基于MnTiO3@Pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)，尤其涉及一種基于mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器、構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、內(nèi)毒素是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的成分，它由脂多糖a和一個(gè)糖鏈組成。細(xì)菌死亡后，將內(nèi)毒素釋放到血漿中，引發(fā)毒素效應(yīng)，例如發(fā)熱、感染性休克、多器官功能衰竭，甚至死亡。內(nèi)毒素的污染危害著人類的健康，尤其是在血液制品、可注射藥物、醫(yī)療敷料和可植入設(shè)備中的污染。目前，內(nèi)毒素的檢測方法主要有鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)(lal試驗(yàn))和生物傳感器，其中l(wèi)al試驗(yàn)基于酶反應(yīng)，容易受蛋白酶的干擾。

2、適配體作為一種單核苷酸鏈，能夠特異性的識別分子生物標(biāo)志物，相較于抗體，適配體具有良好的特異性、親和力和穩(wěn)定性。近些年，納米材料在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到研究者的關(guān)注。mntio3是一種三元納米碟，它作為催化劑參與過氧化氫介導(dǎo)的氧化降解，使亞甲基藍(lán)從藍(lán)色變?yōu)闊o色或顏色變淺。鈀納米粒(pd)一定程度也能催化過氧化氫的反應(yīng)，還可以通過pd-nh2化學(xué)鍵結(jié)合核苷酸單鏈。

3、通過上述分析，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題及缺陷為：

4、(1)傳統(tǒng)的檢測方法在靈敏度和特異性方面存在局限，特別是在復(fù)雜的樣本如血液制品中。

5、(2)lal試驗(yàn)容易受到外部條件如蛋白酶的干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。lal試驗(yàn)需要特定的環(huán)境和條件，使得操作復(fù)雜并增加了成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種基于mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器、構(gòu)建方法及應(yīng)用。

2、在本發(fā)明設(shè)計(jì)中，我們構(gòu)建了一種基于mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器，用于定量和定性檢測內(nèi)毒素。在過氧化氫溶液的存在下，mntio3@pd納米粒能使亞甲基藍(lán)從藍(lán)色變?yōu)闊o色或顏色變淺，該變化可以通過肉眼初步定性，還可以通過紫外分光光度計(jì)測定吸光度進(jìn)行定量檢測。若待測血漿中有內(nèi)毒素，檢測液中的適配體(apt)會與其結(jié)合，使溶液中形成的“磁珠修飾的捕獲探針(mb-cp)-apt-mntio3@pd納米粒修飾的信號探針(mntio3@pd納米粒-sp)”三明治夾心結(jié)構(gòu)變少，最終導(dǎo)致吸光度的差值越大。

3、基于mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器的構(gòu)建方法，所述基于mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器的構(gòu)建方法包括以下步驟：

4、s1，利用一步水熱法合成mntio3納米碟，然后將pd納米粒還原到納米碟上以合成mntio3@pd納米粒；

5、s2，根據(jù)內(nèi)毒素適配體的核苷酸序列設(shè)計(jì)捕獲探針和信號探針；

6、s3，合成捕獲探針：磁珠修飾的氨基化核苷酸單鏈；

7、s4，利用ssdna與mntio3@pd納米粒合成信號探針；

8、s5，利用捕獲探針和信號探針構(gòu)建比色適配體傳感器。

9、進(jìn)一步，s1中合成mntio3@pd納米粒的具體步驟為：

10、s11，配制溶液a：將0.394ml濃度為1.25mmol的異丙醇鈦逐滴加入16ml乙二醇中，劇烈攪拌混勻形成混合溶液；

11、s12，配制溶液b：將247.8mg?mncl2·4h2o溶于4ml乙二胺；

12、s13，將溶液a倒入溶液b，稍作攪拌混勻后，向混合液中逐滴加入h2o；

13、s14，將混合液加入不銹鋼高壓釜中，密封后將高壓釜放進(jìn)馬弗爐，200度高溫加熱12小時(shí)；

14、s15，待高壓釜溫度降至室溫，將液體轉(zhuǎn)移至離心管中離心，再用無水乙醇和超純水清洗三次，將所得黃色沉淀用干燥箱烘干。

15、s16，向1mg/ml?mntio3納米碟水溶液中加入10mm?na2pdcl4(1ml)，然后向混合溶液中快速加入抗壞血酸，室溫環(huán)境下攪拌3h，再離心清洗。最后重懸于pbs緩沖液中，置于4度冰箱待用。

16、進(jìn)一步，s2中內(nèi)毒素適配體的核苷酸序列為：5’-tttttttttcttctgcccgcctccttcctagccggatcgcgctggccagat?gatataaagggtcagccccccaggagacgagataggcggacact-3’；捕獲探針的核苷酸序列為：5’-aaaaagtgtccgcctatctcgtctcctggggggctgaccctttatatcatc-3’，信號探針的核苷酸序列為：5’-tggccagcgcgatccggctaggaaggaggcgggcagaagaaaaaaaaagggg-3’。

17、進(jìn)一步，s4中合成信號探針的具體步驟為：

18、s41，將等體積的ssdna與mntio3@pd納米粒置于4度冰箱里輕微攪拌過夜，離心后用pbs緩沖液清洗3次；

19、s42，加入1％bsa以封閉其非特異性結(jié)合位點(diǎn)，離心后用pbs緩沖液清洗3次；

20、s43，重懸于pbs緩沖液中，置于4度冰箱里待使用。

21、進(jìn)一步，s5中構(gòu)建比色適配體傳感器的具體步驟為：

22、s51，向ep管中加入定量適配體和靶標(biāo)，室溫下反應(yīng)2h，然后將上述反應(yīng)液加入預(yù)先準(zhǔn)備好的檢測試劑中(含有mb-cp和mntio3@pd-sp),室溫下反應(yīng)2h；

23、s52，上述反應(yīng)結(jié)束后，使用磁力架去除未形成三明治夾心結(jié)構(gòu)的組分，并用pbs緩沖液清洗三次，清洗第三次后沉淀物保留；

24、s53，向上述ep管中依次加入0.1mg/ml亞甲基藍(lán)和h2o2；

25、進(jìn)一步，在構(gòu)建比色適配體傳感器的過程中優(yōu)化反應(yīng)條件，對探針和靶標(biāo)的反應(yīng)時(shí)間和溫度，過氧化氫濃度，過氧化氫和亞甲基藍(lán)的體積比，pbs緩沖液的ph進(jìn)行優(yōu)化。

26、本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器的構(gòu)建系統(tǒng)，包括：

27、mntio3@pd納米粒組件：pd納米粒還原并附著在mntio3納米碟上形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)；

28、適配體探針組件：捕獲探針，由磁珠修飾的氨基化核苷酸單鏈構(gòu)成，其設(shè)計(jì)依據(jù)目標(biāo)內(nèi)毒素適配體的核苷酸序列；信號探針，由與mntio3@pd納米粒結(jié)合的單鏈dna構(gòu)成；

29、檢測與信號轉(zhuǎn)換裝置：用于捕捉和分離帶有目標(biāo)分析物的捕獲探針，檢測經(jīng)由信號探針引起的顏色變化，從而實(shí)現(xiàn)對特定內(nèi)毒素的定量或定性分析；

30、控制與分析單元：接收檢測信號，并對信號進(jìn)行處理和分析；提供用戶界面，顯示檢測結(jié)果并允許用戶輸入?yún)?shù)或控制測試過程。

31、本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器。

32、本發(fā)明的另一目的在于提供所述基于mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器在檢測血漿中的內(nèi)毒素的應(yīng)用。

33、進(jìn)一步，利用基于mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器對不同濃度的靶標(biāo)進(jìn)行檢測，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

34、結(jié)合上述的技術(shù)方案和解決的技術(shù)問題，本發(fā)明所要保護(hù)的技術(shù)方案所具備的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：

35、第一，針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題以及解決該問題的難度，解決問題之后帶來的一些具備創(chuàng)造性的技術(shù)效果。具體描述如下：

36、本發(fā)明利用mntio3的特性，結(jié)合適配體的特異識別功能，設(shè)計(jì)了一種比色適配體傳感器，用于檢測血漿中的內(nèi)毒素。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的適配體傳感器為內(nèi)毒素的檢測提供一種低成本、高靈敏、快速的方法，并且能夠同時(shí)進(jìn)行定量和定性的檢測。

37、第二，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的適配體傳感器，基于mntio3@pd納米粒在過氧化氫的存在能使亞甲基藍(lán)由藍(lán)色變?yōu)闊o色或顏色變淺的原理，相較于酶催化的比色反應(yīng)(例如辣根過氧化物酶)，mntio3@pd納米粒是一種性質(zhì)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的納米材料，其合成簡單、不易被分解、不易受溫度環(huán)境的影響。本發(fā)明所具備的優(yōu)勢為：不僅能在幾分鐘內(nèi)快速的通過肉眼判斷顏色變化來定性檢測內(nèi)毒素，還能定量檢測內(nèi)毒素的濃度；利用該適配體傳感器檢測內(nèi)毒素不需要昂貴的儀器和專業(yè)技術(shù)人員，方法簡單、易操作。

38、第三，本發(fā)明的技術(shù)方案轉(zhuǎn)化后的預(yù)期收益和商業(yè)價(jià)值為：

39、高靈敏度和特異性檢測：通過利用mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器，能夠?qū)崿F(xiàn)對血漿中內(nèi)毒素的高靈敏度和特異性檢測。這意味著在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，可以更準(zhǔn)確地檢測到細(xì)菌死亡釋放的內(nèi)毒素，避免了誤差和干擾，提高了檢測結(jié)果的可信度。

40、快速、低成本、操作簡便：與傳統(tǒng)的檢測方法相比，本發(fā)明的傳感器具有快速、低成本和操作簡便的優(yōu)勢。這使得在醫(yī)療實(shí)踐中能夠更加高效地進(jìn)行內(nèi)毒素檢測，減少了實(shí)驗(yàn)室操作的復(fù)雜性和成本，提高了檢測的實(shí)用性。

41、應(yīng)用于多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：內(nèi)毒素的檢測在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，特別是在血液制品、可注射藥物、醫(yī)療敷料和可植入設(shè)備等方面。因此，該技術(shù)方案有望在多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中找到應(yīng)用，拓展了其商業(yè)化的可能性。

42、抗酶活性的提高：傳統(tǒng)的內(nèi)毒素檢測方法中，如鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)(lal試驗(yàn))，是基于酶反應(yīng)的，容易受蛋白酶的干擾。而本發(fā)明采用基于mntio3@pd納米粒比色的磁珠適配體傳感器，結(jié)合了適配體的特異性和mntio3納米碟的催化特性，可能提高了抗蛋白酶的能力，從而提高了檢測的可靠性。