專(zhuān)利名稱(chēng)：黃柄鵝膏與共生植物室內(nèi)共生關(guān)系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內(nèi)共生關(guān)系的建立方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是屬于植物組織培養(yǎng)及大型真菌菌絲體培養(yǎng)范疇。
背景技術(shù)：
鵝膏菌屬—)隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、傘菌目、鵝膏菌科 iaceae)，是有毒的大型真菌中較特殊、較有價(jià)值的一個(gè)世界性廣布大屬。鵝膏菌屬
中的大部份種屬于著名劇毒菌，主要含鵝膏毒素，鵝膏毒素在研發(fā)抗菌抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜麻醉等新藥方面具有潛在應(yīng)用，因而成為了近年的研究熱點(diǎn)。 鵝膏菌屬絕大部分屬于外生菌根真菌，目前尚不能進(jìn)行人工栽培，難以開(kāi)發(fā)利用，其子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育與共生植物關(guān)系密切，因此鵝膏菌和其共生植物的生物學(xué)關(guān)系的研究，是進(jìn)一步探討鵝膏菌子實(shí)體發(fā)生機(jī)制的可行途徑。黃柄鵝膏菌(Anianita flavipes Imai)是鵝膏屬中的一個(gè)廣布種，在云南武定獅子山分布較多，主要與殼斗科的滇青岡、元江栲iCastanopsis orthacantha)等闊葉樹(shù)共生，滇青岡{Cyclobalanopsis glaucoides )為殼斗科(Fagaceae)、青岡屬{Cyclobalanopsis Oerst.)植物,在獅子山闊葉林地上可以收集較多的滇青網(wǎng)種子，因此本發(fā)明以滇青R種子及黃柄鵝膏子實(shí)體為材料，成功地建立了黃柄鵝膏與滇青R的室內(nèi)共生關(guān)系，為今后共生機(jī)理及鵝膏子實(shí)體發(fā)生的機(jī)制研究等提供了技術(shù)貯備。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，在室內(nèi)或可控條件下建立一種簡(jiǎn)單穩(wěn)定、互利互惠的黃柄鵝膏與滇青岡植物的共生關(guān)系。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案利用殼斗科滇青R植物種子，成功得到了無(wú)菌苗及盆栽苗，利用黃柄鵝膏子實(shí)體誘導(dǎo)了菌絲體，將菌絲體分別接種到無(wú)菌苗及盆栽苗根部，室內(nèi)建立了二者的共生關(guān)系，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的主要步驟如下
(I)黃柄鵝膏菌絲體的誘導(dǎo)及培養(yǎng)野外采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無(wú)蟲(chóng)害、未開(kāi)傘或未完全開(kāi)傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約O. 08 O. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、NH4N03 O. 30 O. 40g/L、谷氨酸 O. 28 O. 32 g/L、VB1 O. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、瓊脂 11. 00g/L，控制 PH 值為
5.4左右)表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)14 18天，菌塊周?chē)_(kāi)始萌發(fā)出極少白色菌絲，53 60天，組織塊多處隆起，表面長(zhǎng)出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基(馬鈴薯100. 00 120. 00g/L、葡萄糖9. 00 12. 00g/L、滇青R腐葉干粉(過(guò)80 100目分樣篩)30. 00 50. 00g/L、生境土干粉(過(guò)80 100目分樣篩)60. 00 80. 00g/L、蛋白胨 3. 00 5. 00 g /UNH4NO3 0. 60 0. 80g/L、6_BAl. 20 I.50mg/L、麥芽汁200 230 ml/L、瓊脂6. 00 8. 00 g/L，控制PH值為5. 4左右)進(jìn)行擴(kuò)
大培養(yǎng)；
(2)滇青R無(wú)菌苗的培養(yǎng)于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無(wú)明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無(wú)菌水清洗3次；將種子放置于O. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無(wú)菌水清洗6 8次；將處理后的種子放置于無(wú)菌濾紙上濾干水分；將種子芽胚朝上接進(jìn)萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，無(wú)糖，6-BA I. 00 I. 50mg/L，NAA O. 08 O. 10mg/L，瓊脂7.50g/L, pH為6. 80)，每瓶接種I顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)8 10天后生根開(kāi)始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養(yǎng)5 8天，長(zhǎng)出I. 8 2. 3cm高的小苗時(shí)進(jìn)行菌絲接種(接種方法為將前面培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個(gè)菌絲塊圍繞培養(yǎng)瓶中的無(wú)菌小苗按6個(gè)方向等距接種，接種瓶苗于22 23°C下培養(yǎng)13 16天，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，小苗高3. O 3. 5cm,葉3 5片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖桿粗狀、葉色濃綠、葉片多)，建立起黃柄鵝膏菌絲與無(wú)菌小苗的共生關(guān)系；
(3)滇青R盆栽苗的培養(yǎng)將野外取回的生境土及腐葉在陽(yáng)光下曝曬2 3天，放置于花盆中；將以上濾紙濾干水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過(guò)干隔天澆水；上午9 00以后將花盆置于室外自然光照下，晚上7 00左右將其移至室內(nèi)保溫；約25 30天種子發(fā)芽，待59 63天小苗長(zhǎng)至4 5片真葉、高4 6cm時(shí)進(jìn)行接種，接種方法為將前面培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開(kāi)露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種10 15塊)，蓋上泥土及腐葉，置于室外光照較好、空氣清潔處培養(yǎng)，每隔13 15天，接種一次，共接種五次，118 122天，植株高10. O 13. Ocm,葉子9 11片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長(zhǎng)健壯，葉數(shù)多，葉子濃綠，抗病性增強(qiáng)，建立起黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關(guān)系。本發(fā)明的有益效果是在室內(nèi)以?xún)煞N方式(無(wú)菌及盆栽)成功建立了黃柄鵝膏菌與滇青網(wǎng)的共生體系，其特點(diǎn)如下，
(O以滇青R種子，成功獲得了無(wú)菌苗及盆栽菌，在可控條件下提供了兩種滇青R植物的人工培養(yǎng)方法；
(2)建立的兩種共生體系，各具特點(diǎn)，相互補(bǔ)充，無(wú)菌體系由于生長(zhǎng)快，且為純共生體，可以快速方便地研究二者的共生情況，盆栽苗由于自然生長(zhǎng)，更接近野外原生境，可以將無(wú)菌條件下的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接用在盆栽苗上模擬或擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)；
(3)提供了菌根真菌與植物實(shí)驗(yàn)條件下共生關(guān)系的研究方法，為其它大型真菌與共生植物的研究提供了方法借鑒。
具體實(shí)施例方式 以下的實(shí)施例子是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)例一
野外采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無(wú)蟲(chóng)害、未開(kāi)傘或未完全開(kāi)傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子 實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約O. 08 O. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 O. 30g/L、谷氨酸 O. 32 g/L、Vbi O. 10mg/L、麥芽汁150 ml/L、瓊脂11. 00g/L，控制PH值為5. 4左右)表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)14天，菌塊周?chē)_(kāi)始萌發(fā)出極少白色菌絲，60天，組織塊多處隆起，表面長(zhǎng)出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基(馬鈴薯100. 00g/L、葡萄糖10.00g/L、滇青R腐葉干粉(過(guò)80目分樣篩)30.00g/L、生境土干粉(過(guò)80目分樣篩)70. 00g/L、蛋白胨 3. 00g/L、NH4NO3 0. 80g/L、6_BAl. 50mg/L、麥芽汁 200ml/L、瓊脂 6. 00 g/L，控制PH值為5. 4左右)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無(wú)明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無(wú)菌水清洗3次；將種子放置于0. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無(wú)菌水清洗6 8次；將 處理后的種子放置于無(wú)菌濾紙上濾干水分；將種子芽胚朝上接進(jìn)萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，無(wú)糖，6-BA I. 50mg/L, NAAO. 10mg/L，瓊脂 7. 50 g/L, pH 為 6. 80)，每瓶接種 I 顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)8天后生根開(kāi)始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養(yǎng)5天，長(zhǎng)出約2. Ocm高的小苗時(shí)進(jìn)行菌絲接種(接種方法為將前面培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個(gè)菌絲塊圍繞培養(yǎng)瓶中的無(wú)菌小苗按6個(gè)方向等距接種，接種瓶苗于22 23°C下培養(yǎng)13天，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，小苗高約3. Ocm,葉4 5片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖桿粗狀、葉色濃綠、葉片多)，建立起黃柄鵝膏菌絲與無(wú)菌小苗的共生關(guān)系；
將野外取回的生境土及腐葉在陽(yáng)光下曝曬2天，放置于花盆中；將以上濾紙濾干水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過(guò)干隔天澆水；上午9 00以后將花盆置于室外自然光照下，晚上7 :00左右將其移至室內(nèi)保溫；約25天種子發(fā)芽，待60天小苗長(zhǎng)至4 5片真葉、高約4cm時(shí)進(jìn)行接種，接種方法為將前面培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開(kāi)露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種10塊)，蓋上泥土及腐葉，置于室外光照較好、空氣清潔處培養(yǎng)，每隔13天，接種一次，共接種五次，118天，植株高約10. 0cm，葉子9 10片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長(zhǎng)健壯，葉數(shù)多，葉子濃綠，抗病性增強(qiáng)，建立起黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關(guān)系。實(shí)例二
野外采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無(wú)蟲(chóng)害、未開(kāi)傘或未完全開(kāi)傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 30g/L、谷氨酸 0. 32 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁150 ml/L、瓊脂11. 00g/L，控制PH值為5. 4左右)表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)14天，菌塊周?chē)_(kāi)始萌發(fā)出極少白色菌絲，60天，組織塊多處隆起，表面長(zhǎng)出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基(馬鈴薯100. 00g/L、葡萄糖10.00g/L、滇青R腐葉干粉(過(guò)80目分樣篩)30. 00g/L、生境土干粉(過(guò)80目分樣篩)70. 00g/L、蛋白胨 3. 00 g /UNH4NO3 0. 80g/L、6_BAl. 50mg/L、麥芽汁200ml/L、瓊脂6. OOg/L，控制PH值為5. 4左右)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無(wú)明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無(wú)菌水清洗3次；將種子放置于0. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無(wú)菌水清洗6 8次；將處理后的種子放置于無(wú)菌濾紙上濾干水分；將種子芽胚朝上接進(jìn)萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，無(wú)糖，6-BA I. 50mg/L,NAA 0. 10mg/L，瓊脂 7. 50 g/L，pH 為 6. 80)，每瓶接種 I 顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)10天后生根開(kāi)始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養(yǎng)8天，長(zhǎng)出約I. 8cm高的小苗時(shí)進(jìn)行菌絲接種(接種方法為將前面培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個(gè)菌絲塊圍繞培養(yǎng)瓶中的無(wú)菌小苗按6個(gè)方向等距接種，接種瓶苗于22 23°C下培養(yǎng)16天，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，小苗約高3. 5cm,葉3 4片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖桿粗狀、葉色濃綠、葉片多)，建立起黃柄鵝膏菌絲與無(wú)菌小苗的共生關(guān)系；
將野外取回的生境土及腐葉在陽(yáng)光下曝曬3天，放置于花盆中；將以上濾紙濾干水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過(guò)干隔天澆水；上午9 00以后將花盆置于室外自然光照下，晚上7 :00左右將其移至室內(nèi)保溫；約30天種子發(fā)芽，待63天小苗長(zhǎng)至4 5片真葉、高約6cm時(shí)進(jìn)行接種，接種方法為將前面培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開(kāi)露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種15塊)，蓋上泥土及腐葉，置于室外光照較好、空氣清潔處培養(yǎng)，每隔15天，接種一次，共接種五次，122天，植株約高13. 0cm，葉子10 11片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長(zhǎng)健壯，葉數(shù)多，葉子濃綠，抗病性增強(qiáng)，建立起黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關(guān)系。實(shí)例三
野外采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無(wú)蟲(chóng)害、未開(kāi)傘或未完全開(kāi)傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 40g/L、谷氨酸 0. 28 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁150 ml/L、瓊脂11. 00g/L，控制PH值為5. 4左右)表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)16天，菌塊周?chē)_(kāi)始萌發(fā)出極少白色菌絲，55天，組織塊多處隆起，表面長(zhǎng)出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基(馬鈴薯120. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、滇青R腐葉干粉(過(guò)100目分樣篩)50. 00g/L、生境土干粉(過(guò)100目分樣篩)60. 00g/L、蛋白胨 5. 00 g /L、NH4NO3 0. 60g/L、6_BAl. 20mg/L、麥芽汁 230 ml/L、瓊脂 8. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無(wú)明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無(wú)菌水清洗3次；將種子放置于O. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無(wú)菌水清洗6 8次；將處理后的種子放置于無(wú)菌濾紙上濾干水分；將種子芽胚朝上接進(jìn)萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，無(wú)糖，6-BA I. 00mg/L, NAA O. 08 mg/L，瓊脂 7. 50 g/L，pH 為 6. 80)，每瓶接種 I 顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)9天后生根開(kāi)始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養(yǎng)7天，長(zhǎng)出約2. 3cm高的小苗時(shí)進(jìn)行菌絲接種(接種方法為將前面培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個(gè)菌絲塊圍繞培養(yǎng)瓶中的無(wú)菌小苗按6個(gè)方向等距接種，接種瓶苗于22 23°C下培養(yǎng)15天，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，小苗約高3. 3cm,葉3 4片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖桿粗狀、葉色濃綠、葉片多)，建立起黃柄鵝膏菌絲與無(wú)菌小苗的共生關(guān)系；
將野外取回的生境土及腐葉在陽(yáng)光下曝曬3天，放置于花盆中；將以上濾紙濾干水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過(guò)干隔天澆水；上午9 :00以后將花盆置于室外自然光照下，晚上7 :00左右將其移至室內(nèi)保溫；約27天種子發(fā)芽，待59天小苗長(zhǎng)至4 5片真葉、高約5cm時(shí)進(jìn)行接種，接種方法為將前面培 養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開(kāi)露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種13塊)，蓋上泥土及腐葉，置于室外光照較好、空氣清潔處培養(yǎng)，每隔14天，接種一次，共接種五次，120天，植株約高12. 0cm，葉子9 10片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長(zhǎng)健壯，葉數(shù)多，葉子濃綠，抗病性增強(qiáng)，建立起黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關(guān)系。實(shí)例四
野外采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無(wú)蟲(chóng)害、未開(kāi)傘或未完全開(kāi)傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約O. 08 O. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基(馬鈴薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 40g/L、谷氨酸 0. 28 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁150 ml/L、瓊脂11. 00g/L，控制PH值為5. 4左右)表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C，暗培養(yǎng)16天，菌塊周?chē)_(kāi)始萌發(fā)出極少白色菌絲，55天，組織塊多處隆起，表面長(zhǎng)出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基(馬鈴薯120. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、滇青R腐葉干粉(過(guò)100目分樣篩)50. 00g/L、生境土干粉(過(guò)100目分樣篩)60. 00g/L、蛋白胨 5. 00 g /L、NH4NO3 0. 60g/L、6_BAl. 20mg/L、麥芽汁 230 ml/L、瓊脂 8. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無(wú)明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無(wú)菌水清洗3次；將種子放置于0. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無(wú)菌水清洗6 8次；將處理后的種子放置于無(wú)菌濾紙上濾干水分；將種子芽胚朝上接進(jìn)萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，無(wú)糖，6-BA I. 00mg/L, NAA 0. 08 mg/L，瓊脂 7. 50 g/L，pH 為 6. 80)，每瓶接種 I 顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)8天后生根開(kāi)始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養(yǎng)6天，長(zhǎng)出約2. Icm高的小苗時(shí)進(jìn)行菌絲接種(接種方法為將前面培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個(gè)菌絲塊圍繞培養(yǎng)瓶中的無(wú)菌小苗按6個(gè)方向等距接種，接種瓶苗于22 23°C下培養(yǎng)14天，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，小苗約高3. Icm,葉4 5片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖桿粗狀、葉色濃綠、葉片多)，建立起黃柄鵝膏菌絲與無(wú)菌小苗的共生關(guān)系；
將野外取回的生境土及腐葉在陽(yáng)光下曝曬3天，放置于花盆中；將以上濾紙濾干水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過(guò)干隔天澆水；上午9 00以后將花盆置于室外自然光照下，晚上7 :00左右將其移至室內(nèi)保溫；約28天種子發(fā)芽，待61天小苗長(zhǎng)至4 5片真葉、高約5cm時(shí)進(jìn)行接種，接種方法為將前面培養(yǎng)皿中已擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開(kāi)露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種12塊)，蓋上泥土及腐葉，置于室外光照較好、空氣清潔處培養(yǎng)，每隔15天，接種一次，共接種五次，121天，植株約高11. Ocm，葉子10 11片，接種 小苗比未接種小苗，植株及根系生長(zhǎng)健壯，葉數(shù)多，葉子濃綠，抗病性增強(qiáng)，建立起黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關(guān)系。
權(quán)利要求
1.一種黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內(nèi)共生關(guān)系的建立方法，其特征為，利用黃柄鵝毫(Jinanita fIavipes)子實(shí)體誘導(dǎo)菌絲體,對(duì)菌絲體進(jìn)行擴(kuò)繁；利用野外采集的滇青岡(Cyclobalanopsis glaucoides )種子培養(yǎng)無(wú)菌苗及盆栽苗,將已擴(kuò)繁的菌絲體分別接種到無(wú)菌苗及盆栽苗根部，室內(nèi)建立共生關(guān)系，主要包括下列步驟 (1)黃柄鵝膏菌絲體的誘導(dǎo)及培養(yǎng)野外采摘生長(zhǎng)優(yōu)良、無(wú)蟲(chóng)害、未開(kāi)傘或未完全開(kāi)傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實(shí)體；將子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室，于超凈臺(tái)上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實(shí)體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內(nèi)部組織塊，切成約O. 08 O. 16cm2的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)溫度為22 23°C,暗培養(yǎng)14 18天,菌塊周?chē)_(kāi)始萌發(fā)出極少白色菌絲，53 60天，組織塊多處隆起，表面長(zhǎng)出團(tuán)狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導(dǎo)的菌絲轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用擴(kuò)大培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)； (2)滇青R無(wú)菌苗的培養(yǎng)于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青R種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無(wú)明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30 S，取出種子，用無(wú)菌水清洗3次；將種子放置于O. 1% HgCl2溶液中，搖晃浸泡10 min，取出種子，用無(wú)菌水清洗6 8次；將處理后的種子放置于無(wú)菌濾紙上濾干水分；將種子芽胚朝上接進(jìn)萌發(fā)培養(yǎng)基，每瓶接種I顆，未污染的褐化種子于21 22°C下暗培養(yǎng)8 10天后生根開(kāi)始萌發(fā)，轉(zhuǎn)入2000 2500Lux的光照下相同溫度再培養(yǎng)5 8天，長(zhǎng)出I. 8 2. 3cm高的小苗時(shí)進(jìn)行菌絲接種； (3)滇青R盆栽苗的培養(yǎng)將野外取回的生境土及腐葉在陽(yáng)光下曝曬2 3天，放置于花盆中；將以上濾紙濾干水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3 4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過(guò)干隔天澆水；上午9 00以后將花盆置于室外自然光照下，晚上7 00左右將其移至室內(nèi)保溫；約25 30天種子發(fā)芽，待59 63天小苗長(zhǎng)至4 5片真葉、高4 6cm時(shí)進(jìn)行接種。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內(nèi)共生關(guān)系的建立方法，其特征在于步驟(I)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、NH4NO3 O. 30 0.40g/L、谷氨酸 O. 28 O. 32 g/L、Vbi O. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、瓊脂 11. 00g/L，控制PH值為5. 4左右；擴(kuò)大培養(yǎng)基為馬鈴薯100. 00 120. 00g/L、葡萄糖9. 00 12. 00g/L、滇青R腐葉干粉(過(guò)80 100目分樣篩)30. 00 50. 00g/L、生境土干粉(過(guò)80 100目分樣篩)60. 00 80. 00g/L、蛋白胨 3. 00 5. 00 g /UNH4NO3 0. 60 0. 80g/L、6_BAl. 20 1.50mg/L、麥芽汁200 230 ml/L、瓊脂6. 00 8. 00 g/L，控制PH值為5. 4左右。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內(nèi)共生關(guān)系的建立方法，其特征在于步驟(2)中的滇青岡種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，無(wú)糖，6-BA I. 00 I. 50mg/L,NAA 0. 08 0. 10mg/L,瓊脂 7. 50 g/L, pH 為 6· 80。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內(nèi)共生關(guān)系的建立方法，其特征在于步驟(2)中的菌絲體接種方法為將前面培養(yǎng)皿中擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將截取的6個(gè)菌絲塊圍繞培養(yǎng)瓶中的無(wú)菌小苗按6個(gè)方向等距接種，接種瓶苗于22 23°C下培養(yǎng)13 16天，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，小苗高3. O 3. 5cm,葉3 5片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖桿粗狀、葉色濃綠、葉片多(未接種小苗形成8. O 9. Ocm的高莖桿小苗，莖長(zhǎng)葉少)，表明建立了黃柄鵝膏菌絲與無(wú)菌小苗的共生關(guān)系。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青R室內(nèi)共生關(guān)系的建立方法，其特征在于步驟(3)中的菌絲體接種方法為將前面培養(yǎng)皿中擴(kuò)繁的菌絲體用I cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開(kāi)露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種(每苗接種10 15塊)，蓋上泥土及腐葉，置于室外光照較好、空氣清潔處培養(yǎng)，每隔13 15天，接種一次，共接種五次，118 122天，植株高10. O 13. 0cm，葉子9 11片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長(zhǎng)健壯，葉數(shù)多，葉子濃綠，抗病性增強(qiáng)，表明建立了黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黃柄鵝膏與共生植物滇青岡室內(nèi)共生關(guān)系的建立方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域(植物組織與真菌培養(yǎng))。鵝膏菌絕大部分屬于外生菌根真菌，目前尚不能進(jìn)行人工栽培，難以開(kāi)發(fā)利用，其子實(shí)體的生長(zhǎng)發(fā)育與共生植物滇青岡等關(guān)系密切。本發(fā)明的特征為，利用黃柄鵝膏(A.flavipes)子實(shí)體誘導(dǎo)菌絲體，對(duì)菌絲體進(jìn)行擴(kuò)繁；利用野外采集的滇青岡(C.glaucoides)種子成功獲得了無(wú)菌苗及盆栽苗，并將已擴(kuò)繁的菌絲體分別接種到無(wú)菌苗及盆栽苗根部，接種苗比未接種苗生長(zhǎng)健壯，葉數(shù)多，葉子濃綠，抗病性增強(qiáng)，創(chuàng)新性地建立了黃柄鵝膏與滇青岡的室內(nèi)共生關(guān)系，為今后共生機(jī)理及鵝膏子實(shí)體發(fā)生的機(jī)制研究等提供了技術(shù)貯備。
文檔編號(hào)A01G7/06GK102715089SQ20121023699
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者何雋, 馮遼遼, 吳鵬, 周文, 張曦予, 李宗菊, 李彪, 趙昱 申請(qǐng)人:云南大學(xué)