飛秒脈沖激光調(diào)制器及具有其的微型雙光子顯微成像裝置的制作方法

本發(fā)明涉及光學(xué)成像技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種飛秒脈沖激光調(diào)制器及具有其的微型雙光子顯微成像裝置。

背景技術(shù)：

神經(jīng)科學(xué)的最終目標(biāo)之一是在自由活動(dòng)的動(dòng)物上了解亞細(xì)胞、細(xì)胞、環(huán)路和更高層次的神經(jīng)元信息處理的基本原理。結(jié)合熒光指示劑，光學(xué)顯微鏡已經(jīng)成為這一任務(wù)中的基本研究工具，因?yàn)樗试S在多個(gè)時(shí)間和空間尺度上直接觀測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)。單個(gè)突觸是信息傳遞，處理和存儲(chǔ)的基本單位，對(duì)于理解腦功能和疾病機(jī)理至關(guān)重要。突觸后結(jié)構(gòu)--樹(shù)突棘是亞微米結(jié)構(gòu)，深埋在腦內(nèi)，并以毫秒級(jí)的速度活動(dòng)。由于其固有的光學(xué)切片和深層組織穿透能力，多光子顯微鏡一直是過(guò)去二十年內(nèi)體內(nèi)無(wú)創(chuàng)光學(xué)腦成像的首選技術(shù)。使用臺(tái)式雙光子顯微鏡(英文全稱(chēng)為“two-photonmicroscopy”，下文均簡(jiǎn)稱(chēng)為“tpm”)，已能夠在活體內(nèi)觀察到樹(shù)突棘的形態(tài)變化，比如學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)元的活動(dòng)。觀察在清醒狀態(tài)下活體樣本頭部復(fù)雜的樹(shù)突棘活動(dòng)可以通過(guò)配備有快速圖像采集(采集頻率大于15hz)、高激發(fā)和光電探測(cè)效率的最先進(jìn)的臺(tái)式多光子顯微鏡實(shí)現(xiàn)。然而，活體樣本的頭部一直被固定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間都處在物理約束和情緒壓力下，而且沒(méi)有先驗(yàn)證據(jù)表明神經(jīng)元對(duì)外界的響應(yīng)在虛擬現(xiàn)實(shí)和自由探索下是等價(jià)的。更重要的是，許多社會(huì)行為，比如親子護(hù)理、交配和戰(zhàn)斗，都不能用頭部固定的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究。

為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，一個(gè)理想的解決方案是開(kāi)發(fā)能夠長(zhǎng)時(shí)間觀察活體樣本在自由活動(dòng)過(guò)程中的樹(shù)突棘的結(jié)構(gòu)和功能動(dòng)態(tài)的微型化顯微鏡。denk和他的同事在2001年建立了基于光纖尖端掃描的第一個(gè)微型雙光子顯微鏡(英文全稱(chēng)為“microtwo-photonmicroscopy”，下文均簡(jiǎn)稱(chēng)為“mtpm”)，然后接下來(lái)的十年里，其他許多課題組采取不同方法繼續(xù)嘗試。然而，這些mtpm沒(méi)有一個(gè)被用于后續(xù)的生物應(yīng)用，主要是由于兩個(gè)主要的限制：第一，沒(méi)人能夠成像應(yīng)用最廣泛的熒光探針，如gcamps，原因是缺乏適當(dāng)?shù)墓饫w用來(lái)傳輸920納米飛秒激光脈沖，以保證脈沖到樣品沒(méi)有失真。第二，mtpms在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常表現(xiàn)出低于它們的理論分辨率，原因可能是采樣率低，微型漸變折射率(英文全稱(chēng)為“graded-indexlenses”，下文均簡(jiǎn)稱(chēng)為“grin”)透鏡的像差，微型光學(xué)器件的缺陷和運(yùn)動(dòng)引起的成像噪聲等等。目前，樹(shù)突棘分辨率的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的活動(dòng)不能被mtpms很好的解決，盡管其理論橫向分辨率為大約1μm。

另一方面，微型單光子寬場(chǎng)顯微鏡，例如由ghosh及其同事開(kāi)發(fā)的顯微鏡，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速采集和大視場(chǎng)(英文全稱(chēng)為“fieldofvision”，下文均簡(jiǎn)稱(chēng)為“fov”)以及解決了運(yùn)動(dòng)引起的噪聲問(wèn)題(在神經(jīng)元分辨率)。然而，當(dāng)前的無(wú)創(chuàng)微型寬場(chǎng)顯微鏡僅能獲得細(xì)胞分辨率，并且圖像對(duì)比度受到累積的焦外背景信號(hào)的影響。到目前為止，可以提供很好的成像能力和實(shí)驗(yàn)方案，而且足夠強(qiáng)大到可以滿(mǎn)足神經(jīng)科學(xué)家的日常實(shí)驗(yàn)的新型的mtpm仍有待完成。

因此，希望有一種技術(shù)方案來(lái)克服或至少減輕現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷中的至少一個(gè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明的目的在于提供一種飛秒脈沖激光調(diào)制器及具有其的微型雙光子顯微成像裝置來(lái)克服或至少減輕現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷中的至少一個(gè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種飛秒脈沖激光調(diào)制器，所述飛秒脈沖激光調(diào)制器具有負(fù)色散光路和正色散光路，其中：所述負(fù)色散光路包括激光輸入光纖，所述激光輸入光纖用于將脈沖展寬預(yù)啁啾補(bǔ)償好的激光傳輸給所述掃描成像部；所述正色散光路，其位于所述飛秒脈沖激光器和所述負(fù)色散光路之間，用于補(bǔ)償由所述激光輸入光纖在傳輸激光過(guò)程中引起的負(fù)色散。

本發(fā)明還提供一種微型雙光子顯微成像裝置，所述微型雙光子顯微成像裝置包括：飛秒脈沖激光器，其用于產(chǎn)生波長(zhǎng)為920納米的激光；飛秒脈沖激光調(diào)制器，其為權(quán)利要求如上所述的飛秒脈沖激光調(diào)制器，用于接收所述飛秒脈沖激光器輸出的激光，并預(yù)啁啾補(bǔ)償激光的脈沖展寬至預(yù)設(shè)值，并輸出；以及微型探頭，所述微型探頭包括：掃描成像部分，用于接收所述飛秒脈沖激光調(diào)制器輸出的激光，該激光對(duì)活體樣本內(nèi)部的組織進(jìn)行掃描，以激發(fā)所述活體樣本產(chǎn)生熒光信號(hào)；和熒光輸出光纖，其用于接收所述掃描成像部分輸出的所述熒光信號(hào)，并進(jìn)行輸出。

本發(fā)明提供的微型雙光子顯微成像裝置(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“firm-tpm”)測(cè)試和應(yīng)用的速度快、分辨率高，能夠用于解決自由活動(dòng)動(dòng)物中單個(gè)樹(shù)突棘的成像問(wèn)題的整套實(shí)驗(yàn)方法。在涉及到不規(guī)則的、頻繁的身體和頭部運(yùn)動(dòng)的行為范例中(例如，尾懸掛，跳臺(tái)，和社交行為)，本發(fā)明的微型顯微鏡都可以對(duì)gcamp6f標(biāo)記的的皮層神經(jīng)元的體細(xì)胞，樹(shù)突和樹(shù)突棘進(jìn)行觀測(cè)。綜合起來(lái)，firm-tpm代表了下一代微型顯微鏡，它滿(mǎn)足在自由活動(dòng)動(dòng)物中進(jìn)行高分辨率腦成像的需求。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明所提供的firm-tpm一優(yōu)選實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是圖1中的微型探頭安裝在小老鼠上的狀態(tài)示意圖。

圖3是圖1中的微型探頭的光路原理示意圖。

圖4是本發(fā)明所提供的飛秒脈沖激光調(diào)制器一優(yōu)選實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖5a是本發(fā)明利用圖1的微型雙光子顯微成像裝置的活體樣本行為成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖5b是圖5a中的數(shù)據(jù)收集組件和線路安裝組件的分解示意圖。

圖6是臺(tái)式tpm、微型寬場(chǎng)熒光顯微鏡和firm-tpm各項(xiàng)性能的集成平臺(tái)在臺(tái)式雙光子模式下的光路示意圖，該圖示意出了臺(tái)式tpm的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖7是圖6的集成平臺(tái)在寬場(chǎng)成像模式下的光路示意圖。

圖8是圖6的集成平臺(tái)在firm-tpm成像模式下的光路示意圖，該圖示意出了在圖6的臺(tái)式tpm中的物鏡與物面(活體樣本或活體樣本)之間的光路上設(shè)置有圖1的firm-tpm。

圖9a-9f是比較gcamp-6f在800nm、920nm和1030nm激發(fā)下的雙光子激發(fā)效率。

圖10a是定制設(shè)計(jì)的hc-920光纖的傳輸損耗和色散參數(shù)，其中，上方左側(cè)的插圖顯示了hc-920的截面照片，上方右側(cè)的插圖顯示了由hc-920射出并由具有3mm的焦距的雙合透鏡準(zhǔn)直之后的920nm激光的圖像。

圖10b是在不同激光功率下1米hc-920出口處920-nm飛秒激光脈沖寬度的自相關(guān)分布。

圖10c中，左側(cè)圖：mems掃描器的x(淺灰色)和y(黑色)軸的頻率響應(yīng)。右側(cè)板：機(jī)械傾斜角作為mems掃描器的x(黑色)和y(淺灰色)軸的驅(qū)動(dòng)電壓的函數(shù)。

圖11a-11d是圖4的飛秒脈沖激光調(diào)制器中色散補(bǔ)償說(shuō)明。

圖12a-12e是比較在頭部固定和自由移動(dòng)條件下在黑暗環(huán)境下活體樣本v-1皮質(zhì)中的樹(shù)突活性。

圖13a-13c是利用圖5中的活體樣本行為成像系統(tǒng)在不同的行為范例中活體樣本的成像視覺(jué)皮層活動(dòng)。

圖14a-14d是firm-tpm與臺(tái)式tpm、微型寬視場(chǎng)顯微鏡的性能比較。

具體實(shí)施方式

在附圖中，使用相同或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)表示相同或類(lèi)似的元件或具有相同或類(lèi)似功能的元件。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

在本發(fā)明的描述中，術(shù)語(yǔ)“中心”、“縱向”、“橫向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”“內(nèi)”、“外”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡(jiǎn)化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

如圖1所示，本實(shí)施例所提供的一種微型雙光子顯微成像裝置(英文全稱(chēng)為“fasthighresolutionminiaturetwophotonmicroscope”；下文均簡(jiǎn)稱(chēng)為“firm-tpm”)包括飛秒脈沖激光器、飛秒脈沖激光調(diào)制器1和微型探頭2，其中：

所述飛秒脈沖激光器用于產(chǎn)生波長(zhǎng)為920納米的激光。所述飛秒脈沖激光器在圖中并未示意出來(lái)，其可以使用相干公司變色龍固體激光器作為光源，中心波長(zhǎng)為920nm，輸出功率100±1mw。相比于現(xiàn)有的波長(zhǎng)為1030nm和800nm的激光，波長(zhǎng)為920納米的激光能夠有效地激發(fā)常用的生物指示劑(例如thy1-gfp和gcamp-6f，其中的gcamp是最普遍使用的鈣離子指示劑)產(chǎn)生熒光。下面是比較gcamp-6f分別在800nm、920nm和1030nm激光激發(fā)下的雙光子激發(fā)效率，利用可調(diào)諧的鈦寶石飛秒激光器(coherent，usa，vision-s，680-1080nm，85-110fs)中選擇不同波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)。

如圖9a-9f所示，圖9a是在不同激發(fā)波長(zhǎng)下在v-1皮質(zhì)中表達(dá)gcamp-6f的aav轉(zhuǎn)染活體樣本中成像相同組的神經(jīng)元胞體cell1、cell2和cell3，圖中從左至右依序分別是使用800nm、920nm和1030nm激光獲得的熒光圖像。圖9b是10個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞的ca²⁺信號(hào)的神經(jīng)元胞體的頻率。圖9c中的c是10個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞的ca²⁺信號(hào)的神經(jīng)元胞體的幅度，圖9c中的d是10個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞的ca²⁺信號(hào)的神經(jīng)元胞體的平均時(shí)程。圖9d如在圖9a中，在不同的焦平面成像神經(jīng)元樹(shù)突dendrite1、dendrite2和dendrite3，圖中從左至右依序分別是使用800nm、920nm和1030nm激光獲得的熒光圖像。圖9e是來(lái)自圖9d中所示的十個(gè)樹(shù)突ca²⁺信號(hào)的頻率。圖9f中的g是來(lái)自圖9d中所示的十個(gè)樹(shù)突ca²⁺信號(hào)的幅度，圖9f中的h是來(lái)自圖9d中所示的十個(gè)樹(shù)突ca²⁺信號(hào)的平均時(shí)程。從這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出：以800nm為中心的飛秒激光脈沖完全不能激發(fā)來(lái)自神經(jīng)元胞體或樹(shù)突的gcamp6信號(hào)，1030nm激發(fā)與920nm激發(fā)相比，僅能記錄到樹(shù)突鈣離子活性的1/10，同時(shí)所記錄的熒光信號(hào)的振幅顯著降低。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明使用波長(zhǎng)為920nm的激光可以更加有效地激發(fā)gcamp-6f產(chǎn)生熒光。

再次參閱圖1，飛秒脈沖激光調(diào)制器1用于接收所述飛秒脈沖激光器輸出的激光，并預(yù)啁啾補(bǔ)償激光的脈沖展寬至其預(yù)設(shè)值，并輸出。85fs、920nm為中心的激光脈沖，在經(jīng)由飛秒脈沖激光調(diào)制器1預(yù)啁啾補(bǔ)償之后，調(diào)制成大約為100fs的激光脈沖，傳輸功率可以從5mw到200mw(該數(shù)據(jù)是通過(guò)實(shí)驗(yàn)在激光輸入光纖11的出口處測(cè)量獲得)。

微型探頭2包括掃描成像部分和熒光輸出光纖21，其中：所述掃描成像部分用于接收飛秒脈沖激光調(diào)制器1輸出的激光，該激光對(duì)活體樣本內(nèi)部的組織進(jìn)行掃描，以激發(fā)所述活體樣本產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光輸出光纖21用于接收所述掃描成像部分輸出的所述熒光信號(hào)，并進(jìn)行輸出。

如圖1和圖2所示，熒光輸出光纖21選擇的是一種新型的柔性光纖束(sfb)，本實(shí)施方式中的熒光輸出光纖21由700-900根玻璃光纖熔接而成，同時(shí)，保持各玻璃光纖松散并在兩者之間分開(kāi)，這樣便于由自由活動(dòng)的活體樣本攜帶并減少運(yùn)動(dòng)偽影的輕質(zhì)顯微鏡探頭，進(jìn)而最小化動(dòng)物運(yùn)動(dòng)引起的扭矩和張力，而不降低光子收集效率。所有的玻璃光纖熔接的兩個(gè)端部呈1.5mm直徑的圓柱體，以方便安裝在微型探頭2上。下表1是本實(shí)施例中的熒光輸出光纖21的性能參數(shù)，其與多模光纖相比具有更高的收集效率，并且比之前使用的塑料光纖和傳統(tǒng)的融合型光纖束更靈活，能夠進(jìn)行多波長(zhǎng)發(fā)射檢測(cè)。熒光輸出光纖21將來(lái)自微型探頭2中的物鏡的熒光信號(hào)傳遞到遠(yuǎn)端的gaasppmt(10770p-40，hamamatsu，日本)中，其總收集效率在532nm處為大約80％。

表1

如圖2所示，微型探頭2中集成在固定支架28上。通過(guò)固定支架28，微型探頭2以可拆卸的方式(螺釘連接)安裝在活體樣本(如圖2中示出的小老鼠等活體樣本)的頭上。微型探頭2和固定支架28的總重量大約位2.15g，體積不超過(guò)1cm³，系統(tǒng)足夠小而緊湊和足夠輕以便活體樣本攜帶。固定支架28采用鋁材料制成，比如鋁框架。固定支架28的形狀可以設(shè)計(jì)成一個(gè)頭盔形狀，這樣易于安裝和拆卸，主要是可以穩(wěn)固地將微型探頭2安裝在自由活動(dòng)的活體樣本的頭部，因此有利于在同一個(gè)動(dòng)物中進(jìn)行數(shù)小時(shí)成像，并保持微型雙光子顯微成像裝置的視場(chǎng)(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“fov”)在存在強(qiáng)烈的身體和頭部運(yùn)動(dòng)的情況下不產(chǎn)生漂移。除此之外，利用本發(fā)明進(jìn)行成像之前，會(huì)預(yù)先訓(xùn)練活體樣本適應(yīng)安裝在其頭骨上的微型探頭2，并滴加1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖使其充滿(mǎn)在微型探頭2的物鏡和活體樣本的腦組織之間，這些操作都顯著降低了微型探頭2與大腦之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)，這些措施改善了實(shí)驗(yàn)短期和長(zhǎng)期的穩(wěn)定性，允許在動(dòng)物進(jìn)行包含大量身體和頭部自由活動(dòng)的行為檢測(cè)中進(jìn)行高分辨率成像。

在一個(gè)實(shí)施例中，如圖4所示，飛秒脈沖激光調(diào)制器1具有負(fù)色散光路和正色散光路，其中：所述負(fù)色散光路包括激光輸入光纖11，激光輸入光纖11用于將脈沖展寬預(yù)啁啾補(bǔ)償好的激光傳輸給所述掃描成像部分。所述正色散光路位于所述飛秒脈沖激光器和所述負(fù)色散光路之間，用于補(bǔ)償由所述激光輸入光纖11在傳輸激光過(guò)程中引起的負(fù)色散。

由于材料色散和非線性效應(yīng)，單模光纖會(huì)將飛秒激光脈沖展寬。而本實(shí)施例中使用的激光輸入光纖11為空心光子晶體光纖(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為“hc-pcf”)，即圖中或文中出現(xiàn)的hc-920，其中大多數(shù)激光傳播是通過(guò)hc-920中間的充氣芯，這有效地最小化了由于非線性效應(yīng)產(chǎn)生的脈沖展寬。本實(shí)施例的激光輸入光纖11用于傳輸數(shù)百毫瓦的920納米飛秒激光脈沖，其非線性脈沖展寬可忽略不計(jì)(圖10a和表2)。

表2

本實(shí)施例的激光輸入光纖11為920納米飛秒激光脈沖提供了無(wú)畸變傳輸，這種改進(jìn)讓有效激發(fā)常用的生物指示劑成為可能，例如thy1-gfp和gcamp-6f。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述正色散光路包括色散補(bǔ)償元件12和聲光調(diào)制器13，其中：聲光調(diào)制器13用于接收經(jīng)由色散補(bǔ)償元件12補(bǔ)償后的激光，并調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度，然后輸出給所述掃描成像部分。聲光調(diào)制器13可以采用現(xiàn)有產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)。

色散補(bǔ)償元件12臨近所述飛秒脈沖激光器設(shè)置，用于補(bǔ)償由激光輸入光纖11在傳輸激光過(guò)程中引起的負(fù)色散。

激光輸入光纖11中的負(fù)色散相對(duì)較低，色散補(bǔ)償元件12只要使用具有特定長(zhǎng)度的正色散的商業(yè)玻璃材料通過(guò)預(yù)啁啾方法就可以精確地補(bǔ)償。在預(yù)啁啾補(bǔ)償之后，85fs、920nm為中心的激光脈沖經(jīng)過(guò)1m長(zhǎng)的激光輸入光纖11傳輸后變成大約為100fs的脈沖，傳輸功率可以從5mw到200mw(該數(shù)據(jù)是通過(guò)實(shí)驗(yàn)在激光輸入光纖11的出口處測(cè)量獲得)(圖10b)。

優(yōu)選地，色散補(bǔ)償元件12采用的是h-zf62玻璃管，其在920nm波長(zhǎng)的激光中具有458ps/nm/km的正色散。其中：圖11a是使用h-zf62玻璃管補(bǔ)償hc-920色散示意圖；圖11b是玻璃h-zf62的色散參數(shù)；圖11c是從沒(méi)有色散補(bǔ)償?shù)?米的hc-920輸出的920nm飛秒激光的脈沖寬度；圖11d是在具有和沒(méi)有色散補(bǔ)償?shù)?米的hc-920之前和之后的920nm飛秒激光器的脈沖寬度。

下面是對(duì)飛秒脈沖激光調(diào)制器1實(shí)現(xiàn)對(duì)85fs、920nm為中心的激光脈沖預(yù)啁啾補(bǔ)償之后，變成大約為100fs的激光脈沖，傳輸功率可以從5mw到200mw的詳細(xì)說(shuō)明。

在超快激光脈沖的傳輸期間，兩個(gè)因素有導(dǎo)致脈沖展寬：材料的色散以及高激光峰值功率的非線性效應(yīng)。在激光輸入光纖11中，大多數(shù)激光傳播通過(guò)空氣芯，因此非線性效應(yīng)最小。在微型探頭2的光路中，諸如透鏡和反射鏡的光學(xué)部件的中心處的光密度相對(duì)較低，因?yàn)楣馐叽巛^大(直徑為不超過(guò)2mm)，因此幾乎不引起非線性。由于顯微鏡的前部件和樣本中的微型部件的長(zhǎng)度相對(duì)較短，因此也可忽略。因此，主要的擴(kuò)展效應(yīng)起源于由臺(tái)式光學(xué)器件和激光輸入光纖引起的材料色散。通過(guò)簡(jiǎn)化，在本實(shí)施方式的系統(tǒng)中僅考慮二階色散。因此，整個(gè)系統(tǒng)的脈沖展寬為：

bsystem＝|∑n{ln∫λ,δλdn(λ)dλ}|(1.1)

其中：n表示系統(tǒng)中的光學(xué)器件的數(shù)量；dn(λ)由第n個(gè)分量(光學(xué)器件)引起的色散參數(shù)；ln表示第n分量(光學(xué)器件)的光路長(zhǎng)度；λ和δλ是激光的中心波長(zhǎng)和光譜寬度；||表示來(lái)自透鏡的正色散(負(fù)d(λ))和來(lái)自激光輸入光纖異常色散(正d(λ))總和的絕對(duì)值。因此，當(dāng)δλ<<λ，在本發(fā)明的系統(tǒng)中(λ＝920nm，δλ不超過(guò)15nm)，方程簡(jiǎn)化為：

bsystem＝|∑n{ln·dn(λ)·δλ}|(1.2)

最終脈沖寬度表示為：

poutput＝pinput+|bsystem|(1.3)

其中pinput和poutput表示激光器的輸入和輸出脈沖寬度。

在本實(shí)施例提供的系統(tǒng)中使用的hc-920的長(zhǎng)度為1m(lhc-920)，由制造商測(cè)量并在圖10a中示出。因此，hc-920的擴(kuò)展是：

lhc-920·dhc-920(920nm)·δλ～1(m)·75(ps/nm/km)·15(nm)＝1.125(ps)

容易確定諸如偏振分束器、透鏡和聲光調(diào)制器的長(zhǎng)度，并且通過(guò)它們使用的鏡片折射率信息來(lái)計(jì)算，其表示為：

和

其中，gvd表示介質(zhì)中群速度色散，c是光速，n是介質(zhì)的折射率。

加在一起，這些分量引起約-200fs的展寬，因此從85fs變換限制脈沖的hc-920輸出的計(jì)算脈沖寬度約為：

(0.085+1.125-0.2)(ps)＝1.01(ps)

其與實(shí)驗(yàn)測(cè)量的脈沖寬度(不超過(guò)1ps)(圖11c)匹配，并且對(duì)于有效的雙光子激發(fā)太弱。通過(guò)將h-zf62玻璃管(本實(shí)施例中的色散補(bǔ)償元件12均采用h-zf62玻璃管)插入具有正色散的光路中，本實(shí)施例預(yù)補(bǔ)償了由hc-920引起的負(fù)色散。本實(shí)施例選擇h-zf62玻璃管，因?yàn)樗哂写蟮恼?在波長(zhǎng)為920nm中的色散大約為58ps/nm/km)，由scott公司提供的折射率信息和等式(1.4)計(jì)算，如圖11b所示)。所需的h-zf62玻璃管的長(zhǎng)度計(jì)算如下：

(1.125-0.2)(ps)/458(ps/nm/km)/15(nm)＝13.5(cm)

考慮到由顯微鏡前端和樣品引起的小的正色散，本實(shí)施例使用一個(gè)12厘米長(zhǎng)、12.7毫米直徑的h-zf62玻璃管，小于計(jì)算值。在h-zf62玻璃管(圖11b和圖6)的這種“預(yù)線性調(diào)頻”之后，來(lái)自hc-920的激光脈沖寬度在測(cè)試照明功率的整個(gè)范圍內(nèi)被壓縮到大約為100fs(圖11d和圖10b)。本實(shí)施例的firm-tpm通過(guò)使用自行設(shè)計(jì)的hc-pcf來(lái)傳輸具有可忽略的非線性脈沖展寬的920納米飛秒激光脈沖(名為hc-920)，能夠?qū)嶒?yàn)對(duì)常用的生物指示劑進(jìn)行成像，并取得了和臺(tái)式tpm相當(dāng)?shù)男阅堋?/p>

在一個(gè)實(shí)施例中，所述正色散光路還包括激光方位調(diào)整組件，所述激光方位調(diào)整組件設(shè)置在色散補(bǔ)償元件12與聲光調(diào)制器13之間，所述激光方位調(diào)整組件包括第一半波片14、第一反射鏡15和第二反射鏡16，其中：

第一半波片14用于接收經(jīng)由色散補(bǔ)償元件12補(bǔ)償后的激光，并調(diào)整激光偏振方向，以使得聲光調(diào)制器13的調(diào)制效率最高。第一反射鏡15用于接收經(jīng)由第一半波片14的激光，并反射激光，以調(diào)整激光射入聲光調(diào)制器13的位置。第二反射鏡16用于接收經(jīng)由第一反射鏡15的激光，并反射激光，以調(diào)整激光射入聲光調(diào)制器13的角度，并傳輸給聲光調(diào)制器13。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述正色散光路還包括分光組件，所述分光組件臨近激光輸入光纖11設(shè)置，用于接收經(jīng)由聲光調(diào)制器13調(diào)節(jié)好強(qiáng)度的激光以及將該激光分成至少兩束，并傳輸給激光輸入光纖11。

在一個(gè)實(shí)施例中，激光輸入光纖11的數(shù)量至少為兩根，包括第一激光輸入光纖和第二激光輸入光纖。

所述分光組件包括偏振分束器17、第二半波片18、第三反射鏡19、第一準(zhǔn)直透鏡110、第三半波片111、第四反射鏡112、第二準(zhǔn)直透鏡113和第四半波片114，其中：

偏振分束器17用于接收經(jīng)由聲光調(diào)制器13調(diào)節(jié)好強(qiáng)度的激光以及將該激光分成至少兩束，分別傳輸給所述第一激光輸入光纖和第二激光輸入光纖。第二半波片18布置在偏振分束器17和聲光調(diào)制器13之間，用于改變偏振分束器17的分光比。第三反射鏡19布置在偏振分束器17和第二半波片18之間，用于反射激光，以調(diào)整激光的位置并投射到所述偏振分束器17的入射面上。第一準(zhǔn)直透鏡110布置在偏振分束器17的第一出射面與第一激光輸入光纖11之間，用于接收偏振分束器17輸出的激光以及將激光耦合進(jìn)第一激光輸入光纖11。第三半波片111布置在偏振分束器17的第一出射面與第一準(zhǔn)直透鏡110之間，用于接收偏振分束器17輸出的激光，并調(diào)整激光偏振方向，使得激光耦合進(jìn)第一激光輸入光纖11的效率最高。第四反射鏡112布置在偏振分束器17的第二出射面與所述第二激光輸入光纖之間，用于接收偏振分束器17輸出的激光，用于反射激光，以調(diào)整激光的位置并投射到所述第二激光輸入光纖中。第二準(zhǔn)直透鏡113布置在第四反射鏡112與第二激光輸入光纖之間，用于接收偏振分束器17輸出的激光以及將激光耦合進(jìn)所述第二激光輸入光纖。第四半波片114布置在第四反射鏡112與第二準(zhǔn)直透鏡113之間，用于接收第四反射鏡112反射的激光，并調(diào)整激光偏振方向，使得激光耦合進(jìn)所述第二激光輸入光纖的效率最高。

如圖1和圖3所示，在一個(gè)實(shí)施例中，所述掃描成像部分包括微機(jī)電掃描儀22、物鏡23、掃描透鏡24、準(zhǔn)直器25、雙色鏡26和采集透鏡27，其中：

微機(jī)電掃描儀22(mems)用于通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)改變激光入射角角度的方式將激光對(duì)所述活體樣本內(nèi)部的組織平面進(jìn)行二維掃描。優(yōu)選地，微機(jī)電掃描儀22的直徑為0.8mm，封裝尺寸為9×9mm²，第一諧振頻率為不超過(guò)6khz，其最大光學(xué)掃描角度為±10度,支持幀大小為256×256和最大視場(chǎng)為130×130μm²的40hz成像,以實(shí)現(xiàn)視頻速率圖像采集。與其它掃描方式相比，例如使用壓電致動(dòng)器的螺旋或lissajous圖案的光纖掃描相比，本實(shí)施例提供的微機(jī)電掃描儀22掃描對(duì)于其在整個(gè)視場(chǎng)上的高速，均勻激發(fā)和大掃描角、大視野都是有利的。微機(jī)電掃描儀22掃描過(guò)程中的x和y控制信號(hào)由fpga(現(xiàn)場(chǎng)可編程門(mén)陣列)卡(pxi-7853r)生成，該卡也用于驅(qū)動(dòng)聲光調(diào)制器以調(diào)整激光強(qiáng)度和觸發(fā)其它器件(例如，紅外攝像機(jī)采集)。來(lái)自光電檢測(cè)器(h10770p-40，hamamatsujapan)的信號(hào)通過(guò)高速前置放大器(dhpca-100，femtogmbh，berlin，germany)放大，然后連接到120ms/s數(shù)字轉(zhuǎn)換器適配器模塊(ni5734，nationalinstrumentsinc.，austin，tx，usa)和flexriofpga(pxie-7961r，nationalinstrumentsinc.，austin，tx，usa)，用于高速數(shù)據(jù)采集。整個(gè)系統(tǒng)由基于labview平臺(tái)的定制開(kāi)發(fā)軟件控制。

物鏡23用于將來(lái)自微機(jī)電掃描儀22的激光會(huì)聚到所述活體樣本內(nèi)部，以激發(fā)所述活體樣本產(chǎn)生所述熒光信號(hào)以及用于輸出所述熒光信號(hào)。優(yōu)選地，物鏡23的數(shù)值孔徑(下文均簡(jiǎn)稱(chēng)為“na”)為0.8，na較高，光學(xué)層切較薄，這有利于實(shí)現(xiàn)亞微米成像分辨率，進(jìn)而能夠在自由活動(dòng)的樣本中分辨出樹(shù)突和樹(shù)突棘的結(jié)構(gòu)和功能變化。

本實(shí)施例中，物鏡23使用的是grintechgmbh(jena，germany)的高分辨率水浸小型物鏡(gt-mo-080-018-ac900-450)，這是用4.76×的放大率，0.80的物方na和0.173的像方na進(jìn)行有限校正。物鏡23的長(zhǎng)度為6mm長(zhǎng)，直徑是1.4mm，并且具有200μm的工作距離。物鏡23具體包括薄菲涅耳透鏡231、平凸透鏡232、中繼透鏡233和聚焦透鏡234，其中，薄菲涅耳透鏡231和平凸透鏡232都是微型漸變折射率(grin)透鏡。與現(xiàn)有技術(shù)中使用的物鏡相比，本實(shí)施例入射到物鏡23中的衍射分量(菲涅爾透鏡)有效地校正了雙光子成像期間激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的大色差，這會(huì)使得更好的光束聚焦質(zhì)量，且改善信號(hào)收集效率，從而有利于實(shí)現(xiàn)亞微米成像分辨率，進(jìn)而為能夠在自由活動(dòng)的樣本中分辨出樹(shù)突和樹(shù)突棘的結(jié)構(gòu)和功能變化提供有利條件。

掃描透鏡24布置在微機(jī)電掃描儀22和物鏡23之間的光路上，用于將微機(jī)電掃描儀22二維掃描所產(chǎn)生的角度變化的激光轉(zhuǎn)化成位置變化的激光。掃描透鏡24使用非球面透鏡(#355160b，lightpathtechnologies，orlando，fl，usa；直徑：3mm；等效焦距：2.7mm)作為掃描透鏡，以減少球面像差。

準(zhǔn)直器25布置在激光輸入光纖11與微機(jī)電掃描儀22之間，用于準(zhǔn)直來(lái)自激光輸入光纖11輸出的激光以及減少不同頻率激光之間的色差，以與掃描透鏡24共同匹配物鏡23的圖像na。本實(shí)施例的準(zhǔn)直器25使用的是消色差準(zhǔn)直透鏡(#65-286，edmundopticsinc.，barrington，nj，usa；直徑：2mm，等效焦距：3mm，專(zhuān)用近紅外光)，能夠準(zhǔn)直輸出激光器并減少飛秒激光器的不同頻率分量之間的色差，這樣有利于提高傳輸效率(從激光源到樣本高達(dá)50％)，光束聚焦和激發(fā)效率。

雙色鏡26設(shè)在掃描透鏡24和物鏡23之間，用于將激光和熒光信號(hào)分開(kāi)以及輸出所述熒光信號(hào)。雙色鏡26采用的是中國(guó)福建sunlight有限公司生產(chǎn)制造的產(chǎn)品，尺寸3×3×0.2mm³，反射帶是750-1100nm，透射帶是400-650nm，以將來(lái)自?huà)呙柰哥R24的激光束反射到物鏡23。采集透鏡27用于有效收集熒光信號(hào)。

本發(fā)明使用光學(xué)設(shè)計(jì)軟件(zemax)來(lái)模擬和優(yōu)化所有光學(xué)元件和它們之間的距離，并使用商業(yè)cad軟件(solidworks)進(jìn)行幾何設(shè)計(jì)。

本發(fā)明提供的微型探頭2的分辨率的具體計(jì)算過(guò)程如下：

首先，有效激發(fā)na(naex)由激發(fā)的整個(gè)光路確定。準(zhǔn)直器25之后的激光束的直徑d1為：

d1＝2·nahc-920·eflc(2.1)

其中，nahc-920是hc-920的na(大約為0.15)和eflc準(zhǔn)直器25的等效焦距(3mm)。

因?yàn)榧す馐闹睆絛1(0.9mm)大于微機(jī)電掃描儀22的尺寸(對(duì)于x方向?yàn)?.8mm，對(duì)于y方向?yàn)榇蠹s為0.6mm)，考慮到微機(jī)電掃描儀22的傾斜度受到其尺寸的限制并由下式給出：

naex＝(1/2·dm/efls)·nao/nai(2.2)

其中，efls是掃描透鏡24的等效焦距(2.7mm)。nao,nai分別表示物鏡的na和圖像na，分別為0.8和0.173。

然后，由微機(jī)電掃描儀22的x方向決定的最大激發(fā)na為：

naex＝(1/2·0.8/2.7)·0.8/0.173～0.685

使用參考文獻(xiàn)2中的方程計(jì)算雙光子激發(fā)(ipsf²)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的衍射極限橫向(ωxy)和軸向(ωz)1/e半徑，本實(shí)施例有：

其中，浸沒(méi)介質(zhì)(生理鹽水)的折射率不超過(guò)1.34，激光的波長(zhǎng)為920nm。anaex為0.685，ωxy＝0.304μm和ωz＝1.840μm。

分辨率通常定義為psf²的半高寬(fwhm)，本實(shí)施例有：

利用嵌入瓊脂糖中的100nm熒光珠的圖像測(cè)量得到：本發(fā)明提供的微型雙光子顯微成像裝置的橫向分辨率為0.64±0.02μm，軸向分辨率為3.35±0.36μm。

在上述實(shí)施例中,測(cè)試本發(fā)明的分辨率時(shí)制作實(shí)驗(yàn)樣本的方法為：首先將2μl的tetraspeck100-nm熒光珠(t7270，lifetechnologies，oregonusa)稀釋到100μl生理鹽水中，然后與900μl1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖混合。再將含有微球熒光珠(4μm)的瓊脂糖小滴加到蓋玻片上，10分鐘后備用。等效橫向像素尺寸為61nm，軸向掃描間隔為80nm，兩者均大于奈奎斯特采樣定理要求的5倍以上，進(jìn)而足以測(cè)量顯微鏡的真實(shí)光學(xué)分辨率。

表3是本發(fā)明提供的firm-tpm與現(xiàn)有技術(shù)中mtpm的分辨率的對(duì)比表，第2列是本發(fā)明提供的firm-tpm的分辨率及其參數(shù)說(shuō)明，第3-6列是現(xiàn)有技術(shù)中mtpm的分辨率及其參數(shù)說(shuō)明。需要說(shuō)明的是：表3中的*:數(shù)據(jù)來(lái)自文獻(xiàn)。從現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明：現(xiàn)有技術(shù)中mtpm盡管在動(dòng)物的體外得到了較高的空間分辨率，但是，大多數(shù)mtpm在動(dòng)物的體內(nèi)表現(xiàn)不佳，并未能得到高信噪比(snr)的熒光圖像。從表3中的對(duì)比分析可以得出：本發(fā)明提供的firm-tpm的分辨率大約為現(xiàn)有技術(shù)中的mtpm的最高分辨率的兩倍，這種高分辨率為解決自由活動(dòng)動(dòng)物中單個(gè)樹(shù)突棘的成像問(wèn)題提供了有利條件。

表3

為了在同一基準(zhǔn)上測(cè)試和比較現(xiàn)有技術(shù)中的臺(tái)式tpm和微型寬場(chǎng)顯微鏡與firm-tpm之間的性能差異，本實(shí)施例建立了一個(gè)集成平臺(tái)，允許在同一樣品上進(jìn)行臺(tái)式tpm模式(圖6)、寬場(chǎng)成像模式(圖7)和firm-tpm成像模式(圖8)之間的切換。如圖6-8所示，該集成平臺(tái)配備有微型和常規(guī)物鏡、多個(gè)照明源(用于tpm的激光器和用于寬場(chǎng)的高功率汞燈)和檢測(cè)裝置(用于tpm的gaasp和用于寬場(chǎng)的scmos相機(jī))。不同的成像模式具有相同的焦平面和同心視場(chǎng)、總幀采集時(shí)間和成像na，而平均照明功率和檢測(cè)器靈敏度也進(jìn)行了仔細(xì)選擇和匹配，下面結(jié)合圖6至圖8說(shuō)明上述集成平臺(tái)的組成。

上述集成平臺(tái)分別在臺(tái)式tpm模式、寬場(chǎng)成像模式和firm-tpm成像模式下對(duì)同一標(biāo)本的同一焦平面進(jìn)行成像。激光(chameleonvision-s，coherent，usa；中心波長(zhǎng)：920nm)，通過(guò)h-zf62玻璃管，隨后用聲光調(diào)制器(mt110-b50a1.5-ir-hk，aasa，orsaycede，france)。然后將中心波長(zhǎng)為920nm的激光分成兩束，一束耦合到在firm-tpm中使用的一根hc-920中，另一束耦合到在臺(tái)式tpm中使用的另一根hc-920中。

如圖6所示，在臺(tái)式tpm模式中，來(lái)自hc-920的準(zhǔn)直激光器由一對(duì)檢流計(jì)計(jì)掃描鏡a1(6215h，cambridgetechnology，ma，usa)掃描，然后通過(guò)掃描透鏡a2(lms05-bb，thorlabsinc，newjersey)、管透鏡a3(olympusjapan)和第一二向色鏡a4(dm1，dmlp650r，thorlabsinc，newjersey，usa)，然后最終傳送到物鏡a5的后焦平面(bfp)(cfiapo40xwnir，nikon，japan；40×na0.8，工作距離：3.5mm)。來(lái)自物鏡a5的熒光發(fā)射信號(hào)由第一二向色鏡a4反射，通過(guò)收集透鏡a6(la1213-a，thorlabsinc，newjersey，usa)、第二分色鏡a7(dm2，#87-284，edmundopticsinc.，barrington，usa，反射帶：375-393,466-490和546-565nm；透射帶：420-460,510-531,590-624和677-725nm)，通過(guò)聚光透鏡a8(acl25416u-a，thorlabsinc，newjersey，usa)，最后用光電倍增管a9(gaasppmt7422p-40，hamamatsu，japan)檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)與firm-tpm(0.685)相同的激發(fā)na，將物鏡a5的后焦平面(bfp)處的激發(fā)激光束的光束尺寸設(shè)置為：

(2×0.685×200)(mm)/40＝6.85(mm)

其中，200mm是用于該物鏡a5的匹配管透鏡a3的efl，40是物鏡a5的放大率。

如圖7和圖8所示，在寬場(chǎng)成像模式和firm-tpm成像模式中，將本發(fā)明提供的微型探頭2連接到定制的微小三軸手動(dòng)顯微操作器(sigmakoki，tokyo，japan)上，微型探頭2中物鏡像平面是空氣物鏡(planaponir5x，mitutoyo，japan；5×，na為0.14，工作距離為37.5mm)的焦平面。使用具有高精度的雙向重復(fù)性(±2.5μm)的4端口物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)(ot1，thorlabsinc，newjersey，usa)在微型探頭2和40×尼康物鏡之間切換。通過(guò)調(diào)整尼康物鏡和微型探頭2之前的鏡頭鏡筒的螺紋，本發(fā)明可以設(shè)置微型探頭2和尼康物鏡具有相同的焦平面。

如圖7所示，在微型寬視場(chǎng)熒光結(jié)構(gòu)中，使用具有藍(lán)光濾光器(mf475-35，thorlabsinc，newjersey，usa；中心波長(zhǎng)為475nm，帶寬為40nm)的熒光照明器(x-cite120q，excelitastechnologies，ma，usa)：35nm)作為光源b1。將臺(tái)式tpm構(gòu)造中的第一二向色鏡a4改變?yōu)榉稚Rb2(dm3，#87-284，edmundopticsinc.，barrington，nj，usa；反射帶：375-393,466-490和546-565nm；透射帶包括：420-460,510-531,590-624和677-725nm),以將照明光反射到微型探頭2,并將來(lái)自微型探頭2的熒光發(fā)射信號(hào)傳輸?shù)娇茖W(xué)cmos照相機(jī)b3(8050m-ge，thorlabsinc，newjersey，usa)。在臺(tái)式tpm和firm-tpm配置中的成像在目標(biāo)之后使用類(lèi)似的平均功率，通常為10-25mw。由于單光子和雙光子激發(fā)的吸收截面的差異，單光子成像中使用的平均功率通常比雙光子成像中的平均功率低得多。因此，本發(fā)明在寬場(chǎng)熒光顯微鏡配置中使用100-500μw照明(在微型物鏡之后)，類(lèi)似于之前報(bào)告中使用的170-600μw照度。

圖14a的左側(cè)圖像是thy1-gfp轉(zhuǎn)基因活體樣本腦的神經(jīng)元樹(shù)突和樹(shù)突棘的3d形態(tài)成像，在1s的總曝光(firm-tpm和微型寬視場(chǎng)顯微鏡的8hz的8幀的平均值，以及臺(tái)式tpm的2hz的2幀的平均值)下獲得大致相同焦平面處的圖像，圖14a的右側(cè)曲線是左側(cè)圖像中所示的裁剪區(qū)域中兩對(duì)相鄰樹(shù)突棘的橫截面輪廓。圖14b是在表達(dá)gcamp6f的活體樣本的pfc中富含神經(jīng)元胞體的平面(-130μm)的圖像，上部圖片：相同roi的30秒平均圖像。微型寬場(chǎng)圖像顯示為歸一化的δf/f(參見(jiàn)在線方法)；下部波浪線：三個(gè)選擇的神經(jīng)元中ca²⁺的時(shí)程變化(持續(xù)時(shí)間：100秒)(在上圖中用數(shù)字標(biāo)記)。圖14c的左側(cè)圖像是來(lái)自于(圖14b)中相同活體樣本的樹(shù)突和棘突(焦平面-120μm)的ca²⁺信號(hào)，由于缺乏可辨別的樹(shù)突信號(hào)，未示出用微型寬視場(chǎng)顯微鏡記錄的圖像，圖14c的右側(cè)上部圖像用臺(tái)式tpm捕獲的一個(gè)帶樹(shù)突軸(d1)和樹(shù)突棘(s1，s2，s3)的成像和ca²⁺信號(hào)(持續(xù)時(shí)間：100s)，圖12c的右側(cè)下部圖像是用firm捕獲的一個(gè)帶樹(shù)突軸(d1)和樹(shù)突棘(s1，s2，s3)(左)的成像和ca²⁺信號(hào)(持續(xù)時(shí)間：100s)。圖12d是在不同配置中成像的ca2+信號(hào)的平均頻率和幅度，來(lái)自相同組的神經(jīng)元胞體(n＝4)，統(tǒng)計(jì)：樹(shù)突(n＝8)和樹(shù)突棘(n＝6)的數(shù)據(jù)。

對(duì)于形態(tài)學(xué)成像，本發(fā)明在thy1-gfp轉(zhuǎn)基因活體樣本的固定腦中的v1區(qū)域(130×130μm²，從表面到60μm以下)進(jìn)行成像，獲取3d的圖像數(shù)據(jù)(圖14a)。firm-tpm和臺(tái)式tpm在樹(shù)突成像中表現(xiàn)出相同的對(duì)比度和分辨率(圖14a)。然而，在微型寬場(chǎng)成像模式下，基本上不能分辨結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，主要是因?yàn)閬?lái)自焦外組織的強(qiáng)背景信號(hào)。在功能成像的比較中，本發(fā)明利用腺相關(guān)病毒感染的方式在活體樣本前額皮層神經(jīng)元中表示ca²⁺指標(biāo)劑gcamp6f，并在頭部固定的清醒活體樣本上進(jìn)行鈣成像(圖14b-圖14d)。選擇兩個(gè)焦平面以顯現(xiàn)來(lái)自胞體(表面以下130μm)或樹(shù)突和樹(shù)突棘(表面以下120μm)的活動(dòng)。在圖像歸一化和對(duì)比增強(qiáng)(δf/f)之后，微型寬場(chǎng)成像以相似的頻率分辨體細(xì)胞ca²⁺信號(hào)，而它們的幅度(δf/f為5-10％)比用臺(tái)式tpm或firm-tpm(δf/f大約為150％)測(cè)量的幅度低約一個(gè)數(shù)量級(jí)(圖14d)。值得注意的是，大多數(shù)源自樹(shù)突結(jié)構(gòu)的ca²⁺信號(hào)在這種成像配置中未被檢測(cè)到(圖14b和圖14d)。總之，這些基準(zhǔn)的測(cè)試證明本發(fā)明的firm-tpm達(dá)到與臺(tái)式tpm相同的性能，同時(shí)在分辨清醒動(dòng)物中樹(shù)突和樹(shù)突棘的結(jié)構(gòu)和功能活性方面優(yōu)于微型寬場(chǎng)顯微鏡。

在firm-tpm中使用的快速微機(jī)電掃描儀22比在高速臺(tái)式tpm中使用的共振掃描器具有更加線性的電壓-傾斜響應(yīng)和可控性。因此其賦予其成像更大的靈活性，使得在單個(gè)系統(tǒng)種可以實(shí)現(xiàn)快速柵格式掃描成像、任意指定的區(qū)域(roi)的隨機(jī)掃描成像和超快線掃描成像。特別是128hz的隨機(jī)掃描成像有助于分辨ca²⁺信號(hào)時(shí)間上的超微結(jié)構(gòu)，并且可以賦予mtpm在自由活動(dòng)的動(dòng)物中進(jìn)行精確光遺傳學(xué)操作的能力。10khz線掃描成像能力對(duì)于利用基因編碼的電壓指示劑來(lái)快速觀測(cè)動(dòng)作電位至關(guān)重要。

樹(shù)突棘活動(dòng)是神經(jīng)元信息處理的基本事件，利用臺(tái)式tpms在頭固定的動(dòng)物上的研究表明單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的不同樹(shù)突棘可以被不同朝向的視覺(jué)刺激或不同強(qiáng)度頻率的聲音刺激所激活。雖然通過(guò)微型寬場(chǎng)顯微鏡獲得的數(shù)百個(gè)神經(jīng)元的整體活動(dòng)可以幫助探測(cè)在不同行為條件下的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)編碼特性，本發(fā)明的firm-tpm提供了一個(gè)可供選擇的更加強(qiáng)大的工具，在頭固定動(dòng)物上不能實(shí)現(xiàn)的行為范式中對(duì)更加基本的神經(jīng)編碼單位的時(shí)空特性進(jìn)行觀測(cè)。

總之，新開(kāi)發(fā)的firm-tpm已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了高時(shí)空分辨率，良好的機(jī)械穩(wěn)定性，以及對(duì)應(yīng)用范圍最廣的指示劑的有效激發(fā)。通過(guò)使用新一代的mtpm，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在自由活動(dòng)的動(dòng)物中單突觸水平的長(zhǎng)時(shí)間成像這一科學(xué)家夢(mèng)寐以求的目標(biāo)?？梢灶A(yù)見(jiàn)未來(lái)會(huì)有更多的改進(jìn)和擴(kuò)展。使用正確設(shè)計(jì)的微型高na物鏡，可以進(jìn)一步擴(kuò)展fov和穿透深度。深腦成像可以通過(guò)直接將微型物鏡插入腦中，或通過(guò)在大腦中嵌入grin透鏡來(lái)實(shí)現(xiàn)，類(lèi)似于以前報(bào)告的方法。對(duì)于較大的動(dòng)物，例如大鼠或狨猴，可以在頭骨上安裝多個(gè)firm-tpm，以探索大腦中遠(yuǎn)程結(jié)構(gòu)和功能連接的相關(guān)問(wèn)題。本發(fā)明預(yù)計(jì)，firm-tpm將被證明是神經(jīng)科學(xué)家以及生物醫(yī)學(xué)科學(xué)家在動(dòng)物體內(nèi)探索健康和疾病機(jī)制的重要工具。

如圖5a所示，本發(fā)明還提供一種活體樣本行為成像系統(tǒng)，所述活體樣本行為成像系統(tǒng)包括箱體3、飛秒脈沖激光器、飛秒脈沖激光調(diào)制器1、微型探頭2、數(shù)據(jù)收集組件7和線路安裝組件，其中：

飛秒脈沖激光器用于產(chǎn)生波長(zhǎng)為920納米的激光。飛秒脈沖激光調(diào)制器1用于接收所述飛秒脈沖激光器輸出的激光，并預(yù)啁啾補(bǔ)償激光的脈沖展寬至預(yù)設(shè)值，該預(yù)設(shè)值優(yōu)選不超過(guò)100fs，并輸出。微型探頭2用于安裝在活體樣本身上，且輸入端通過(guò)所述飛秒脈沖激光調(diào)制器中的激光輸入光纖連接所述飛秒脈沖激光器的輸出端，用于接收所述飛秒脈沖激光調(diào)制器輸出的激光，該激光對(duì)活體樣本內(nèi)部的組織進(jìn)行掃描，以激發(fā)所述活體樣本產(chǎn)生熒光信號(hào)；以及用于接收所述掃描成像部分輸出的所述熒光信號(hào)，并進(jìn)行輸出。飛秒脈沖激光器、飛秒脈沖激光調(diào)制器1和微型探頭2在上文均已經(jīng)詳細(xì)介紹，此處不再贅述。

箱體3為活體活體樣本的自由移動(dòng)提供限定空間，該限定空間相比于活體樣本的體型要大很多，可以為活體樣本的自由活動(dòng)提供足夠大的空間。數(shù)據(jù)收集組件7安裝在箱體3上，數(shù)據(jù)收集組件7的輸入端通過(guò)熒光輸出光纖21連接微型探頭2的輸出端，用于收集微型探頭2輸出的所述熒光信號(hào)。激光輸入光纖11和熒光輸出光纖21通過(guò)所述線路安裝組件以能夠相對(duì)于3箱體隨意轉(zhuǎn)動(dòng)的方式安裝在箱體3上。通過(guò)線路安裝組件，可以防止熒光輸出光纖21、激光輸入光纖11和其它供電線8彼此之間相互纏繞，為活體樣本的自由活動(dòng)提供有利條件。

在一個(gè)實(shí)施例中，數(shù)據(jù)收集組件7提供探測(cè)光路，該探測(cè)光路上包括同軸布置的光電倍增管71、聚光器72、發(fā)射濾光片73、短通濾光片74和收集透鏡75，其中：光電倍增管71用于將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)后輸出。聚光器72用于匯聚由熒光輸出光纖21傳輸?shù)臒晒庑盘?hào)。發(fā)射濾光片73用于濾掉波長(zhǎng)為920納米的激光。短通濾光片74用于過(guò)濾掉除信號(hào)光以外的雜散光。熒光輸出光纖21與收集透鏡75共軸，且熒光輸出光纖21位于收集透鏡75的焦平面上，收集透鏡75用于將所述熒光信號(hào)更充分的收集到光電倍增管71中。

優(yōu)選地，所述線路安裝組件包括電動(dòng)旋轉(zhuǎn)頭6和支架10，其中：電動(dòng)旋轉(zhuǎn)頭6貫穿設(shè)置在箱體3的頂部，并且，一端連接外部電源，另一端連接供電線8，使所述外部電源與供電線8能夠電連接。支架10罩設(shè)在位于箱體3頂部的電動(dòng)旋轉(zhuǎn)頭6外，激光輸入光纖11和熒光輸出光纖21穿過(guò)電動(dòng)旋轉(zhuǎn)頭6的外殼，熒光輸出光纖21與數(shù)據(jù)收集組件7中的收集透鏡75光信號(hào)連接。熒光輸出光纖21通過(guò)軸承9連接到數(shù)據(jù)收集組件7，這樣，電動(dòng)旋轉(zhuǎn)頭6和軸承9允許熒光輸出光纖21和供電線8進(jìn)行獨(dú)立地旋轉(zhuǎn)，同時(shí)保持探測(cè)光路不變，這種設(shè)計(jì)防止了活體樣本自由探索其環(huán)境時(shí)造成的連接線的纏繞，極大地提高了微型探頭2的穩(wěn)定性，即使活體樣本進(jìn)行強(qiáng)烈的身體活動(dòng)也不會(huì)有影響，以使動(dòng)物在自由探索期間線的扭曲和纏繞最小化。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述自由移動(dòng)活體樣本行為成像裝置還包括供電線8，為微機(jī)電掃描儀22供電。供電線8通過(guò)所述線路安裝組件以能夠相對(duì)于所述箱體隨意轉(zhuǎn)動(dòng)的方式安裝在所述箱體上，從而保證供電線8能夠正常供電，也能夠避免供電線8與激光輸入光纖11和熒光輸出光纖21彼此相互纏繞，以使動(dòng)物在自由探索期間線的扭曲和纏繞最小化。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述自由移動(dòng)活體樣本行為成像裝置還包括多個(gè)相機(jī)4，相機(jī)4都安裝在箱體3的內(nèi)壁上，比如圖2中示出的安裝在箱體3的側(cè)面以及頂面，分別以不同的角度拍攝和記錄活體樣本的自由移動(dòng)過(guò)程的行為。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述自由移動(dòng)活體樣本行為成像裝置還包括照明燈5，照明燈5安裝在箱體3的內(nèi)壁上，用于照明箱體3的內(nèi)腔。

如圖12a-12e所示，圖12a是v-1皮質(zhì)l2/3神經(jīng)元的50張平均firm-tpm(本發(fā)明的微型雙光子顯微成像裝置)圖像，圖像中圈出了1、2、3個(gè)樹(shù)突。圖12b是活體樣本在競(jìng)技場(chǎng)內(nèi)的二維軌跡(持續(xù)時(shí)間：100秒)，從其中頂部的相機(jī)捕獲的視頻記錄計(jì)算軌跡，并且移動(dòng)速度用顏色編碼。圖12c和圖12d分別是在頭部固定(12c)和自由移動(dòng)條件(12d)下從三個(gè)樹(shù)突(在圖12a中圈出)的ca²⁺信號(hào)的時(shí)程(持續(xù)時(shí)間：100s)，活體樣本速度的時(shí)間相關(guān)變化也顯示在底部。圖12e是在頭部固定和自由移動(dòng)條件下所有樹(shù)突狀ca²⁺瞬變的平均頻率；數(shù)據(jù)表示為平均值±s.e.m.，n＝15個(gè)樹(shù)突。***p<0.001，配對(duì)t檢驗(yàn)。由以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)活體樣本在黑暗中自由地探索時(shí)(軌跡顯示在圖12a-12e中)，其視覺(jué)皮層的神經(jīng)元樹(shù)突活性相對(duì)于活體樣本頭部固定的情況有顯著的增加(圖12a-12e)。

如圖13a-13c所示，圖13a是在三種不同的行為范例內(nèi)的視覺(jué)皮層中成像神經(jīng)元活動(dòng)：懸尾試驗(yàn)、跳臺(tái)、社交行為。最左側(cè)第一列圖像：通過(guò)在行為裝置側(cè)面上的側(cè)面的兩個(gè)相機(jī)拍攝的活體樣本參與不同行為的快照；中間第二列圖像：gcamp6f標(biāo)記的神經(jīng)元胞體，樹(shù)突和樹(shù)突棘的firm-tpm成像；右側(cè)第三列圖像：相應(yīng)的鈣活動(dòng)分布圖(持續(xù)時(shí)間：100s)。最右側(cè)第四列圖像：firm-tpm圖像中指示的三個(gè)roi的ca²⁺信號(hào)(持續(xù)時(shí)間：50秒)。圖13b是firm-tpm成像的短期和長(zhǎng)期穩(wěn)定性，圖13b左側(cè)曲線是基于每個(gè)行為范例中

這個(gè)結(jié)果與多位點(diǎn)電學(xué)探針記錄到的運(yùn)動(dòng)可以增強(qiáng)動(dòng)物視覺(jué)皮層神經(jīng)元活動(dòng)一致。接下來(lái)，為了證明firm-tpm的魯棒性，本發(fā)明在活體樣本的初級(jí)視覺(jué)皮層中的130×130μm²的fov上進(jìn)行40hz的成像來(lái)觀察其神經(jīng)元的活動(dòng)，該活體樣本在三種行為范例中依次測(cè)試，包括懸尾實(shí)驗(yàn)、跳臺(tái)和社交行為。這些范例都不能在頭部固定的實(shí)驗(yàn)策略中實(shí)現(xiàn)，整個(gè)測(cè)試過(guò)程持續(xù)約4小時(shí)。值得注意的是，即使當(dāng)活體樣本在懸尾試驗(yàn)中強(qiáng)烈掙扎，從高臺(tái)跳下或與其同胞交流時(shí)，來(lái)自不同胞體、樹(shù)突和樹(shù)突棘的活性仍然可以被穩(wěn)定的觀測(cè)。不同的行為范式似乎與同一v1皮層的不同區(qū)域的神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)聯(lián)(圖13a)。

為了量化本發(fā)明提供的微型雙光子顯微鏡的短期和長(zhǎng)期穩(wěn)定性，本發(fā)明通過(guò)逐幀互相關(guān)和視場(chǎng)的一段時(shí)間到另一段時(shí)間的漂移來(lái)分析橫向位移(圖13b)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在2000連續(xù)幀內(nèi)，幀與幀之間的平均位移在跳臺(tái)行為范例中(0.19±0.09μm；75％在0.24μm以下)是最大的，但仍然小于像素大小的一半。在整個(gè)4h測(cè)試中，firm-tpm的fov的整體漂移<10μm，大多數(shù)漂移發(fā)生在懸尾實(shí)驗(yàn)中劇烈運(yùn)動(dòng)的第一個(gè)小時(shí)。值得注意的是，較高的圖像采集速度降低了幀內(nèi)的錯(cuò)位，這種水平的運(yùn)動(dòng)偽影并不妨礙本發(fā)明對(duì)樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)和功能的成像。為了演示本發(fā)明提供的微型雙光子顯微鏡對(duì)單突觸活動(dòng)的成像能力，通過(guò)跟蹤樹(shù)突棘及其父樹(shù)突軸上的ca²⁺活動(dòng)，本發(fā)明進(jìn)一步分析了整體和局部活動(dòng)之間的關(guān)系?？偠灾?，本發(fā)明提供的微型雙光子顯微鏡能夠在自然生理環(huán)境中對(duì)自由活動(dòng)的動(dòng)物的樹(shù)突和樹(shù)突棘活動(dòng)進(jìn)行穩(wěn)定的觀測(cè)。

本發(fā)明還提供一種微型雙光子顯微成像方法，所述微型雙光子顯微成像方法包括：

步驟1，選取待成像區(qū)域：固定活體樣本，并利用臺(tái)式tpm在所述活體樣本上選取待成像區(qū)域。在步驟1中，需要采用如圖6示出的成像平臺(tái)，并在臺(tái)式tpm模式下，也就是說(shuō)利用臺(tái)式tmp在活體樣本上選取待成像區(qū)域，具體操作是：利用身體固定器固定活體樣本，以通過(guò)臺(tái)式tpm來(lái)確認(rèn)活體樣本頭部的病毒感染的區(qū)域。

步驟2，采集熒光信號(hào)：將連接有激光輸入光纖的微型探頭安裝在所述活體樣本上，釋放活體樣本，以檢測(cè)步驟1中選取的待成像區(qū)域輸出的熒光信號(hào)，完成所述活體樣本內(nèi)部的組織平面的成像。步驟2具體操作如下：

首先，將本發(fā)明提供的微型探頭2粘合到活體樣本頭部顱骨的支架上，該支架在開(kāi)顱手術(shù)準(zhǔn)備期間已經(jīng)固定在活體樣本頭部的顱骨上，再用牙科水泥將微型探頭2加固到活體樣本頭部顱骨的支架上。

然后，將1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖覆蓋到暴露的腦組織區(qū)域。該方法顯著的抑制了探頭和大腦之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)。為了實(shí)現(xiàn)隨機(jī)存取中對(duì)大量神經(jīng)元的染色，標(biāo)記神經(jīng)元的過(guò)程為：本發(fā)明用人工腦脊液(sigma-aldrich，中國(guó)上海；mm，125nacl，4.5kcl，26nahco3，1.25nah2po4，2cacl2，1mgcl2，20葡萄糖，當(dāng)用95％o2和5％co2充盈時(shí)ph為7.4)覆蓋暴露腦區(qū)。將50微克cal-520am(aatbioquest.ca，usa)溶解于4μldmso(含20％pluronicf-127)中，并用人工稀釋液(mm，150nacl，2.5kcl，10hepes,ph7.432)稀釋至500μm。使用2-3mω電阻的硼硅酸鹽移液管，通過(guò)施加壓力脈沖(1分鐘，400毫巴)將ca²⁺染料注射到初級(jí)視覺(jué)皮層的層2/3中。1小時(shí)后，將sr-101滴加到皮質(zhì)表面以鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。將活體樣本頭部固定，并使用firm-tpm以隨機(jī)存取模式進(jìn)行成像。

最后，將活體樣本從固定器上釋放，并放入上述實(shí)施例的小動(dòng)物成像系統(tǒng)的箱體3中，利用微型探頭2對(duì)活體樣本進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)測(cè)試或滑落實(shí)驗(yàn)測(cè)試(圓柱形平，5cm²，5cm高)和社交行為(30×30cm²方形活動(dòng)場(chǎng)地)。

步驟3，處理所述熒光信號(hào)，獲取活體樣本自由活動(dòng)的三維圖像。

在上述步驟之前,還包括如下步驟4,制作活體樣本，具體包括：

步驟41，選取活體樣本:在實(shí)驗(yàn)中使用c57bl/6野生型和thy-1-gfp轉(zhuǎn)基因活體樣本(出生后8-16周)。所有程序均符合北京大學(xué)動(dòng)物使用與護(hù)理委員會(huì)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理評(píng)估和認(rèn)證協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，包括動(dòng)物育種和實(shí)驗(yàn)操作。將thy-1-gfp轉(zhuǎn)基因活體樣本麻醉并用0.9％鹽水灌注，然后用4％多聚甲醛灌注，并取出腦。在4℃的4％多聚甲醛的pbs中固定過(guò)夜。

步驟42，用于活體腦皮質(zhì)成像的切骨術(shù)：在這些實(shí)驗(yàn)中使用c57bl/6野生型活體樣本。簡(jiǎn)言之，通過(guò)吸入純o2中的1-1.5％異氟烷將活體樣本麻醉，并置于立體定位框架(68025，rwd，中國(guó)深圳)上。同時(shí)，使用加溫板(37.5-38℃)保持活體樣本的正常溫度。在局部施用xylocaine并去除皮膚和肌肉之后，在目標(biāo)皮層的中部用高速顱鉆(尖端直徑0.5mm)鉆開(kāi)小方形頭窗(0.5×0.5mm²)。gcamp-6f用重組aav在鈣調(diào)素依賴(lài)性激酶ii(camkii)啟動(dòng)子(血清型2/9；>2×10¹³個(gè)基因組拷貝/ml，由賓夕法尼亞大學(xué)基因治療程序載體核心產(chǎn)生)下表達(dá)。使用注射器(nanoliter2010，worldprecisioninstruments，sarasota，usa)和玻璃微電極，在20分鐘內(nèi)將總量為0.5-0.8μl的aav緩慢注射到活體樣本的靶向皮質(zhì)的2/3層(深度為130-400μm)。在表達(dá)3周后，用異氟烷麻醉活體樣本，用氰基丙烯酸膠將自制的支架連接到顱骨上并用牙齒水泥加固。用顱鉆在目標(biāo)皮質(zhì)上鉆出小的方形頭窗(2.5×2.5mm²)。小心地去除硬腦膜，將小型玻璃蓋玻片(3.5×2.5mm²)放在開(kāi)顱上?；謴?fù)一周后，然后每天訓(xùn)練活體樣本適應(yīng)頭部固定30分鐘，持續(xù)3天。在清醒的活體樣本適應(yīng)之后，操作步驟1和步驟2。

最后需要指出的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。