g/L ;步驟(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養(yǎng)其中，I)選取的小孢子在25°C暗培養(yǎng)35天后取生長良好的子葉胚180個(gè)；2)子葉胚于27°C，每天光照16小時(shí)，培養(yǎng)I周；3)愈傷組織于28°C，每天光照16小時(shí)，培養(yǎng)2-3周，至出現(xiàn)可見芽點(diǎn)；其余步驟工藝均同于實(shí)施例1。實(shí)施例3 (花椰菜小孢子胚高頻率芽再生的培養(yǎng)方法3)
本實(shí)施例中，步驟(I)培養(yǎng)基的配制其中，I)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2，4-D為2.0 mg/L、ZTS0.5 mg/L, AgNO3 為 5· O mg/L ;2)愈傷分化培養(yǎng)基中的 ZT 為 1.0 mg/L,BAP 1.0mg/L、AgN03S 5.0 mg/L ;3)愈傷再分化培養(yǎng)基中的瓊脂為11 g/L ;步驟(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養(yǎng)其中，I)選取的小孢子在28°C暗培養(yǎng)30天后取生長良好的子葉胚180個(gè)；2)子葉胚于28°C，每天光照16小時(shí)，培養(yǎng)I周；3)愈傷組織于27°C，每天光照16小時(shí)，培養(yǎng)2-3周，至出現(xiàn)可見芽點(diǎn)；其余步驟工藝均同于實(shí)施例1。實(shí)施例4 (花椰菜小孢子胚高頻率芽再生的比較試驗(yàn))
本實(shí)施例中，步驟(I)培養(yǎng)基的配制為1)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2，4-D為2.0 mg/L、ZT 為 0-1. 3 mg/L、AgNO3 為 O 與 4. 5 mg/L ;2)愈傷分化培養(yǎng)基中的 ZT 為 0-1.3 mg/L、BAP1. O mg/L、AgNO3為O與4. 5 mg/L ；3)愈傷再分化培養(yǎng)基上中的瓊脂為11 g/L ;步驟
(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養(yǎng)其中，I)選取的小孢子在28°C暗培養(yǎng)30天后取生長良好的子葉胚150個(gè)；2)子葉胚于28°C，每天光照16小時(shí)，培養(yǎng)I周；3)愈傷組織于27°C，每天光照16小時(shí)，培養(yǎng)2-3周，至出現(xiàn)可見芽點(diǎn)；其余步驟工藝均同于實(shí)施例1。所獲結(jié)果如表I所示，培養(yǎng)基中添加一定濃度的ZT，可以大幅度提高小孢子胚的愈傷和芽誘導(dǎo)率及每外植體芽誘導(dǎo)數(shù)。其中，培養(yǎng)基添加O. 5,0. 8和1. O mg Γ1的ZT均使外植體的愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到95%以上，約是對(duì)照的1. 9倍；芽誘導(dǎo)率均達(dá)到94%以上，約是對(duì)照的2.1倍；每外植體芽數(shù)均達(dá)到30個(gè)以上，約為對(duì)照的4. 2倍。同時(shí)，培養(yǎng)基中添加4. 5 mg Γ1的AgNO3可以一定程度減輕褐化現(xiàn)象，褐化率比對(duì)照降低10%左右，同時(shí)也促進(jìn)了芽誘導(dǎo)率的提聞，比對(duì)照提聞5%左右。表I花椰菜小孢子胚在不同ZT和AgNO3濃度下愈傷和芽的誘導(dǎo)率
權(quán)利要求
1.以花椰菜小孢子胚為外植體建立高效再生體系的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行 (1)培養(yǎng)基的配制包括，1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 2,4-D1. 0-2. 0 mg/L + ZT 0. 5-1. 0 mg/L + AgN03.4.0-5. 0 mg/L + 30 g/L 鹿糖 + 9 g/L 瓊脂，pH 5. 8,高溫滅菌； 2)分化培養(yǎng)基MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ ZT 0. 5-1. 0mg/L + BAP1. 0-2. 0mg/L + NM 0. 05mg/L + AgN03 4. 0-5. 0mg/L + 30g/L 鹿糖 + 9g/L 瓊脂，pH 5. 8,高溫滅菌； 3)再分化培養(yǎng)基MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+AgN03 4. 0 mg/L + 30 g/L蔗糖+ 10-11 g/L瓊脂，pH 5. 8,聞溫滅囷； 4)生根培養(yǎng)基1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ NAA 1.0 mg/L + 30 g/L蔗糖+ 9 g/L瓊脂，pH 5. 8,高溫滅菌； (2)花椰菜小孢子胚再生植株的培養(yǎng) 1)小孢子胚的選取選取雙單倍體材料花蕾分離的小孢子在25-28°C暗培養(yǎng)30-35天獲得的發(fā)育正常、生長良好的子葉胚，備用； 2)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)將足夠量的子葉胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25-28°C光培養(yǎng)I周至小孢子胚明顯膨大并形成淺綠色愈傷組織； 3)愈傷分化培養(yǎng)將愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，于26-28°C、每天光照16小時(shí)條件下培養(yǎng)2-3周至出芽點(diǎn)； 4)愈傷再分化培養(yǎng)將帶芽點(diǎn)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到再分化培養(yǎng)基中，于26°C、每天光照16小時(shí)條件下培養(yǎng)2-3周至出苗成再生苗； 5)生根培養(yǎng)將再生苗移入生根培養(yǎng)基中，于26°C、每天光照16小時(shí)條件下培養(yǎng)1-2周至出根。
全文摘要
本發(fā)明公開了以花椰菜小孢子胚為外植體建立高效再生體系的方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。包括培養(yǎng)基的配制和花椰菜小孢子胚再生植株培養(yǎng)等兩大步驟。本發(fā)明以小孢子胚為外植體，其芽誘導(dǎo)率高達(dá)100%，每外植體芽數(shù)達(dá)30-50個(gè)；培養(yǎng)基添加玉米素0.5-1.0mg/L后，芽誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)數(shù)比對(duì)照分別提高1.1倍和3.2倍；添加4.0-5.0mg/LAgNO3后褐化率比對(duì)照降低10%左右。該方法既大幅度提高了花椰菜組培的效率，并為提高其遺傳轉(zhuǎn)化率提供了新的技術(shù)途徑。本發(fā)明可在花椰菜組培及基因工程遺傳改良中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103053423SQ20131001392
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者盛小光, 顧宏輝, 趙振卿, 虞慧芳, 王建升, 許映君 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院